Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Il termine "biopsia liquida" è stato definito nel 2010¹ come la presenza di molecole (ad esempio, proteine, acido desossiribonucleico (DNA), acido ribonucleico (RNA)), cellule o vescicole extracellulari (ad esempio, esosomi) nel sangue e in altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario. L'uso di campioni di biopsia liquida ha rivoluzionato la ricerca oncologica traslazionale in quanto le biopsie tissutali, limitate a una particolare regione in un particolare momento, possono perdere cloni rilevanti a causa dell'eterogeneità del tumore. Inoltre, la biopsia liquida svolge un ruolo rilevante nei tipi di tumore in cui il tessuto primario è scarso o non accessibile, in quanto può evitare una biopsia invasiva, riducendo i costi e i rischi per i pazienti. Inoltre, le caratteristiche molecolari del tumore sono in continua evoluzione principalmente a causa della pressione della terapia, e i campioni di biopsia liquida possono catturare la dinamica clonale del tumore in quanto possono essere prelevati longitudinalmente, in diversi momenti clinici e terapeutici della malattia come al basale, al trattamento, alla migliore risposta e alla progressione della malattia o anche prima. Il concetto di "biopsia liquida in tempo reale" significa che i cambiamenti dinamici nel tumore possono essere monitorati in tempo reale, consentendo così la medicina di precisione in questa malattia. La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in clinica, tra cui lo screening e la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio in tempo reale della malattia, il rilevamento della malattia residua minima, lo studio dei meccanismi di resistenza al trattamento e la stratificazione dei pazienti a livello terapeutico¹. La diagnosi precoce della recidiva e della progressione della malattia è un'esigenza clinica insoddisfatta in molti tipi di tumore ed è un fattore chiave per aumentare la sopravvivenza e la qualità della vita dei malati di cancro. Le modalità di imaging di routine e i marcatori tumorali solubili possono non avere la sensibilità e / o la specificità richieste per questo compito. Pertanto, nuovi marcatori predittivi sono urgentemente necessari nella clinica, come quelli basati su acidi nucleici liberi circolanti.

I tipi di campioni utilizzati per gli studi di biopsia liquida includono, ma non sono limitati a sangue, urina, saliva e campioni di feci. Altri campioni specifici del tumore possono essere aspirati cellulari, liquido cerebrospinale, liquido pleurico, liquido di cisti e ascite, espettorato e succo pancreatico². I primi liquidi possono contenere diversi tipi di materiali derivati dal cancro, cellule tumorali circolanti (CTC) o frammenti come esosomi e DNA tumorale circolante privo di cellule (ctDNA). Gli acidi nucleici possono essere incapsulati in vescicole extracellulari (EV) o rilasciati nei fluidi corporei a causa della morte e del danno cellulare. Il DNA libero circolante (cfDNA) viene rilasciato principalmente nel flusso sanguigno da cellule apoptotiche o necrotiche ed è presente in tutti gli individui, mostrando livelli aumentati nelle malattie infiammatorie o oncologiche³. Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari (~ 30-150 nm) secrete da cellule contenenti acidi nucleici, proteine e lipidi. Queste vescicole fanno parte della rete di comunicazione intercellulare e si trovano comunemente in molti tipi di fluidi corporei². Gli acidi nucleici racchiusi all'interno dei veicoli elettrici sono protetti dall'ambiente ostile all'interno dei fluidi corporei, fornendo così un modo più robusto per studiare queste molecole nell'ambiente della biopsia liquida.

Nel complesso, i livelli di acidi nucleici circolanti nei campioni di biopsia liquida sono molto bassi e quindi sono necessari metodi sensibili per il rilevamento, come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione (NGS). La gestione preanalitica del campione è fondamentale per prevenire la lisi delle cellule del sangue e il rilascio di DNA intatto, causando la contaminazione del cfDNA con il DNA genomico. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante l'estrazione dei campioni per evitare la presenza di inibitori dei metodi di analisi basati su enzimi.

Qui presentiamo un metodo standardizzato per la raccolta e lo stoccaggio di campioni di plasma e siero, che è un primo passo cruciale per le applicazioni a valle basate sulla biopsia liquida, comprese le analisi degli acidi nucleici circolanti.

La previa approvazione etica è stata ottenuta dai centri partecipanti prima dell'estrazione dei campioni di sangue. I seguenti protocolli per l'isolamento del siero e del plasma sono stati eseguiti in conformità con i principi etici per la ricerca biomedica.

