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Articolo metodologico

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

3.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

7 luglio 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Abstract

La riprogrammazione neuronale diretta è un approccio potente per generare neuroni funzionali da diverse popolazioni di cellule starter senza passare attraverso intermedi multipotenti. Questa tecnica non solo ha grandi promesse nel campo della modellazione delle malattie, in quanto consente di convertire, ad esempio, i fibroblasti per i pazienti affetti da malattie neurodegenerative in neuroni, ma rappresenta anche un'alternativa promettente per le terapie sostitutive basate sulle cellule. In questo contesto, un importante passo avanti scientifico è stata la dimostrazione che le cellule non neurali differenziate all'interno del sistema nervoso centrale, come gli astrociti, potrebbero essere convertite in neuroni funzionali in vitro. Da allora, la riprogrammazione diretta in vitro degli astrociti in neuroni ha fornito informazioni sostanziali sui meccanismi molecolari alla base della conversione forzata dell'identità e sugli ostacoli che impediscono una riprogrammazione efficiente. Tuttavia, i risultati di esperimenti in vitro eseguiti in diversi laboratori sono difficili da confrontare a causa delle differenze nei metodi utilizzati per isolare, coltivare e riprogrammare gli astrociti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e coltivare in modo affidabile astrociti con elevata purezza da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi in età postnatale tramite selezione di cellule magnetiche. Inoltre, forniamo protocolli per riprogrammare astrociti coltivati in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del DNA. Questo protocollo semplificato e standardizzato può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base del mantenimento dell'identità cellulare, la creazione di una nuova identità neuronale, nonché la generazione di specifici sottotipi neuronali e le loro proprietà funzionali.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti 7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegenerazione è irreversibile e spesso si traduce in deficit motori e cognitivi10. Con l'obiettivo di salvare le funzioni cerebrali, diverse strategie per sostituire i neuroni persi sono oggetto di intense indagini11. Tra questi, la riprogrammazione diretta delle cellule somatiche in neuroni funzionali sta emergendo come un approccio terapeutico promettente12. La riprogrammazione diretta, o transdifferenziazione, è il processo di conversione di un tipo di cellula differenziata in una nuova identità senza passare attraverso uno stato proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Pioniere dell'identificazione di MyoD1 come fattore sufficiente per convertire i fibroblasti in cellule muscolari17,18, questo metodo è stato applicato con successo per riprogrammare diversi tipi di cellule in neuroni funzionali 19,20,21.

Gli astrociti, la macroglia più abbondante nel SNC22,23, sono un tipo di cellula particolarmente promettente per la riprogrammazione neuronale diretta per diversi motivi. In primo luogo, sono ampiamente e uniformemente distribuiti attraverso il SNC, fornendo un'abbondante fonte in loco per i nuovi neuroni. In secondo luogo, gli astrociti e i neuroni sono strettamente correlati allo sviluppo, in quanto condividono un antenato comune durante lo sviluppo embrionale, le cellule gliali radiali24. L'origine embrionale comune dei due tipi di cellule sembra facilitare la conversione neuronale rispetto alla riprogrammazione di cellule provenienti da diversi strati germinali19,21. Inoltre, le informazioni di pattern ereditate dagli astrociti attraverso la loro origine glia radiale sono mantenute anche negli astrociti adulti 25,26,27 e sembrano contribuire alla generazione di sottotipi neuronali appropriati a livello regionale 28,29,30. Quindi, studiare e comprendere la conversione degli astrociti in neuroni è una parte importante del raggiungimento del pieno potenziale di questa tecnica per le strategie di sostituzione basate sulle cellule.

