Method Article

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

DOI:

10.3791/64135

⸱

September 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle di membrana eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come regolatori fisiologici dell'omeostasi dell'organismo e importanti indicatori di patologie; Nel frattempo, sta emergendo il loro immenso potenziale per stabilire terapie di malattia accessibili e controllabili. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono rilasciare grandi quantità di EV in coltura, che hanno dimostrato di promettere di avviare un'efficace rigenerazione dei tessuti e facilitare ampie applicazioni terapeutiche con una buona scalabilità e riproducibilità. C'è una crescente domanda di protocolli semplici ed efficaci per la raccolta e l'applicazione di MSC-EV. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato basato sulla centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentativi da MSC umane in coltura, esosomi e microvescicole per ulteriori applicazioni. L'adattabilità di questo metodo è dimostrata per una serie di approcci a valle, come l'etichettatura, il trapianto locale e l'iniezione sistemica. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili di MSC-EV nella ricerca traslazionale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali sono cellule pluripotenti indifferenziate con capacità di auto-rinnovamento e potenziale traslazionale1. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono facilmente isolate, coltivate, espanse e purificate in laboratorio, il che rimane caratteristico delle cellule staminali dopo più passaggi. Negli ultimi anni, prove crescenti hanno sostenuto l'opinione che le MSC agiscono in modo paracrino nell'uso terapeutico 2,3. Soprattutto la secrezione di vescicole extracellulari (EV) svolge un ruolo cruciale nel mediare le funzioni biologiche delle MSC. Come nanoparticelle membranose eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi di cellule, le EV consistono in sottocategorie denominate esosomi (Exos), microvescicole (MV) e corpi apoptotici ancora più grandi 4,5. Tra questi, Exos è l'EV più studiato con una dimensione di 40-150 nm, che è di origine endosomiale e attivamente secreto in condizioni fisiologiche. Le MV si formano spargendo direttamente dalla superficie della membrana plasmatica cellulare con un diametro di 100-1.000 nm, che sono caratterizzate da un'elevata espressione di fosfatidilserina e dall'espressione di marcatori superficiali di cellule donatrici6. Le EV contengono RNA, proteine e altre molecole bioattive, che hanno funzioni simili alle cellule madri e svolgono un ruolo significativo nella comunicazione cellulare, nella risposta immunitaria e nella riparazione dei danni tissutali7. Le MSC-EV sono state ampiamente studiate come un potente strumento terapeutico privo di cellule nella medicina rigenerativa8.

L'isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici derivati da MSC è un problema comune nel campo della ricerca e dell'applicazione. Allo stato attuale, l'ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, il processo di ultrafiltrazione10, la separazione immunomagnetica 11, il cromatografo ad esclusione molecolare 12 e il chip microfluidico13 sono metodi ampiamente impiegati nell'isolamento e nella purificazione delle EV. Con i vantaggi e gli svantaggi di ciascun approccio, la quantità, la purezza e l'attività dei veicoli elettrici raccolti non possono essere soddisfatti contemporaneamente14,15. Nel presente studio, viene mostrato in dettaglio il protocollo di centrifugazione differenziale di isolamento e caratterizzazione delle EV da MSC in coltura, che ha supportato un uso terapeutico efficiente 16,17,18,19,20. L'adattabilità di questo metodo per una serie di approcci a valle, come la marcatura fluorescente, il trapianto locale e l'iniezione sistemica, è stata ulteriormente esemplificata. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili delle MSC-EV nella ricerca traslazionale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università medica militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati utilizzati topi C57Bl/6 di otto settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC), utilizzate per il presente studio, sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'uso di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare.