NOTA: le considerazioni preliminari prima di iniziare il protocollo sono fornite qui. È necessaria una previa approvazione etica per l'uso di campioni umani nella ricerca biomedica, con il corrispondente consenso informato. Per gestire i campioni di sangue è necessario un armadietto di biosicurezza di classe II. Un cappotto da laboratorio, guanti protettivi e occhiali devono essere indossati durante tutta la procedura per evitare l'infezione da agenti patogeni trasmessi dal sangue. È richiesto un minimo di 30 minuti per l'elaborazione dei campioni di siero. Dopo l'estrazione del sangue in tubi senza anticoagulante, mantenere a temperatura ambiente (RT) per 30-45 minuti per consentire la formazione di coaguli. È richiesto un minimo di 40 minuti per la preparazione del plasma e i campioni devono essere elaborati entro 4 ore dal momento dell'estrazione quando si utilizzano tubi di acido tetra-acetico (EDTA) di etilendiammina o entro 24-48 ore se si utilizzano tubi di raccolta stabilizzanti cellulari o specifici tubi di raccolta del DNA privi di cellule. Tuttavia, secondo alcuni produttori, i campioni sono stabili fino a 2 settimane in questi tubi specializzati. È importante verificare l'emolisi, che darà al plasma o alla frazione sierica un aspetto rossastro. Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi per gli esempi emolizzati nella discussione.

1. Preparazione del siero per studi di biopsia liquida

NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 30 minuti (Figura 1).

1. Estrarre 4-10 ml di sangue in provette prive di anticoagulante (cappuccio rosso o rosso/grigio-nero) e mantenere a RT per 30-45 min. Elaborare questi campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
2. Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'identificazione del soggetto (ID) in un database di campioni opportunamente progettato.
3. Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo contenente sangue fresco a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima pausa applicata.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga; la fase superiore del surnatante sierico apparirà chiara e giallastra (Figura 2). Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e registrare la presenza di emolisi quando appropriato.
5. In un armadio di biosicurezza di classe II, trasferire il siero in tubi di raccolta come aliquote da 250 μL.
   NOTA: Il volume delle aliquote deve essere adeguato alle esigenze dello studio.
6. Congelare immediatamente il siero in posizione verticale in una scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione.
7. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.

2. Preparazione del plasma per studi di biopsia liquida

NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 40 minuti (Figura 4).

1. Estratto 4-10 ml di sangue in provette contenenti acido tetra-acetico etilendiammina (EDTA). Elaborare i campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
2. Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'ID soggetto in un database di campioni progettato in modo appropriato.
3. Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima rottura applicata.
   NOTA: fare riferimento alle istruzioni del produttore quando si utilizzano altri tubi di raccolta.
4. Dopo la centrifugazione, il surnatante plasmatico apparirà chiaro e giallastro. Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e trasferire il plasma (surnatante) in un tubo centrifugo da 15 ml senza disturbare lo strato cellulare utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta del filtro). Lasciare un piccolo volume residuo di plasma sopra lo strato cellulare (circa 5 mm).
5. Se si osserva emolisi, scartare il campione per ulteriori analisi. (Figura 5). Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi nella Discussione per valutare l'emolisi.
6. Centrifugare il plasma in un tubo centrifugo da 15 mL a RT (15 °C-25 °C) per 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Eseguire questo passaggio per rimuovere eventuali cellule del sangue intatte residue trasportate dalla prima fase di centrifugazione.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga e trasferire 1-4 mL di plasma in flaconcini criogenici in polipropilene da 1-4 mL utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta filtrante). Un volume residuo di plasma (circa 0,3 ml o 7 mm di altezza) deve essere lasciato sul fondo del tubo per evitare di contaminare il plasma con cellule del sangue (Figura 5).
8. Congelare immediatamente il plasma in posizione verticale nella scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.
9. Raccogliere lo strato cellulare (buffy coat) utilizzando un P1000 e la punta filtrata e trasferirlo in un tubo da 2 ml. Congelare e conservare immediatamente a -80 °C.

Dopo la centrifugazione delle provette del sangue senza anticoagulante, la fase superiore appare di un giallo pallido e corrisponde alla frazione sierica (Figura 2). Questa frazione viene accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.