La conversione di astrociti in coltura in vitro in neuroni ha portato a diverse scoperte nel campo della riprogrammazione neuronale diretta, tra cui: i) l'identificazione di fattori di trascrizione sufficienti a generare neuroni dagli astrociti 15,19,31, ii) il dipanarsi di meccanismi molecolari innescati da diversi fattori di riprogrammazione nello stesso contesto cellulare 32 , e iii) evidenziando l'impatto dell'origine evolutiva degli astrociti sull'induzione di diversi sottotipi neuronali 28,29,33. Inoltre, la conversione diretta in vitro degli astrociti ha svelato diversi ostacoli importanti che limitano la riprogrammazione neuronale diretta34,35, come l'aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)34 e le differenze tra il proteoma mitocondriale degli astrociti e i neuroni35. Quindi, queste osservazioni supportano fortemente l'uso di colture primarie di astrociti come modello per la riprogrammazione neuronale diretta per indagare diverse questioni fondamentali in biologia12, relative al mantenimento dell'identità cellulare, agli ostacoli che impediscono i cambiamenti del destino cellulare e al ruolo del metabolismo nella riprogrammazione.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per isolare astrociti da topi in età postnatale (P) con purezza molto elevata, come dimostrato isolando astrociti dal midollo spinale murino29. Forniamo anche protocolli per riprogrammare gli astrociti in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del plasmide del DNA. Le cellule riprogrammate possono essere analizzate a 7 giorni dopo la trasduzione (7 DPT) per valutare vari aspetti, come l'efficienza di riprogrammazione e la morfologia neuronale, oppure possono essere mantenute in coltura per diverse settimane, per valutarne la maturazione nel tempo. È importante sottolineare che questo protocollo non è specifico per gli astrociti del midollo spinale e può essere prontamente applicato per isolare gli astrociti da varie altre regioni del cervello, tra cui la materia grigia corticale, il mesencefalo e il cervelletto.

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Protocollo

La seguente procedura segue le linee guida per la cura degli animali dell'Helmholtz Zentrum Munich in conformità con la direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Assicurati di rispettare le linee guida per la cura degli animali dell'istituzione in cui viene eseguita la dissezione.

1. Preparazione di materiali per dissezione, dissociazione e coltura

NOTA: Preparare tutti i reagenti di coltura all'interno di un armadio di sicurezza biologica e lavorare utilizzando solo apparecchiature autoclavate o sterili. I reagenti di dissezione e dissociazione possono essere preparati al di fuori di un armadio di sicurezza biologica.

  1. Preparare i palloni di coltura rivestendo un matraccio di coltura T25 con poli-D-lisina (brodo 1 mg/mL; soluzione di lavoro 20 μg/mL) in H2O per un minimo di 2 ore. Successivamente, risciacquare 3 volte con H2O e asciugare all'aria.
  2. Preparare il tampone di dissezione aggiungendo 5 ml di soluzione tampone HEPES da 1 M a 500 ml di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank.
  3. Preparare un tubo C (vedi Tabella dei materiali) per sei midollo spinale aggiungendo 1950 μL di tampone X dal kit di dissociazione del tessuto neurale (vedere Tabella dei materiali). Conservare sul ghiaccio durante la dissezione. Preparare il master mix di digestione enzimatica aggiungendo 20 μL di tampone Y e 10 μL di tampone A per tubo C (parte del kit di dissociazione del tessuto neurale; vedere Tabella dei materiali). Mescolare bene e conservare a 4 °C fino a quando necessario.
  4. Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) con calcio e magnesio e mettere su ghiaccio. Preparare il terreno di coltura di base aggiungendo 5 mL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale, 100 U / mL), 5 mL di D-glucosio al 45% e 5 mL di integratore di glutammina (concentrazione finale 2 mM; vedere Tabella dei materiali) a 485 mL di DMEM / F12. Il mezzo di base è stabile a 4 °C per 4 settimane.
  5. Preparare il terreno di coltura degli astrociti aggiungendo 1 mL di integratore B27 e 5 mL di siero bovino fetale (FBS) a 44 mL di terreno di coltura di base. Mezzo di integrazione con fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) (10 ng / mL ciascuno). Aggiungere EGF e bFGF appena prima dell'uso alla quantità appropriata di supporto.
  6. Per la dissezione del tessuto del midollo spinale, utilizzare un paio di grandi pinze con punta piegata, un paio di piccole pinze con punta piegata, un paio di piccole pinze, un paio di piccole forbici e una piccola spatola.

