Articolo metodologico

Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

DOI:

10.3791/64179

⸱

9 dicembre 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

In questo articolo

Sommario

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Il presente protocollo evidenzia l'applicazione della tecnica western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2. Il protocollo descrive lo studio della fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007 tramite western blotting. Inoltre, ulteriori metodi per confermare l'attività di KCC2 sono brevemente evidenziati in questo testo.

Abstract

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I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è deleterio ed è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l'epilessia. Sono stati compiuti notevoli progressi per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolamentazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell'attività GABA). Qui, il protocollo evidenzia come studiare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi - Thr906 e Thr1007 - utilizzando la tecnica del western blotting. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro. Alcune di queste tecniche aggiuntive saranno brevemente discusse in questo manoscritto.

Introduzione

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I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica 1,2,3,4. Il mantenimento di una bassa concentrazione intraneuronale di Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM da parte di KCC2 facilita l'iperpolarizzazione dell'acido γ-aminobutirrico (GABA)/glicina e l'inibizione sinaptica nel cervello e nel midollo spinale5. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l'epilessia4. Inoltre, la diminuzione dell'estrusione di Cl− mediata da KCC2 e le alterate correnti iperpolarizzanti GABAA e/o mediate dal recettore della glicina sono state implicate nell'epilessia, nel dolore neuropatico e nella spasticità 6,7. Il KCC2 neuronale è modulato negativamente attraverso la fosforilazione di residui regolatori chiave all'interno del suo dominio intracellulare C-terminaledal complesso di segnalazione della chinasi 1 senza lisina (WNK)-STE20/SPS1 correlato alla prolina/alanina (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), che facilita il mantenimento dell'attività depolarizzata del GABA nei neuroni immaturi 2,8,9 . Il WNK-SPAK/OSR1 fosforila i residui di treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e successivamente sottoregola l'espressione genica dell'mRNA di KCC2, portando ad un conseguente deterioramento della sua funzione fisiologica 8,10. Ancora più importante, tuttavia, è già un dato di fatto che il complesso chinasico WNK-SPAK/OSR1 è noto per fosforilare e inibire l'espressione di KCC2 1,2,4,11,12, e che l'inibizione delle vie di segnalazione del complesso chinasico al fosforilato Thr906/Thr1007 è stata collegata con l'aumentata espressione del gene mRNA KCC2 13,14,15 . È importante notare che la regolazione dell'espressione neuronale dei cotrasportatori KCC2 e Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) attraverso la fosforilazione proteica funziona in concomitanza e in pattern inversi 1,4,16.

Sono stati compiuti progressi consistenti e considerevoli per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell'attività GABA). Il protocollo qui presentato evidenzia l'applicazione di tecniche di western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K+-Cl- KCC2 studiando la fosforilazione del cotrasportatore nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007.

Western blot è un metodo utilizzato per rilevare specifiche proteine di interesse da un campione di tessuto o cellula. Questo metodo separa prima le proteine per dimensione attraverso l'elettroforesi. Le proteine vengono quindi trasferite elettroforeticamente su un supporto solido (di solito una membrana) prima che la proteina bersaglio venga marcata utilizzando un anticorpo specifico. Gli anticorpi sono coniugati a diversi tag o anticorpi coniugati con fluorofori che vengono rilevati utilizzando metodi colorimetrici, chemiluminescenza o fluorescenza. Ciò consente di rilevare una specifica proteina bersaglio da una miscela di proteine. Questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare i siti fosfospecifici di KCCs1 ed è stata utilizzata per identificare inibitori delle chinasi che inibiscono la fosforilazione di KCC3 Thr991/Thr104817. Seguendo questo protocollo, si può rilevare specificamente KCC2 totale e fosforilato da lisati cellulari/tissutali. In linea di principio, la rilevazione di anticorpi coniugati con proteine mediante questa tecnica è altamente strumentale in quanto aiuta a migliorare la comprensione delle attività cooperative nei fosfo-siti di KCC2, che fa luce sui meccanismi molecolari coinvolti nelle loro regolazioni fisiologiche. L'analisi quantitativa dell'espressione proteica totale è rappresentativa della funzione e dell'attività di KCC2. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro.