L'emolisi può essere presente sia nel plasma che nella frazione sierica e la fase superiore avrà un aspetto rossastro, che indica la presenza e il grado di emolisi (Figura 3).

Dopo la centrifugazione dei tubi EDTA, saranno evidenti diverse fasi o strati; la fase superiore (giallo pallido) è la frazione plasmatica, che rappresenta il 55% del volume totale del sangue; la sottile interfaccia bianco-grigiastra è lo strato di mantello buffy che contiene globuli bianchi e piastrine e rappresenta <1% del volume totale del sangue; la fase inferiore (colore rosso) contiene globuli rossi, che rappresentano il 45% del volume totale del sangue). Aspirare 1 cm sopra lo strato leucocitario e assicurarsi che lo strato cellulare non sia disturbato per ridurre la contaminazione del plasma con le cellule del sangue (Figura 5). Questa frazione deve essere accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.

La concentrazione e l'integrità del cfDNA estratto da campioni di plasma devono essere valutate utilizzando metodi basati sull'elettroforesi. cfDNA è stato estratto utilizzando un kit basato su colonne disponibile in commercio. La quantificazione è stata eseguita utilizzando un kit disponibile in commercio a base di gel specifico per applicazioni cfDNA (Table of Materials). La Figura 6A mostra un esempio di estrazione di cfDNA di alta qualità che può essere utilizzato per applicazioni a valle. Mentre, la Figura 6B mostra un esempio di un campione inadatto con un alto livello di contaminazione genomica.

Figura 1: Preparazione del siero per studi di biopsia liquida. Viene mostrato uno schema del processo di preparazione del siero, dalla centrifugazione del campione allo stoccaggio delle aliquote. Fase 1: Campione di sangue in un tubo senza anticoagulante per l'isolamento del siero. Fase 2: Centrifugare il tubo sanguigno per ottenere il siero entro 4 ore dall'estrazione. Fase 3: Rimuovere la fase superiore del surnatante sierico per la successiva conservazione. Passaggio 4: congelare il tubo di siero in posizione verticale a -80 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Campioni di sangue raccolti in provette senza anticoagulante dopo centrifugazione. La fase superiore corrisponde alla frazione sierica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Un esempio di campione emolizzato dopo centrifugazione. La fase superiore corrispondente alla frazione plasmatica/sierica appare rossa a causa dell'emolisi. Idealmente, questi campioni dovrebbero essere scartati, o almeno la presenza di emolisi nel campione dovrebbe essere registrata, in quanto ciò potrebbe influire su alcune applicazioni a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Preparazione al plasma per studi di biopsia liquida. Viene mostrato uno schema del processo di preparazione del siero, dalla centrifugazione del campione allo stoccaggio delle aliquote e alla raccolta del buffy coat. Fase 1: Campione di sangue in un tubo contenente acido tetra-acetico etilendiammina (EDTA) per l'isolamento del plasma. Fase 2: Centrifugare il tubo sanguigno per ottenere il plasma entro 4 ore dall'estrazione. Fase 3: Trasferire il surnatante al plasma in un tubo centrifugo da 15 ml senza disturbare lo strato cellulare. Fase 4: Centrifugare il plasma per rimuovere eventuali cellule del sangue trasportate dalla prima fase di centrifugazione. Fase 5: Trasferire il plasma in flaconcini criogenici e congelare il tubo di plasma in posizione verticale a -80 °C. Passo 6: Raccogliere lo strato cellulare (buffy coat) e conservare a -80 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Campioni di sangue EDTA dopo centrifugazione. Tre strati visibili sono visibili dopo la centrifugazione dei tubi contenenti sangue fresco. La fase superiore corrisponde alla frazione plasmatica, la sottile interfaccia bianco-grigiastra corrisponde al mantello buffy e contiene globuli bianchi e piastrine, e la fase inferiore contiene globuli rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi basata sull'elettroforesi del cfDNA isolato dal plasma. (A) Un esempio di esperimento ottimale. (B) Un esempio di esperimento non ottimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Beatriz Bellosillo (BB): BB ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer e BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline e Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM ed ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly e Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) riferisce di aver ricevuto sovvenzioni di ricerca relative a questo studio da Novartis e sovvenzioni di ricerca non correlate a questo studio da AstraZeneca e Beigene. Gli altri autori non hanno divulgazioni in merito al manoscritto.