2. Isolamento degli astrociti

  1. Isolare gli astrociti dal midollo spinale dei topi postnatali per eseguire la loro riprogrammazione diretta in neuroni funzionali (Figura 1A). Per questo protocollo, raccogliere il tessuto del midollo spinale dai topi al giorno 2-3 dopo la nascita. Raccogli da sei a otto midollo spinale per l'isolamento degli astrociti. Utilizzare questo stesso protocollo per isolare gli astrociti da altre regioni del sistema nervoso, come la corteccia, il mesencefalo e il cervelletto. Per queste regioni, ottenere cellule a cinque o sette giorni dopo la nascita.
    NOTA: Quando si mira a isolare astrociti da regioni che non sono menzionate in questo protocollo, l'età e il materiale in ingresso devono essere determinati sperimentalmente.

3. Dissezione del tessuto del midollo spinale

NOTA: la dissezione del tessuto può essere eseguita al di fuori di un armadio di sicurezza biologica.

  1. Sacrifica topi a P2-P3 per decapitazione senza anestetizzare l'animale. Posizionare il busto in una capsula di Petri da 35 mm e tenerlo sul ghiaccio.
  2. Aprire la pelle con le forbici, rimuovere la vertebra con piccole forbici, estrarre il midollo spinale e metterlo nel tampone di dissezione sul ghiaccio. Sotto un microscopio di dissezione stereotassica con ingrandimento 2x, rimuovere le meningi dal midollo spinale isolato usando una pinza e trasferire il tessuto del midollo spinale sezionato e pulito a un tubo C.

4. Ordinamento magnetico delle celle attivate (MACS)

  1. Aggiungere 50 μL di enzima P dal kit di dissociazione del tessuto neurale (vedere Tabella dei materiali) e 30 μL di miscela enzimatica precedentemente preparata a ciascun tubo C. Invertire i tubi a C e posizionarli su un dissociatore riscaldato (vedi Tabella dei materiali), assicurandosi che tutto il tessuto sia raccolto nel coperchio del tubo.
  2. Eseguire il programma di dissociazione 37_NTDK_1 con un tempo di esecuzione di circa 22 minuti. Poco prima della fine del programma, posizionare un filtro da 70 μm (vedi Tabella dei materiali) su un numero di tubi da 15 ml pari al numero di tubi C utilizzati e pre-bagnare il filtro con 2 mL di PBS ghiacciato. Conservare 1x PBS su ghiaccio durante l'intera procedura MACS.
  3. Dopo il completamento del programma, rimuovere i tubi C e centrifugarli brevemente per raccogliere il tessuto sul fondo dei tubi. Trasferire il tessuto dissociato dai tubi C ai tubi da 15 ml preparati facendolo passare attraverso il filtro. Lasciare il filtro su tubi da 15 ml.
  4. Risciacquare il tubo C con 10 mL di 1x PBS per raccogliere il tessuto residuo e raccoglierlo nello stesso tubo da 15 mL passando ancora una volta attraverso il filtro. Centrifugare i tubi da 15 ml contenenti tessuto dissociato a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Raffreddare la centrifuga fino a 4 °C dopo questo passaggio.
  5. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare prima di risospendere le cellule in 80 μL di 1x PBS; aggiungere 10 μL di reagente bloccante dal kit microsfere anti-ACSA-2 del mouse (vedere Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
  6. Incubare a 4 °C per 10 minuti al buio (frigorifero). Aggiungere 10 μL di microsfere accoppiate all'antigene-2 della superficie delle cellule anti-astrocita (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Incubare per 15 minuti a 4 °C al buio.
  7. Lavare le celle aggiungendo 3 mL di 1x PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Durante la centrifugazione, assemblare un separatore magnetico (vedi Tabella dei materiali) posizionando il numero appropriato di colonne di smistamento magnetico (vedi Tabella dei materiali) sul separatore con un tubo di raccolta da 15 ml sotto. Risciacquare le colonne con 500 μL di 1x PBS.
  8. Rimuovere il surnatante e risospesere le cellule in 500 μL di 1x PBS prima di trasferire le sospensioni cellulari alle colonne magnetiche. Lasciare scolare per gravità. Lavare i tubi da 15 mL con 500 μL di 1x PBS e applicare alla colonna. Lavare le colonne con 500 μL di 1x PBS per altri due lavaggi.
  9. Eluire le cellule rimuovendo la colonna dal separatore, aggiungendo 800 μL di terreno di coltura degli astrociti e spingendo le cellule fuori dalla colonna con lo stantuffo incluso.
  10. Cellule piatte nei palloni di coltura precedentemente preparati aggiungendo 4,2 mL di terreno di coltura di astrociti integrato con EGF e bFGF e coltura a 37 °C e 5% di CO2.
    NOTA: Il rivestimento dei palloni di coltura non è necessario per gli astrociti isolati da altre regioni del cervello, ma fornisce un substrato migliore per gli astrociti isolati dal midollo spinale.
  11. Cellule di coltura per circa 7 giorni fino alla confluenza (80%-90%). Se le cellule non sono confluenti dopo 7 giorni, attendere fino a 10 giorni prima di placcarle. Dopo 10 giorni, le cellule non proliferano più e l'efficienza di riprogrammazione diminuisce.