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Protocollo

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NOTA: Il protocollo descrive il metodo western blotting per rilevare specifiche proteine di interesse.

1. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Riscaldare tutti i reagenti nel bagno di perline (37 °C) prima della procedura di coltura cellulare. Preparare terreno di coltura, Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale, l'1% ciascuno di 2mM L-glutammina, 100x aminoacido non essenziale, 100 mM di piruvato di sodio e 100 unità / mL di penicillina-streptomicina.
  2. Scongelare completamente le cellule KCC2b del rene embrionale umano KCC2b (HEK293rnKCC2b)18 nel bagno di perline (37 °C). Trasferire le cellule dal tubo crioviale in una provetta da centrifuga contenente 5 ml di materiale fresco. Ruotare la cella a 1200 ×g per 3-5 minuti.
  3. Utilizzare una pipetta aspiratore (fissata a una pompa per vuoto) per aspirare il surnatante e aggiungere 10 ml di fluido fresco per risospendere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare su un piatto piatto da 10 cm.
  4. Mettere il piatto nell'incubatore e lasciarlo crescere per 48 ore a 37 °С in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Monitorare il periodo di incubazione per garantire una crescita cellulare sana. Dividere ulteriormente le cellule quando hanno raggiunto oltre il 90% di confluenza dopo il periodo di incubazione.
  5. Aspirare il vecchio mezzo dalla capsula delle cellule e sciacquare delicatamente le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 2 ml di tripsina e incubare per circa 1-2 minuti a temperatura ambiente.
  6. Utilizzare 2 ml di supporto completo per lavare delicatamente le cellule tripsinizzate nel piatto. Aggiungere 9 ml di supporti freschi ai nuovi piatti e aggiungere 1 mL di soluzione dal vecchio piatto a ciascuno di quelli nuovi. Trasferire nuovamente i piatti a cellule divise nell'incubatore per 48 ore per raggiungere ≥ confluenza del 90%.
  7. Trattare le cellule con dimetilsolfossido (DMSO) come controllo, 8 μM di staurosporina o 0,5 mM di N-etilmaleimmide (NEM) per 15 minuti prima di raccogliere le cellule nel tampone di lisi.

2. Preparazione di lisati cellulari e carico di campioni

  1. Aspirare il supporto sul piatto di coltura (dalle procedure di trasfezione). Posizionare la coltura cellulare su ghiaccio e lavare le cellule con PBS ghiacciato.
  2. Aspirare il PBS, quindi aggiungere 1,0 mL di tampone di lisi ghiacciato contenente 50 mM di tris-HCl (pH 7,5), 1 mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-tetraacetico (EGTA), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 50 mM di fluoruro di sodio, 5 mM di pirofosfato di sodio, 10 mM di sodio-β-glicerofosfato, 1 mM di ortovanadato di sodio, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M di saccarosio, 1 mM di benzamina, 0,1% (v/v) di 2-mercaptoetanolo e 2 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) al piatto.
    NOTA: Il volume del tampone di lisi durante la raccolta cellulare varia a seconda delle dimensioni del piatto, ad esempio, 1 ml di tampone di lisi è adatto per 1 x 107 celle / piatto da 100 mm / 150 cm 2 pallone, mentre 0,5 ml è adatto per 5 x 106 celle / piatto da 60 mm / 75 cm2 pallone.
  3. Utilizzare un raschietto a celle di plastica fredda per raschiare le cellule dal fondo del piatto, quindi utilizzare delicatamente una pipetta per trasferire la sospensione cellulare in un tubo di micro-centrifuga già sul ghiaccio. Agitare costantemente il tubo per 30 minuti a 4 °C.
  4. Far girare i lisati cellulari in una centrifuga fredda (4 °C) a 16.000 x g per 20 minuti, rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga e metterlo su ghiaccio. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco pre-raffreddato e scartare il pellet.
    NOTA: Potrebbe essere necessario variare la forza di centrifugazione e il tempo a seconda del tipo di cella. Tuttavia, le linee guida generali incoraggiano la centrifugazione a 16.000 x g per 20 minuti. Tuttavia, questo deve essere determinato per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule delicate come i leucociti hanno bisogno di una velocità di centrifugazione molto leggera.

