Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Sunday Solomon Josiah; Nur Farah Meor Azlan; Asami Oguro-Ando; Jinwei Zhang

doi:10.3791/64179

Articolo metodologico

Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

DOI:

10.3791/64179

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9 dicembre 2022

Sunday Solomon Josiah¹ , Nur Farah Meor Azlan¹ , Asami Oguro-Ando¹ , Jinwei Zhang¹

¹Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

In questo articolo

Sommario

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Il presente protocollo evidenzia l'applicazione della tecnica western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2. Il protocollo descrive lo studio della fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007 tramite western blotting. Inoltre, ulteriori metodi per confermare l'attività di KCC2 sono brevemente evidenziati in questo testo.

Abstract

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I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl^- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è deleterio ed è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l'epilessia. Sono stati compiuti notevoli progressi per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolamentazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell'attività GABA). Qui, il protocollo evidenzia come studiare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi - Thr906 e Thr1007 - utilizzando la tecnica del western blotting. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro. Alcune di queste tecniche aggiuntive saranno brevemente discusse in questo manoscritto.

Introduzione

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I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl^- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica 1,2,3,4. Il mantenimento di una bassa concentrazione intraneuronale di Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM da parte di KCC2 facilita l'iperpolarizzazione dell'acido ^{γ-aminobutirrico} (G....

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Protocollo

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NOTA: Il protocollo descrive il metodo western blotting per rilevare specifiche proteine di interesse.

1. Coltura cellulare e trasfezione

Riscaldare tutti i reagenti nel bagno di perline (37 °C) prima della procedura di coltura cellulare. Preparare terreno di coltura, Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale, l'1% ciascuno di 2mM L-glutammina, 100x aminoacido non essenziale, 100 mM di piruvato di sodio e 100 unità / mL di penicillina-streptomicina.
Scongelare completamente le cellule KCC2b del rene embrionale umano KCC2b (HEK293^rnKCC2b)

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Risultati

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Qui, il risultato rappresentativo presentato in Figura 1 ha studiato l'impatto di staurosporina e NEM sulla fosforilazione mediata da WNK-SPAK/OSR1 di KCC2 e NKCC1 in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ utilizzando la tecnica western blotting. Dettagli completi sui risultati rappresentativi sono discussi in Zhang et ^al.15. Simile al NEM, la staurosporina è un ampio inibitore della chinasi ch.......