5. Semina di astrociti per la riprogrammazione

NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in un armadio di sicurezza biologica con un livello di sicurezza 1 (SL1).

  1. Preparare piastre a 24 pozzetti con coperture in vetro rivestito in poli-D-lisina nello stesso modo in cui i palloni di coltura sono stati preparati in precedenza. Per determinare il numero di piastre necessarie, si consideri che gli astrociti sono placcati ad una densità di 5-5,5 x 104 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Di solito, isolando sei midollo spinale dai topi P2 si ottengono circa 1 x 106 cellule.
  2. Aspirare i mezzi dai palloni di coltura T25 contenenti gli astrociti coltivati e lavare una volta con 1x PBS. Staccare gli astrociti dal matraccio di coltura aggiungendo 0,5 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C per 5 minuti. Picchiettare delicatamente il lato del pallone per rilasciare le cellule dalla superficie del pallone di coltura e controllare il distacco al microscopio a campo luminoso utilizzando un ingrandimento 10X.
  3. Interrompere la tripsinizzazione con 2,5 mL di terreno di coltura di astrociti e raccogliere la sospensione cellulare in tubi da 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirare il surnatante e risospesiare le cellule in 1 mL di terreno di coltura astrocitario. Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un sistema automatizzato di conteggio delle cellule.
  4. In base al numero di cellule, diluire la sospensione cellulare con mezzo astrocitario fresco per ottenere una soluzione di 1-1,1 x 105 cellule per ml. Integrare il mezzo con EGF e bFGF a 10 ng/mL per fattore. Aggiungere 500 μL di sospensione cellulare, equivalenti a 5-5,5 x 104 celle, a ciascun pozzetto delle piastre a 24 pozzetti precedentemente preparate e alle cellule di coltura a 37 °C e al 5% di CO2.

6. Espressione forzata dei fattori di trascrizione

NOTA: Prima di procedere con il protocollo, è essenziale progettare correttamente l'esperimento. In particolare, è importante includere sempre un controllo negativo per la riprogrammazione, vale a dire una condizione in cui non viene espresso alcun fattore di riprogrammazione. Ad esempio, quando si utilizzano vettori che trasportano il cDNA per il fattore di riprogrammazione e un reporter (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP), DsRed), il controllo negativo è rappresentato dallo stesso vettore che trasporta solo il reporter. Quando si esprimono più fattori che trasportano diversi reporter, il controllo negativo dovrebbe essere regolato di conseguenza.