3. Preparazione di immunoprecipitanti da lisati cellulari

  1. Pipettare 300 μL di proteina-G-sepharose in una provetta da microcentrifuga. Ruotare la soluzione a 500 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante.
  2. Aggiungere 500 μL di PBS e vortice bene la soluzione. Ruotare la soluzione a 500 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio.
  3. Mescolare 1 mg di anticorpi anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL di perle di proteina G-sepharose e portare il volume a 500 μL con PBS. Agitare su una piattaforma vibrante o ruota rotante per 2 ore a 4 °C. Lavare 2x con PBS.
  4. Effettuare la quantificazione proteica sui lisati cellulari interi e aggiungere 1 mg di lisato cellulare alle perle lavate. Incubare delicatamente in un rotatore end-to-end per 2 ore a 4 °C. Girare le perle e lavarle 3 volte con PBS contenente 150 mM di cloruro di sodio (NaCl).
  5. Lavare gli immunoprecipitanti (perline) 3x con 200 μL di PBS. Risospendere il pellet finale in 100 μL di tampone campione 1x litio dodecilsolfato (LDS).
  6. Agitare i tubi in uno shaker a rotore a temperatura ambiente per 5 minuti e incubarli in un blocco riscaldante a 75 °C per 10 minuti. Centrifugare il campione di carico a 11.000 x g per 2 minuti e utilizzare il surnatante per il caricamento del gel.

4. Esecuzione della macchia occidentale

  1. Montare l'apparecchio di colata e versare il gel separatore all'8% preparato al momento (vedere Tabella 1 per la ricetta/preparazione) per gettare il gel lasciando circa 2 cm di spazio dalla parte superiore del vetro di colata. Aggiungere 200 μL di isopropanolo assoluto alla configurazione e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 60 minuti.
    NOTA: La ricetta del gel di poliacrilammide per l'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) dipende dalla dimensione della proteina di interesse (Tabella 2). Quindi, prendere nota della dimensione della proteina prima di determinare la percentuale di gel desiderata.
  2. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'isopropanolo e sciacquare accuratamente il gel con circa 200 μL di acqua distillata. Aggiungere il gel impilabile al 6% appena preparato (vedere Tabella 1 per la ricetta/preparazione) per riempire lo spazio di circa 2 cm sulla configurazione del getto. Inserire delicatamente nel pettine e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
  3. Fissare il gel fuso nel serbatoio dell'elettroforesi.
  4. Sciogliere 30,3 g di Tris base, 144,1 g di glicina e 10 g di SDS in 1000 ml di acqua distillata per preparare 10x tampone di trasferimento. Preparare 1x tampone di funzionamento aggiungendo 10 ml di SDS al 10% e 100 ml di tampone di trasferimento 10x a 890 ml di acqua distillata.
  5. Versare 1x buffer di corsa nel serbatoio. Caricare 5 μL di marcatore di peso molecolare nel primo pozzetto e una quantità uguale di proteine in ciascun pozzetto del gel SDS-PAGE (tra 18-30 μL, a seconda della dimensione del pettine utilizzato). Riempire i pozzetti vuoti con 1x LDS e far funzionare il gel per circa 90-120 minuti a 120 V.
  6. Sciogliere 58,2 g di Tris base e 29,3 g di glicina in 1000 ml di acqua distillata per preparare 10x tampone di trasferimento. Attivare la membrana nitrocellulosa con 1x tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo. Risciacquare il gel e la membrana con il tampone di trasferimento e distribuirli delicatamente sulla pila di preparazione.
    NOTA: Non è necessario regolare il pH dei tamponi di corsa e di trasferimento in quanto dovrebbero essere al pH ottimale richiesto. Inoltre, è consigliabile preparare questi tamponi e conservarli a temperatura ambiente prima dell'esperimento per risparmiare tempo.
  7. Disporre il sandwich da trasferire in questo ordine: elettrodo negativo (cornice nera/fine) - schiuma sandwich - carta da filtro - gel SDS-PAGE risciacquato - membrana nitrocellulosa risciacquata - carta da filtro - schiuma sandwich - elettrodo positivo (cornice rossa). Impilare il sandwich assemblato nel serbatoio di trasferimento e funzionare a 90 V per 90 minuti o 30 V per 360 minuti.

