Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La saliva svolge un ruolo importante nella salute orale e generale. La funzione di barriera endoteliale intatta dei vasi sanguigni consente la secrezione di saliva, mentre la disfunzione della barriera endoteliale è correlata a molti disturbi secretori delle ghiandole salivari. Il presente protocollo descrive un metodo di rilevamento della permeabilità paracellulare in vivo per valutare la funzione delle giunzioni strette endoteliali (TJ) nelle ghiandole sottomandibolari di topo (SMG). In primo luogo, dextrans marcati con fluorescenza con diversi pesi molecolari (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) sono stati iniettati nelle vene angolari dei topi. Successivamente, l'SMG unilaterale è stato sezionato e fissato nel supporto personalizzato sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni, quindi sono state catturate immagini per vasi sanguigni, acini e condotti. Utilizzando questo metodo, è stata monitorata la perdita dinamica in tempo reale dei traccianti di diverse dimensioni dai vasi sanguigni nei lati basali degli acini e persino attraverso gli epiteli acinosi nei dotti per valutare l'alterazione della funzione della barriera endoteliale in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.
Introduzione
Varie ghiandole salivari producono saliva, che agisce principalmente come prima linea di difesa contro le infezioni e aiuta la digestione, svolgendo così un ruolo essenziale nella salute orale e generale1. L'afflusso di sangue è fondamentale per la secrezione delle ghiandole salivari poiché fornisce costantemente acqua, elettroliti e molecole che formano la saliva primaria. La funzione di barriera endoteliale, regolata dal complesso a giunzione stretta (TJ), limita rigorosamente e delicatamente la permeazione dei capillari, che sono altamente permeabili all'acqua, ai soluti, alle proteine e persino alle cellule che si spostano dai vasi sanguigni circolanti nei tessuti delle ghiandole salivari 2,3. Abbiamo precedentemente scoperto che l'apertura dei TJ endoteliali in risposta a uno stimolo colinergico facilita la secrezione di saliva, mentre la compromissione della funzione della barriera endoteliale è interconnessa con l'iposecrezione e l'infiltrazione linfocitaria nelle ghiandole sottomandibolari (SMG) nella sindrome di Sjögren4. Questi dati suggeriscono che il contributo della funzione di barriera endoteliale deve essere prestato sufficiente attenzione per quanto riguarda una varietà di malattie delle ghiandole salivari.
Un microscopio a scansione laser a due fotoni è un potente strumento per osservare la dinamica delle cellule nei tessuti intatti in vivo. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che la luce nel vicino infrarosso (NIR) ha una penetrazione tissutale più profonda rispetto alla luce visibile o ultravioletta quando i campioni sono eccitati dalla NIR e non causa evidenti danni alla luce ai tessuti in condizioni appropriate 5,6. Infatti, le ghiandole salivari sono un tessuto molto omogeneo e superficiale, in cui le cellule acinose superficiali distano solo circa 30 μm dalla superficie della ghiandola 7,8. È stato dimostrato che la microscopia confocale intravitale può studiare la secrezione esocrina e il citoscheletro di actina nelle ghiandole salivari di topo vivo a risoluzione subcellulare8. La microscopia a scansione laser a due fotoni, tuttavia, non solo ha il vantaggio della microscopia confocale convenzionale, ma può anche essere utilizzata per rilevare più chiaramente tessuti e immagini più profondi. Qui, i destrani marcati con fluorescenza, che sono spesso usati come traccianti di permeabilità paracellulare e hanno il vantaggio di diverse dimensioni, possono essere utilizzati per testare la grandezza del poro TJ9. Nel presente studio, viene stabilita una tecnica di microscopia laser a scansione laser a due fotoni intravitale in tempo reale per la valutazione in situ della funzione della barriera endoteliale negli SMG di topo. Ogni fase di lavoro per il rilevamento della permeabilità vascolare in vivo nelle SMG di topo è descritta nel protocollo corrente. Ecco un esempio di rilevamento della funzione della barriera endoteliale nel modello di legatura del dotto SMG del topo.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Centro di scienze della salute dell'Università di Pechino, e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi wild-type (WT) nella fascia di età di 8-10 settimane. Gli animali da esperimento sono stati trattati con cura per ridurre al minimo il loro dolore e disagio.
1. Procedure relative agli animali
- Preparare e somministrare gli anestetici e i traccianti.
- Mantenere condizioni sterili durante tutto lo studio e sterilizzare gli strumenti in autoclave. Dividi i topi in due gruppi.