1. Coltura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)

  1. Preparare gli accessori e le soluzioni necessarie per il lavoro sperimentale, tra cui pipette, punte per pipette, capsula di Petri da 10 cm, apparecchiature termostatiche (bagno d'acqua), guanti di gomma, alcool al 75%, terreno di coltura (incubato a 37 °C), siero bovino fatale (FBS) e soluzione 100x di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali).
  2. Preparare il mezzo essenziale minimo alfa (α-MEM) disponibile in commercio integrando con 20% FBS e 1% P/S.
    NOTA: Diluire tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento e l'analisi dei veicoli elettrici in acqua filtrata ultrapura realizzata dal sistema di purificazione dell'acqua filtrata ultrapura (vedere Tabella dei materiali).
  3. Recuperare le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC) dall'azoto liquido fondendole in un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Trasferire rapidamente e delicatamente la sospensione di cellule fuse in un tubo da 15 mL con 5 mL di terreno di coltura (fase 1.2). Centrifugare a 4 °C, 500 x g per 5 min.
  5. Rimuovere il surnatante con una pipetta sterile e trattenere il precipitato cellulare. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura nella provetta della centrifuga e risospendere delicatamente le cellule.
  6. Seminare le cellule in una capsula di Petri da 10 cm e aggiungere 8 ml di terreno di coltura per un totale di 10 ml.
  7. Coltura di MSC a 37 °C in 5% di CO2 nell'incubatore cellulare.

2. Centrifugazione differenziale per l'isolamento di Exos e MV

  1. Quando le MSC raggiungono il >90% di confluenza, sostituire il terreno di coltura con α-MEM integrato con il 20% di FBS impoverito di EV e l'1% di P/S per 8 ml di ogni piatto.
    NOTA: Centrifugare FBS a 4 °C, 1,50.000 x g durante la notte per rimuovere EV e altre impurità.
  2. Dopo 48 ore di coltura, raccogliere il terreno di coltura (fase 2.1) in provette da centrifuga da 50 ml.
  3. Centrifugare il terreno di coltura MSC a 4 °C, 800 x g per 10 min.
  4. Rimuovere i frammenti cellulari e i detriti cellulari trasferendo il surnatante in tubi conici puliti da 1,5 ml.
    NOTA: L'utilizzo di tubi conici da 1,5 mL è necessario per aumentare la resa EV.
  5. Centrifugare il surnatante a 4 °C, 16.000 x g per 30 min. Il pellet è MV. MV da ogni piatto di cellule sono stati risospesi con 50 μL di PBS.
  6. Trasferire il surnatante ottenuto per centrifugazione al punto 2.5 mediante pipetta in provette da ultracentrifuga pulita. Centrifugare a 1,50.000 x g per 2 h a 4 °C.
  7. Scartare il surnatante e raccogliere il residuo, che è Exos. Risospendere Exos da sette piatti di cellule in 50 μL di PBS.
    NOTA: gli UCMSC di sesto passaggio vengono utilizzati per l'isolamento EV. Per ottenere abbastanza MV ed Exos per uso sperimentale, di solito sono necessari 7-8 piatti di cellule coltivate. I campioni EV vengono utilizzati immediatamente per le successive fasi di caratterizzazione o per applicazioni terapeutiche, che è meglio non conservare.
    ATTENZIONE: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei veicoli elettrici, ed è meglio conservare i veicoli elettrici a 4 °C a breve termine e non a -80 °C.

3. Rilevamento del numero di particelle e distribuzione dimensionale dei veicoli elettrici da MSC

NOTA: Per la valutazione della distribuzione dimensionale, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) viene eseguita da un analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).

  1. Diluire 1 μL di EV (dalla fase 2.5 e dalla fase 2.7) in 1.499 μL di PBS e mescolare abbastanza in una provetta da 15 ml.
  2. Utilizzare l'analizzatore di tracciamento seguendo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, avviare il software compatibile (vedere Tabella dei materiali).
  3. Riempire la cella campione con acqua distillata, quindi consentire allo strumento di avviare il controllo della cella.
  4. Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia compreso tra 50 e 400 (preferibilmente circa 200). Fare clic su OK.
    NOTA: Preparare la soluzione standard ricostituendo 1 μL di soluzione di taratura (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di acqua distillata per generare una soluzione primaria, quindi prelevare 100 μL della soluzione primaria e aggiungere 25 mL di acqua distillata per preparare una soluzione standard (1:250.000). Conservare questo reagente di lavoro a 4 °C per una settimana.
  5. Risciacquare la cella del campione con 5 ml di acqua distillata.
  6. Prima dell'analisi del campione, lavare il canale con 1 mL di acqua distillata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia inferiore a 10.
  7. Iniettare 1 mL del campione EV preparato al punto 3.1. Eseguire il test delle vescicole secondo le istruzioni operative dello strumento.
    ATTENZIONE: Il campione e l'acqua distillata vengono iniettati con una siringa da 1 mL ad una velocità costante di 0,5 mL/s sotto attento controllo manuale.