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Discussione

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Molti metodi sono stati utilizzati per misurare le attività di SLC12 delle CCC che sono espresse nei neuroni, tra cui KCC2. Molte di queste tecniche hanno dimostrato di migliorare le conoscenze scientifiche sull'analisi della rilevanza funzionale di questi trasportatori e dei loro modelli struttura-funzione in diverse mutazioni correlate alla malattia. Criticamente, ci sono vantaggi e avvertimenti per i vari metodi²¹. Tuttavia, il protocollo spiegato sopra, ha delineato come valutare la fosforilaz.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) e da una borsa di studio per il dottorato del Commonwealth.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
40% acrilammide	Sigma-Aldrich	A2917	Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
Ammonio Per Solfato	Sigma-Aldrich	248614	Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-topo	Tecnologia di segnalazione cellulare	66002	Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Università di Dundee	S763B	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-coniglio	Tecnologia di segnalazione cellulare	C29F4	Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-pecora	abcam	ab6900	Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-β-Tubulina III	Sigma-Aldrich	T8578	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Utilizzato come componente del tampone di lisi
Beta-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148	Utilizzato come componente del tampone di carico e del tampone di lisi
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Utilizzato per la quantificazione delle proteine del lisato
Apparecchio di colata	Atto	WSE-1165W	Utilizzato per eseguire l'elettroforesi della pagina SDS
Centrifuga	Eppendorf	5804	Utilizzato nella preparazione del lisato
Centrifuga	VWR	MicroStar 17R	Utilizzato per la filatura di campioni
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Utilizzato per esperimenti di coltura cellulare
Latte scremato essiccato	Marvel	N/A	Utilizzato per fare il blocco tampone
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Utilizzato per la coltura cellulare
Reagente ECL	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Utilizzato per sviluppare immagini per western blotting
EDTA Fisher	Scientific	D/0700/53	Utilizzato come componente del tampone di lisi
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Utilizzato come componente della lisi tampone
Elettroforesi Alimentatore	BioRad	PowerPAC HC	Per fornire energia per eseguire l'elettroforesi SDS-page
Etanolo	ThermoFisher	E/0650DF/17	Utilizzato per la preparazione di apparecchiature sterilizzate e ambiente
Fetale Siero bovino - inattivato a caldo	Merck Life Sciences UK	F9665	Utilizzato per la coltura cellulare
Fumehood	Walker	A7277	Utilizzato per la coltura cellulare
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Utilizzato nel western blotting per realizzare sandwich di trasferimento
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Utilizzato per creare tamponi
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Versione 6.0	Utilizzato per tracciare grafici e analizzare dati per western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Utilizzato per produrre gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
Blocco riscaldante	Grant	QBT1	Utilizzato per riscaldare i campioni di carico WB
Celle HEK293	Merck UK	12022001-1VL	Linea cellulare per esperimento di coltura
ImageJ Software	Wayne Rasband e collaboratori; NIH, Stati Uniti	ImageJ 1.53e	Utilizzato per misurare l'intensità di banda dalle immagini di western blotting
Sistema di imaging	BioRad	ChemiDoc MP	Utilizzato per acquisire immagini di western blotting
Incubatore		LEEC LEEC precision 190D	Utilizzato per colture cellulari
Isopropanolo	Honeywell	24137	Utilizzato nel gel di colata per elettroforesi
Soluzione di L-glutammina	Sigma-Aldrich	G7513	Utilizzato per colture cellulari
Litio dodecil solfato (LDS)	Novex	NP0008	Utilizzato come tampone di carico per il western blotting
MEM Amminoacido non essenziale	Merck Life Sciences UK	M7145	Utilizzato per la microcentrifuga per colture cellulari
	Eppendorf	5418	Utilizzato per la preparazione di lisati per
il lettore di micropiastre	BioRad	iMark	Utilizzato per la lettura della concentrazione di proteine del lisato
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Utilizzato per modificare le immagini di western blotting
Marcatore	di peso molecolareBioRad	1610373	Utilizzato per il western blotting
N-etilmaleimmide	Thermo Fisher Scientific	23030	Utilizzato per esperimenti di coltura cellulare
Membrana di nitrocellulosa	Fisher Scientific	45004091	Utilizzato per il western blotting
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122	Utilizzato per colture cellulari
PHmetro	Mettler Toledo	Seven compact s210	Utilizzato per monitorare il pH delle soluzioni tampone
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Utilizzato come componente del tampone di lisi
Soluzione salina tampone fosfato	Sigma-Aldrich	D8537	Utilizzato per colture cellulari
PKCδ pThr505	Tecnologia di segnalazione cellulare	9374	Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
Proteina G	Generon	PG50-00-0002	Utilizzato per l'immunoprecipitazione
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Utilizzato come componente del tampone di lavaggio
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Utilizzato per preparare il tampone TBS-T
Dodecil solfato di sodio	Sigma-Aldrich	L5750	Utilizzato per realizzare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
ortovanadato di sodio	Sigma-Aldrich	S6508	Utilizzato come componente del tampone di lisi
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	S8636	Utilizzato per colture cellulari
sodio-beta;-glicerofosfato	Merck UK	G9422	Utilizzato come componente del tampone di lisi
Staurosporina (da Streptomyces sp.	)Forniture di laboratorio scientifico, Regno Unito	S4400-1MG	Utilizzato per l'esperimento di coltura cellulare
Forniture di laboratorio scientifiche	saccarosio	S0389	Utilizzato come componente del tampone di lisi
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Utilizzato per realizzare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
Camera di trasferimento	BioRad	1658005EDU	Utilizzato nel western blotting per trasferire proteine sulla membrana
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Utilizzato come componente del tampone di lisi
Soluzione di tripsina-EDTA	Merck Life Sciences UK	T4049	Utilizzato per la coltura cellulare
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Utilizzato come pompa per vuoto tampone TBS-T
	Charles Austen	Dymax 5	Utilizzato per la coltura cellulare
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Utilizzato nella preparazione del campione
Miscelatore a vortice	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	Utilizzato per miscelare il campione risolto Bagno
d'acqua	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Utilizzato per incubare soluzioni

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
Heubl, M., et al.

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KCC2 Function Neuronal KCC2 Western Blotting KCC2 Phosphorylation Chloride Homeostasis GABAergic Inhibition Protein Quantification HEK293 Cells Kinase Regulatory Sites Protein Kinase C

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