NOTA: Il gruppo di controllo non è stato trattato e l'altro gruppo con legatura unilaterale del dotto SMG per 1 giorno è servito come gruppo sperimentale. Durante il raggruppamento, è necessario selezionare topi con peso corporeo ed età simili per ridurre l'influenza del peso e dell'età sulla permeabilità vascolare. - Scegliere traccianti appropriati come destrano marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (peso molecolare: 4 kDa; FD4) e destrano marcato con rodamina B (peso molecolare: 70 kDa; RD70) (vedi Tabella dei materiali) con spettri di eccitazione/emissione distinti per ridurre al minimo l'interferenza tra i segnali di fluorescenza (utilizzando rispettivamente il filtro FITC o il filtro della rodamina B) per il saggio di permeabilità.
NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione di FD4 e RD70 sono rispettivamente 488 nm e 594 nm e le lunghezze d'onda di emissione selezionate sono rispettivamente 511-564 nm e 617-669 nm. - Diluire i traccianti in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (1x PBS) in scorte di 100 mg/ml e conservare le aliquote al riparo dalla luce a -20 °C.
NOTA: Il destrano con un peso molecolare come 4 kDa fuoriesce rapidamente dal sangue nelle SMG del topo anche senza condizioni patologiche10. - Iniettare per via intraperitoneale il tribromoetanolo (la dose per un topo da 25 g era di circa 600 μL) per anestetizzare i topi. Fornire analgesia come raccomandato dal comitato etico animale locale.
NOTA: Dopo l'induzione dell'anestesia, utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Prenditi cura degli animali11. Attendere che il topo tolleri la stimolazione meccanica, ad esempio pizzicando la punta senza risposta motoria. - Iniettare una miscela di due traccianti di permeabilità paracellulare con pesi molecolari diversi (FD4 e RD70) nella vena angolare (0,5 mg/g di peso corporeo). Iniettare ogni topo con una miscela di soluzione tracciante da 100 μL, con 50 μL di ciascun colorante miscelati in un rapporto 1:1.
- Dopo l'anestesia, tenere delicatamente la testa e il collo del mouse per far sporgere leggermente un lato del bulbo oculare. Inserire una siringa da insulina contenente traccianti fluorescenti (fare attenzione a non introdurre aria nella siringa) lungo l'angolo dell'occhio ad angolo retto rispetto all'occhio.
NOTA: Se la vena angolare viene inserita correttamente, la soluzione colorante verrà facilmente iniettata nella vena e non ci sarà resistenza durante l'iniezione. Inoltre, l'iniezione della vena caudale nei topi potrebbe anche essere un candidato per molecole traccianti per via endovenosa.
- Dopo l'anestesia, tenere delicatamente la testa e il collo del mouse per far sporgere leggermente un lato del bulbo oculare. Inserire una siringa da insulina contenente traccianti fluorescenti (fare attenzione a non introdurre aria nella siringa) lungo l'angolo dell'occhio ad angolo retto rispetto all'occhio.
- Mantenere condizioni sterili durante tutto lo studio e sterilizzare gli strumenti in autoclave. Dividi i topi in due gruppi.
- Eseguire l'isolamento SMG seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: Utilizzare strumenti sterili, tra cui forbici per tessuti e nichel di separazione, per l'intervento chirurgico.- Separare accuratamente una ghiandola unilaterale in modo da non danneggiare i vasi sanguigni e i nervi circostanti al microscopio stereoscopico.
- Dopo l'iniezione di traccianti di permeabilità paracellulare, mettere rapidamente i topi sul cartone e metterli in posizione supina con gli arti e le teste nastrati. Applicare la crema depilatoria sulla pelle del collo per rimuovere i peli del topo. Utilizzare etanolo al 75% per disinfettare la pelle prima dell'intervento chirurgico.
- Quindi, sotto uno stereomicroscopio, tagliare l'epidermide del collo con forbici di tessuto generale per esporre entrambi i lati delle SMG (la ghiandola destra è stata trattata in questo esperimento). Quindi, utilizzare un nichel di separazione del tessuto smussato (vedere Tabella dei materiali) per separare delicatamente la capsula dalla superficie della ghiandola, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto ghiandolare e i vasi sanguigni.
- Separare la capsula dalla superficie della ghiandola senza danneggiare la struttura ghiandolare. Inoltre, assicurarsi che l'intero processo di ritenuta del mouse e separazione della ghiandola sia completato entro 10 minuti.