5. Colorazione anticorpale e sviluppo dell'immagine

  1. Rimuovere la membrana e lasciarla asciugare. Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone bloccante a base di latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris contenente lo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Incubare le membrane con opportune diluizioni dell'anticorpo primario 8,15,19 e della beta-actina (controllo del carico) in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare la membrana in tre lavaggi da 1x TBS-T per 5 minuti ciascuno.
    NOTA: L'incubazione della membrana separata con controlli di carico come gli anticorpi beta-actina, alfa-tubulina o gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi serve a normalizzare gli altri risultati di western blotting durante la successiva quantificazione. La diluizione raccomandata per ciascun anticorpo primario è disponibile nel manuale del produttore.
  3. Incubare la membrana lavata con anticorpo secondario diluito 5000 volte in tampone bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare la membrana 3x in 1x TBS-T per 5 minuti ciascuno.
    NOTA: Si raccomanda vivamente che l'anticorpo secondario sia generato contro la specie in cui viene allevato l'anticorpo primario. Ad esempio, se l'anticorpo primario del KCC2 totale è l'anti-KCC2 del topo, è necessario utilizzare l'anticorpo secondario per l'antitopo.
  4. Posizionare la membrana lavata sulla scheda di imaging. Mescolare volumi uguali di ciascun reagente a chemiluminescenza potenziata (ECL) e distribuire delicatamente la soluzione miscelata sulla membrana per sviluppare segnali.

6. Acquisizione di immagini mediante un sistema di imaging e quantificazione dei dati

  1. Trasferire la scheda di imaging nello scomparto appropriato del sistema di imaging per l'imaging. Aprire il software di imaging sul computer per l'elaborazione delle immagini.
  2. Sulla barra degli strumenti, fare clic su Nuovo protocollo e scegliere Canale singolo. Fare clic su Seleziona nella finestra di dialogo di imaging/applicazione gel, scorrere fino a Traccia e selezionare Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. Quindi fare clic su Signal Accumulation Setup per impostare la durata e il numero di immagini da acquisire.
  3. Fare clic su Position Gel in Impostazione protocollo e regolare il gel nel sistema di imaging, se necessario. Fare clic su Esegui protocollo per acquisire le immagini.
  4. Fare clic con il pulsante destro del mouse su una delle immagini acquisite nella casella del catalogo immagini per salvare le immagini sul computer. Passare all'immagine desiderata e fare clic su Seleziona immagine e Continua nella finestra di dialogo Esegui.
  5. Fare clic sull'icona Trasformazione immagine per regolare il contrasto e la saturazione di pixel dell'immagine . Fare clic sull'icona Screenshot sulla barra degli strumenti generale per salvare l'immagine sul computer a seconda del formato di immagine desiderato.
  6. Misurare le densità di banda utilizzando il software ImageJ e analizzarle utilizzando opportuni strumenti statistici.

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Risultati

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Qui, il risultato rappresentativo presentato in Figura 1 ha studiato l'impatto di staurosporina e NEM sulla fosforilazione mediata da WNK-SPAK/OSR1 di KCC2 e NKCC1 in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizzando la tecnica western blotting. Dettagli completi sui risultati rappresentativi sono discussi in Zhang et al.15. Simile al NEM, la staurosporina è un ampio inibitore della chinasi ch...