  1. Il giorno dopo la placcatura, ispezionare le piastre a 24 pozzetti per assicurarsi che le cellule abbiano aderito alle coperture.
  2. Sulla base dell'obiettivo sperimentale e delle risorse disponibili, l'espressione forzata dei fattori di riprogrammazione può essere ottenuta mediante trasduzione virale (vedi fase 6.3) o trasfezione del DNA (vedi fase 6.4).
    NOTA: L'uso di retrovirus o lentivirus richiede l'approvazione delle autorità governative e deve essere eseguito sotto un armadio di sicurezza biologica all'interno di un laboratorio con livello di sicurezza 2 (SL2).
  3. Riprogrammare gli astrociti trasducendo le cellule con il retrovirus o il lentivirus che trasportano le informazioni genetiche per esprimere il fattore o i fattori di riprogrammazione di interesse come descritto di seguito.
    1. Trasdurre cellule con un alto titolo virale di 1 x 1010-1 x 1012 particelle/ml aggiungendo 1 μL di sospensione cellulare direttamente al mezzo astrocitario. Ciò garantisce un alto tasso di infezione. Coltivare le cellule con il mezzo astrocitario contenente particelle virali a 37 °C per 24-36 ore prima di procedere con il paragrafo 7 o il paragrafo 8, a seconda dello scopo dell'esperimento.
      NOTA: diversi promotori possono essere utilizzati per guidare l'espressione dei transgeni (vedi anche Risultati rappresentativi). I promotori costitutivi (ad esempio, CMV, CAG) inducono l'espressione del transgene prima dei promotori inducibili; tuttavia, entrambi i tipi di tipi di promotori sono stati utilizzati con successo per riprogrammare le cellule in neuroni.
  4. I plasmidi del DNA possono anche essere introdotti negli astrociti tramite trasfezione del DNA come descritto di seguito.
    NOTA: Questo può essere fatto sotto un gabinetto di sicurezza biologica approvato per SL1.
    1. Prima della trasfezione, ottenere il reagente di trasfezione, un DNA plasmidico dei costrutti desiderati, un mezzo astrocitario fresco e un mezzo ridotto al siero (vedere Tabella dei materiali). Calcolare la quantità richiesta di siero ridotto (vedi Tabella dei materiali) considerando che ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti richiede 300 μL di terreno ridotto al siero. Aggiungere la quantità appropriata di siero ridotto a un tubo da 50 ml e riscaldarlo a 37 °C.
    2. Quando il mezzo ridotto al siero è caldo, aspirare il mezzo astrocitario da tutti i pozzetti e raccoglierlo in un tubo da 50 ml. Filtrare il mezzo astrocitario raccolto con un filtro a siringa da 0,45 μM per rimuovere le cellule staccate.
    3. Aggiungere un volume uguale di mezzo astrocitario fresco al mezzo filtrato per ottenere una soluzione sufficiente per aggiungere 1 mL di mezzo astrocitario per pozzetto. Mantenere il mezzo condizionato dagli astrociti nell'incubatrice a 37 °C fino all'uso (fase 6.4.9).
      NOTA: il supporto della coltura viene riutilizzato in quanto contiene diversi fattori secreti che supportano la redditività della coltura.
    4. Aggiungere 300 μL di siero ridotto preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra da 24 pozzetti nell'incubatrice.
    5. Preparare la soluzione A, costituita da DNA e mezzo ridotto al siero. Per ogni pozzetto, utilizzare un totale di 0,6 μg di DNA e aggiungerlo a 50 μL di terreno a ridotto siero. Conservare la soluzione A a temperatura ambiente fino all'uso.
      NOTA: in genere, viene considerato un triplice tecnico per condizione. Pertanto, viene preparata una miscela sufficiente per una reazione di 3,5 (ad esempio, 2,1 μg di DNA totale diluito in 175 μL di mezzo a ridotto siero) per garantire materiale sufficiente per trasfettare tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
    6. Preparare la soluzione B, composta dal reagente di trasfezione e dal mezzo a riduzione del siero. Per ogni pozzetto, aggiungere 0,75 μL di reagente di trasfezione a 50 μL di mezzo a riduzione del siero. Poiché questa soluzione è comune a tutte le condizioni di trasfezione, prepararla alla rinfusa per ridurre la variabilità tra le trasfezioni.
    7. Incubare la soluzione B a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere la soluzione B alla soluzione A goccia a goccia con un rapporto 1:1 e mescolare delicatamente. Non vortice. Incubare la soluzione A + B per 20-30 minuti a temperatura ambiente sotto il cofano.
    8. Ripetere i passaggi 6.4.5-6.4.7 per tutte le condizioni di trasfezione. Dopo 20-30 minuti, aggiungere la soluzione A+B a ciascun pozzetto goccia a goccia per un volume finale di 100 μL. Agitare delicatamente la piastra e riporre le cellule nell'incubatrice a 37 °C per 4 ore.
    9. Dopo 4 ore, rimuovere il mezzo di trasfezione e aggiungere 1 mL del mezzo condizionato dagli astrociti preriscaldato preparato al punto 6.4.3. Mantenere le celle per 36-48 ore prima di procedere con la sezione 7 o la sezione 8, a seconda dello scopo dell'esperimento.