- Separare accuratamente una ghiandola unilaterale in modo da non danneggiare i vasi sanguigni e i nervi circostanti al microscopio stereoscopico.
2. Configurazione del microscopio a due fotoni
- Collegare il supporto personalizzato al dispositivo a pressione negativa e verificare in anticipo se l'effetto della pressione negativa è stato raggiunto correttamente.
NOTA: Il supporto ha la forma di una lente d'ingrandimento in miniatura con un pezzo piatto di vetro rotondo al centro (diametro: 4,32 mm, Figura 1). Il dispositivo a pressione negativa è stato progettato internamente in modo tale che il supporto sia collegato a un tubo di gomma, che è collegato con una bottiglia di drenaggio, e la bottiglia sia collegata al regolatore di pressione negativa attraverso un tubo di gomma corto. In questo modo, il regolatore di pressione negativa può regolare la pressione per garantire che il tessuto venga aspirato nel supporto.- Collegare un lato del supporto con il dispositivo a pressione negativa. Per verificare se il dispositivo a pressione negativa è intatto e appropriato, capovolgere il supporto, aggiungere una goccia d'acqua e impostare il valore della pressione negativa su 20 unità. Se l'acqua viene completamente e rapidamente aspirata, il dispositivo a pressione negativa viene installato correttamente con il supporto.
- Posizionare delicatamente l'SMG esposto del mouse sul supporto personalizzato e aspirare il tessuto mediante aspirazione a pressione negativa il più lontano possibile dal corpo del mouse per ridurre gli artefatti di movimento causati dalla respirazione e da altre condizioni.
- Immagine del materiale di supporto attaccato alla ghiandola sotto un obiettivo di immersione in acqua 25x/NA 1.0 (speciale per NIR).
NOTA: Utilizzare un microscopio verticale a due fotoni (vedere Tabella dei materiali) in questo esperimento. I vasi sanguigni devono essere visibili immediatamente con evidente fluorescenza dopo l'iniezione del tracciante.
3. Imaging dei vasi e rilevamento della permeabilità
- Iniziare l'imaging subito dopo la vista della ghiandola è stata scelta.
NOTA: In genere, le serie temporali di 45-50 immagini in 20 s o più vengono generalmente acquisite a seconda del progetto sperimentale. - Acquisire immagini sequenziali lungo l'asse Z, a 2 μm di distanza, dalla superficie della ghiandola fino a 70-140 μm nel tessuto per generare una costruzione tridimensionale (3D).
- Acquisire l'imaging time-lapse dei vasi per misurare la permeabilità vascolare nella SMG.
NOTA: impostare le condizioni del menu del programma come segue dopo aver eseguito il software del microscopio (vedere Tabella dei materiali).- Nella finestra di dialogo Explorer, fare clic su Aggiungi nuova cartella e modificare il nome del file.
- Torna alla colonna Acquisizione . In XY, il formato è 512 x 512 e la velocità è 400 Hz. Attiva X bidirezionale .
- Impostare il fattore di zoom su 0,75 e 1,5 per Zoom.
- Per acquisire l'imaging time-lapse, selezionare xyt in Modalità di acquisizione. Impostare la durata su 20 s, 30 minuti o più a seconda delle esigenze sperimentali.
- Per realizzare la costruzione 3D, impostare la modalità di acquisizione su xyz. La dimensione Z-Step può essere impostata in base alla situazione reale.
- Dopo aver impostato le condizioni, fare clic su Live per osservare l'imaging vascolare di due canali e canali sovrapposti nella cornice di formazione della foto e scegliere le aree di interesse.
- Fare clic su Start per avviare l'imaging.
NOTA: il mouse non deve essere lasciato incustodito durante il processo di imaging durante l'anestesia.
4. Analisi dei dati
- Per valutare la permeabilità dei vasi, utilizzare il software Image J per calcolare il rapporto di intensità di fluorescenza di FD4 e RD70 tra i vasi esterni e interni e denotarli come intensità extra- e intravascolare4.
NOTA: L'alterazione della permeabilità vascolare attraverso il tracciamento del trasporto di destrani riflette il cambiamento nella funzione della barriera endoteliale. Inoltre, osservare la morfologia e la densità vascolare calcolando il diametro e il numero di cambiamenti dei vasi.- Eseguire il software Image J (vedere Tabella dei materiali).