4. Caratterizzazione della morfologia delle EV mediante microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

  1. Diluire 1 μL di EV dalla fase 2.7 in 199 μL di PBS e mescolare abbastanza. Aggiungere 20 μL di gocce di sospensione EV alla maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio (vedere Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 3 minuti.
  2. Rimuovere il liquido in eccesso con una piccola carta da filtro e lasciarlo rimanere per 15 secondi per asciugare leggermente la superficie.
  3. Colorare negativamente i campioni di EV con goccioline di acido fosfotungstico all'1,5% per 40 s.
  4. Rimuovere l'acido fosfotungstico in eccesso e lasciarlo riposare per 15 s per asciugare leggermente la superficie.
  5. Inserire il campione contenente la maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio in un piatto pulito coperto con carta da filtro. Osserva e cattura immagini con un microscopio elettronico a trasmissione.
    NOTA: In questo processo, Exos sono presi come esempio.

5. Etichettatura dei veicoli elettrici derivati dalle MSC

  1. Dopo l'estrazione EVs (fase 2.5), risospendere con 250 μL di PBS in un tubo conico da 1,5 ml.
  2. Utilizzare un altro tubo conico da 1,5 ml per preparare la soluzione di lavoro del colorante PKH26; utilizzare 1 μL di reagente di etichettatura PKH26 diluito con 250 μL di diluente C (un componente del kit di etichettatura EV disponibile in commercio utilizzato per il presente studio, vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: preparare la soluzione di lavoro immediatamente prima dell'uso.
    ATTENZIONE: Un eccessivo colorante PKH26 o etichettatura senza pre-diluizione rischia di danneggiare i veicoli elettrici.
  3. Mescolare i veicoli elettrici risospesi con la soluzione di lavoro. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi aggiungere 500 μL di FBS impoverito di EV per fermare la reazione.
  4. Per le MV, centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di PBS per risciacquare il residuo.
  5. Centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante per rimuovere il colorante non legato.
  6. Risospendere il residuo con 200 μL di PBS. Far cadere 20 μL di sospensione sul vetrino e osservarlo al microscopio a fluorescenza.
    NOTA: in questo processo, gli MV vengono presi come esempio.

6. Trapianto locale e iniezione sistemica di MSC-EV

NOTA: per le seguenti procedure, posizionare i veicoli elettrici sul ghiaccio prima dell'iniezione.

  1. Eseguire il trapianto locale seguendo i passaggi seguenti.
    1. Anestetizzare i topi con isoflurano al 4% (vol/vol). Mantenere l'anestesia all'1% -3% di isoflurano durante la procedura.
    2. Prima dell'intervento chirurgico, somministrare 5 mg / kg di carprofen (IP) per l'analgesia per ridurre al minimo il dolore post-procedurale.
    3. Prima dell'escissione della ferita, radersi i peli dorsali e sterilizzare la superficie dorsale applicando 3 cicli alternati di 10% di iodio povidone e etanolo al 75%.
    4. Utilizzando un punzone bioptico (vedi Tabella dei materiali), creare una ferita a tutto spessore di 1 cm di diametro sulla pelle dorsale.
    5. Risospendere le EV derivate da MSC da due piatti in 100 μL di PBS e somministrare l'iniezione nello strato sottocutaneo del letto della ferita, attorno a ciascuna ferita con quattro siti.
      NOTA: viene iniettata una media di 100 μg di EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino.
    6. Dopo il trattamento, avvolgere i topi con una garza sterile e posizionarli su tamponi termoisolanti (vedi Tabella dei materiali) fino al loro risveglio.
    7. Assicurarsi che i topi non siano lasciati incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza. Non restituire i topi alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
    8. Somministrare ulteriori dosi di analgesia il giorno 2 e il giorno 3 post-operatorio, se necessario.
  2. Eseguire l'iniezione sistemica.
    1. Risospendere le EV derivate da MSC in 200 μL di PBS e quindi miscelare con soluzione di eparina in un rapporto di volume 10: 1.
    2. Posizionare i topi nel sistema di imaging della vena caudale (vedere Tabella dei materiali). Premere l'interruttore per sollevare la leva.
    3. Disinfettare la vena caudale usando un tampone imbevuto di alcool prima dell'iniezione endovenosa. Quindi, iniettare sistematicamente i topi con la sospensione preparata al punto 6.2.1 attraverso la vena caudale. La procedura è aiutata da un illustratore di vene della coda.
      NOTA: Iniettare la sospensione EV immediatamente dopo la miscelazione con eparina. Viene iniettata una media di 100 μg EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino.
      ATTENZIONE: L'iniezione della vena della coda di topo è solitamente limitata a 200 μl di volume. L'iniezione deve andare lentamente e fermarsi se si vede un urto o resistenza, che suggerisce che l'ago è fuori dalla vena. Se i topi mostrano segni clinici avversi come arricciamento e tremore, questa potrebbe essere una risposta shock all'iniezione ad alto volume, all'iniezione rapida o alla tossicità / anafilassi.