7. Riprogrammazione degli astrociti (analisi di 7 giorni)

  1. Preparare il mezzo di differenziazione neuronale aggiungendo 1 mL di integratore B27 a 49 mL di terreno di coltura di base (vedere passo 1.4). Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate (vedere rispettivamente i passaggi 6.3 e 6.4), sostituire il mezzo astrocitario con 1 mL di mezzo di differenziazione neuronale per pozzo e cellule di coltura a 37 °C e 9% di CO2.
    NOTA: Le celle possono anche essere mantenute al 5% di CO2 se non è disponibile un incubatore a CO2 al 9%. Tuttavia, la riprogrammazione neuronale è più efficiente in queste condizioni.
  2. Facoltativo: Per aumentare l'efficienza di riprogrammazione, integrare il mezzo di differenziazione neuronale con Forskolin (concentrazione finale di 30 μM) e Dorsomorfina (concentrazione finale di 1 μM) quando si sostituisce il mezzo astrocitario al mezzo di differenziazione. Quando si sceglie di trattare le cellule con Forskolin e Dorsomorfina, fornire una seconda dose di Dorsomorfina 2 giorni dopo il trattamento iniziale. Aggiungere questo secondo trattamento direttamente al terreno di coltura.
  3. La riprogrammazione diretta degli astrociti murini in cellule neuronali avviene normalmente entro 7 giorni dal cambio del mezzo. Quindi, 7 giorni dopo l'inizio della riprogrammazione neuronale, fissare o raccogliere cellule per l'analisi a valle.