- Fare clic su File e selezionare Apri per aprire le immagini dei vasi sanguigni catturate al microscopio a due fotoni.
- Selezionare Immagine e impostare Tipo su 16 bit per convertire il formato immagine.
- Selezionare Analizza (Analyze ), quindi Area ( Area), Media (Mean), IntDen ( Set Measurements). Clicca su OK per confermare.
- In Analizza seleziona Strumenti, apri ROI Manager e seleziona Mostra tutto ed etichette.
- Misurare il valore di intensità della fluorescenza intravascolare: fare clic sullo strumento lazo sull'interfaccia principale per tracciare il contorno del vaso sanguigno. Fai clic su Aggiungi in ROI Manager. Seguire questo passaggio per continuare a selezionare più navi. Seleziona tutti gli oggetti del ROI Manager e fai clic su Misura.
- Misurare il valore totale dell'intensità di fluorescenza: delineare l'intera immagine, fare clic su Misura e il risultato è il valore dell'intensità di fluorescenza totale dell'immagine.
- Calcolare il valore dell'intensità della fluorescenza extravascolare. Copiare i dati in Excel per il calcolo. Rapporto di intensità di fluorescenza extravascolare = (1 − valore di intensità di fluorescenza intravascolare/valore di intensità di fluorescenza totale) × 100%.
5. Applicazioni a valle
- Durante l'esperimento, calcolare la portata sanguigna misurando la distanza che un globulo rosso (mostrato come un punto nero al microscopio a due fotoni)4 subisce in una durata di tempo.
- Per visualizzare il movimento delle cellule del sangue attraverso le cellule endoteliali, etichettare le cellule del sangue per fluorescenza. Quindi, iniettare le cellule marcate con fluorescenza con FD4 o RD70 attraverso la vena della coda del topo. Dopo aver circolato per 5 minuti, rintracciare le cellule interessate per un periodo.
NOTA: Un totale di 2 x 106 CFSE (carbossifluoresceina succinimidil estere, un colorante fluorescente permeabile alla membrana) linfociti marcati derivati dalla milza di topi donatori sono stati trasferiti nei riceventi mediante iniezione di vena della coda e l'infiltrazione di linfociti nelle SMG è stata studiata in modelli animali sperimentali4.
6. Cura e recupero degli animali
- Prenditi cura degli animali durante l'esperimento.
NOTA: Assicurarsi che l'animale che ha subito un intervento chirurgico non venga restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si sia completamente ripreso durante l'esperimento. - Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non riacquista abbastanza coscienza.
NOTA: Osservare continuamente lo stato respiratorio dei topi e tenerli caldi mettendoli sul termoforo per animali. Fornire alloggi post-chirurgici per il recupero del dolore e analgesia, come raccomandato dal comitato etico animale locale.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Seguendo il protocollo, l'SMG unilaterale è stato collegato a un supporto su misura e la ghiandola è stata tenuta il più lontano possibile dal corpo del topo per evitare che la respirazione causasse artefatti di movimento. Il rapido flusso dei globuli rossi (punti neri) nei vasi sanguigni è stato osservato al microscopio. Dopo aver trovato il campo di tessuto sotto una lente oculare, si deve passare a manipolare il software del microscopio. Nel gruppo di controllo, entrambi i traccianti esistevano nei vasi sanguigni del ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il mantenimento e la regolazione della funzione della barriera endoteliale sono essenziali per l'omeostasi vascolare. Le cellule endoteliali e le loro giunzioni intercellulari svolgono un ruolo critico nel mantenimento e nel controllo dell'integrità vascolare12. La forza di taglio del flusso sanguigno, i fattori di crescita e i fattori infiammatori possono causare cambiamenti nella permeabilità vascolare e, quindi, partecipare all'insorgenza e allo sviluppo di malattie sistemiche come ipertensione...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e dalla Beijing Natural Science Foundation (grant 7202082).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio a 2 fotoni (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germania | ||
| destrano marcato con FITC da 4 kDa | Sigma Aldrich | 46944 | |
| destrano marcato con RODAMINA B da 70 kDa | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Nichel per la separazione dei tessuti smussato | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Crema depilatoria | Veet | ||
| Siringa sterile monouso | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Siringa per insulina | Becton, Dickinson and Company 0253316 | 1 mL | |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1,5 mL |
| Phosphate buffered soluzione salina 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Forbici per tessuti | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoetanolo | JITIAN Bio | JT0781 |
Riferimenti
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