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Results

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MV ed Exos da UCMSC umani in coltura vengono isolati seguendo il flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). I risultati NTA dimostrano che la dimensione di Exos da MSC umane varia da 40 nm a 335 nm con una dimensione di picco di circa 100 nm, e la dimensione delle MV varia da 50 nm a 445 nm con una dimensione di picco di 150 nm (Figura 2). La caratterizzazione morfologica degli Exos derivati da MSC mostra una tipica forma a coppa (Figura 3

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le EV stanno emergendo per svolgere un ruolo importante in diverse attività biologiche, tra cui la presentazione dell'antigene, il trasporto di materiale genetico, la modifica del microambiente cellulare e altri. Inoltre, la loro ampia applicazione offre nuovi approcci e opportunità per la diagnosi e il trattamento delle malattie21. L'implementazione delle applicazioni terapeutiche delle EV si basa sul successo dell'isolamento e della caratterizzazione. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 e 82170988) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e del Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center dell'Air Force Medical University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% povidone-iodio (Betadine)Weizhenyuan10053956954292Disinfezione delle ferite
Soluzione di calibrazioneParticella Metrix110-0020Calibrare lo strumento NTA
CarprofenSigma53716-49-7Medicina analgesica
Imager della vena caudale KEW Life ScienceKW-XXYImager della vena caudale
CentrifugaEppendorf5418RCentrifugazione
Siero bovino fataleCorning35-081-CVColtura di UCMSCs
Formvar/maglia quadrata rivestita di carbonioPBL Assay Science 24916-25Microscopio elettronico a trasmissione
Cuscinetto riscaldanteZhongke Life ScienceZ8G5JBMzCura post-trattamento degli animali Soluzione di
eparinaStemCell7980Iniezione sistemica
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22Anestesia animale
Minimo Essenziale Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTColtura di UCMSCs
Analizzatore di tracciamento di nanoparticelleParticle MetrixZetaView PMX120Analisi di tracciamento di nanoparticelle
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend EVs
Penicillina/StreptomicinaProcell Life SciencePB180120Coltura di UCMSCs
Acido fosfotungsticoSolarbio12501-23-4Microscopio
PipettaEppendorf3120000224
PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rossoSigma-AldrichMINI26Etichettatura EVs
Punzone per biopsia cutaneaAcuderm69038-10-50Difetti cutanei
Software ZetaViewParticle MetrixVersione 8.05.14 SP7 
Apparecchiature termostaticheGrantv-0001-0005
Microscopio elettronico a trasmissioneHITACHIHT7800Microscopio elettronico a trasmissione
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercialmente UCMSCs
UltracentrifugeBeckmanXPN-100Centrifugazione
purificazione dell'acqua filtrata ultrapuraMilli-QIQ 7000Preparazione di acqua ultrapura
elettronico a trasmissione a bagno d'acqua Sistema di

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
  3. Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025(2019).
  4. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  5. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  6. Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996(2021).
  7. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  8. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22(2006).
  10. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  11. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  12. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  13. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  16. Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
  17. Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
  18. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074(2021).
  19. Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830(2020).
  20. He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708(2019).
  21. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835(2019).
  24. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  26. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  27. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  28. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  29. Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
  30. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
  31. Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
  32. Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).
  33. Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213(2021).

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