8. Riprogrammazione degli astrociti in neuroni maturi (colture a lungo termine)

  1. Preparare il mezzo di differenziazione neuronale aggiungendo 1 mL di integratore B27 a 49 mL di terreno di coltura di base (vedere passo 1.4). Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate (vedere rispettivamente i passaggi 6.3 e 6.4), sostituire il mezzo astrocitario con 1 mL di mezzo di differenziazione neuronale integrato con Forskolin (concentrazione finale di 30 μM) e Dorsomorfina (concentrazione finale di 1 μM) per pozzetto e cellule di coltura a 37 °C e 9% CO2.
    NOTA: Le celle possono anche essere mantenute al 5% di CO2 se non è disponibile un incubatore a CO2 al 9%. Tuttavia, la riprogrammazione neuronale è più efficiente in queste condizioni.
  2. Ripetere il trattamento con Dorsomorfina 2 giorni dopo il trattamento iniziale aggiungendolo direttamente al mezzo di differenziazione neuronale.
  3. Dopo 7 giorni dall'inizio della riprogrammazione neuronale, preparare il mezzo di maturazione aggiungendo 6 μL di N2, 1,2 μL di NT3 (stock 20 μg/mL), 1,2 μL di BDNF (stock 20 μg/mL), 1,2 μL di GDNF (stock 20 μg/mL) e 1,2 μL di cAMP (stock 100 mM) a 189,2 μL di mezzo di differenziazione neuronale. Integrare il mezzo di differenziazione neuronale presente in ciascun pozzetto con 200 μL di terreno di maturazione.
    NOTA: Il mezzo di maturazione viene integrato solo per il primo trattamento. Tutti i trattamenti successivi vengono eseguiti sostituendo parzialmente il mezzo di differenziazione neuronale come descritto di seguito.
  4. Ripetere il trattamento con piccole molecole rimuovendo 200 μL di mezzo di differenziazione neuronale e aggiungendo 200 μL di terreno di maturazione fresco due volte a settimana per un massimo di 6 settimane. Durante la maturazione, utilizzare le cellule per esperimenti elettrofisiologici (in genere, al giorno 21 o successivo) o fissare per l'analisi a valle (ad esempio, immunofluorescenza).

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Risultati

Le colture primarie di astrociti raggiungono tipicamente l'80% -90% di confluenza tra 7 e 10 giorni dopo lo smistamento e la placcatura MAC (Figura 1B). Generalmente, un singolo pallone di coltura T25 produce circa 1-1,5 x 106 cellule, che è sufficiente per 20-30 coverslip quando si seminano le cellule ad una densità di 5-5,5 x 104 cellule per pozzetto. Il giorno dopo la placcatura, le celle coprono in genere il 50%-60% della superficie del coverslip (

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Discussione

Le colture primarie di astrociti murini sono un notevole sistema modello in vitro per studiare la riprogrammazione neuronale diretta. Infatti, nonostante siano isolate in uno stadio postnatale, le cellule esprimono i tipici marcatori astrocitari29, mantengono l'espressione dei genipatterning 28,29 e mantengono la capacità di proliferare, simile agli astrociti in vivo ad un'età comparabiledi 38 anni...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Ines Mühlhahn per aver clonato i costrutti per la riprogrammazione, Paulina Chlebik per la produzione virale e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak per i commenti sul manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina/EDTALife Technologies25300054
4', 6-Diamidino-2-fenidolo, dilattato (DAPI)Sigma-AldrichD9564
anti-topo IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
anti-topo IgG1 BiotinaSouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-topo IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
anti-coniglio Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/MountPolysciencesCat# 18606-20
B27 SupplementoLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
Albumina di siero bovino (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
Siero fetale bovinoPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
GlucosioSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (reagente di trasfezione)Thermo FisherCat# 11668019
MACS Filtro SmartStrainer 70µ mMiltenyi Biotec130-098-462
Separatore MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
Kit MicroBeat anti-ACSA-2 per topiMiltenyi Biotec130-097-678
IgG1 di topo anti-sinaptofisina 1Sistemi sinaptici, Cat# 101 011 RRID:AB_887824)
IgG2b di topo anti-Tuj-1 (β ColonneSigma AldrichT8660
MSMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SupplementLife Technologies17502048
Kit di dissociazione del tessuto neurale...Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS SeparatoreMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM GlutaMAX (terreno a ridotto contenuto di siero)Thermo FisherCat# 51985-026
Penicillina/StreptomicinaLife Technologies15140122
Poli-D-lisinaSigma AldrichP1149
Coniglio anti-RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Coniglio anti-Sox9Sigma-AldrichCat# AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidina Alexa 405Thermo FisherGatto # S32351
Triton X-100Sigma-AldrichGatto # T9284

Riferimenti

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