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Discussione

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Molti metodi sono stati utilizzati per misurare le attività di SLC12 delle CCC che sono espresse nei neuroni, tra cui KCC2. Molte di queste tecniche hanno dimostrato di migliorare le conoscenze scientifiche sull'analisi della rilevanza funzionale di questi trasportatori e dei loro modelli struttura-funzione in diverse mutazioni correlate alla malattia. Criticamente, ci sono vantaggi e avvertimenti per i vari metodi21. Tuttavia, il protocollo spiegato sopra, ha delineato come valutare la fosforilaz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) e da una borsa di studio per il dottorato del Commonwealth.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
40% acrilammideSigma-AldrichA2917Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
Ammonio Per SolfatoSigma-Aldrich248614Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-topoTecnologia di segnalazione cellulare66002Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Università di DundeeS763BUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-coniglioTecnologia di segnalazione cellulareC29F4Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-pecoraabcamab6900Utilizzato come anticorpo secondario per il western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUtilizzato come anticorpo primario per il western blotting
anti-β-Tubulina IIISigma-AldrichT8578Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
BenzamineMerck UK135828Utilizzato come componente del tampone di lisi
Beta-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148Utilizzato come componente del tampone di carico e del tampone di lisi
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Utilizzato per la quantificazione delle proteine del lisato
Apparecchio di colataAtto WSE-1165WUtilizzato per eseguire l'elettroforesi della pagina SDS
CentrifugaEppendorf5804Utilizzato nella preparazione del lisato
CentrifugaVWRMicroStar 17RUtilizzato per la filatura di campioni
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUtilizzato per esperimenti di coltura cellulare
Latte scremato essiccatoMarvelN/AUtilizzato per fare il blocco tampone
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Utilizzato per la coltura cellulare
Reagente ECLPerkin ElmerORTT755/2655Utilizzato per sviluppare immagini per western blotting
EDTA FisherScientificD/0700/53Utilizzato come componente del tampone di lisi
EGTASigma-Aldriche4378Utilizzato come componente della lisi tampone
Elettroforesi AlimentatoreBioRadPowerPAC HCPer fornire energia per eseguire l'elettroforesi SDS-page
EtanoloThermoFisherE/0650DF/17Utilizzato per la preparazione di apparecchiature sterilizzate e ambiente
Fetale Siero bovino -  inattivato a caldoMerck Life Sciences UKF9665Utilizzato per la coltura cellulare
FumehoodWalkerA7277Utilizzato per la coltura cellulare
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Utilizzato nel western blotting per realizzare sandwich di trasferimento
GlycineSigma-Aldrich15527Utilizzato per creare tamponi
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersione 6.0Utilizzato per tracciare grafici e analizzare dati per  western blotting
HClAcros Organics10647282Utilizzato per produrre gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
Blocco riscaldanteGrantQBT1Utilizzato per riscaldare i campioni di carico WB
Celle HEK293Merck UK12022001-1VLLinea cellulare per esperimento di coltura
ImageJ SoftwareWayne Rasband e collaboratori; NIH, Stati Uniti ImageJ 1.53eUtilizzato per misurare l'intensità di banda dalle immagini di western blotting
Sistema di imagingBioRadChemiDoc MPUtilizzato per acquisire immagini di western blotting
IncubatoreLEEC LEEC precision 190DUtilizzato per colture cellulari
IsopropanoloHoneywell24137Utilizzato nel gel di colata per elettroforesi
Soluzione di L-glutamminaSigma-AldrichG7513Utilizzato per colture cellulari
Litio dodecil solfato (LDS)NovexNP0008Utilizzato come tampone di carico per il western blotting
MEM Amminoacido non essenziale Merck Life Sciences UKM7145Utilizzato per la microcentrifuga per colture cellulari
Eppendorf5418Utilizzato per la preparazione di lisati per
il lettore di micropiastreBioRadiMarkUtilizzato per la lettura della concentrazione di proteine del lisato
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Utilizzato per modificare le immagini di western blotting
Marcatoredi peso molecolareBioRad1610373Utilizzato per il western blotting
N-etilmaleimmideThermo Fisher Scientific23030Utilizzato per esperimenti di coltura cellulare
Membrana di nitrocellulosaFisher Scientific45004091Utilizzato per il western blotting
Penicillina-streptomicinaGibco15140122Utilizzato per colture cellulari
PHmetroMettler ToledoSeven compact s210Utilizzato per monitorare il pH delle soluzioni tampone
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)Sigma-AldrichP7626Utilizzato come componente del tampone di lisi
Soluzione salina tampone fosfatoSigma-AldrichD8537Utilizzato per colture cellulari
PKCδ pThr505Tecnologia di segnalazione cellulare9374Utilizzato come anticorpo primario per il western blotting
Proteina GGeneronPG50-00-0002Utilizzato per l'immunoprecipitazione
Cloruro di sodioSigma-AldrichS7653Utilizzato come componente del tampone di lavaggio
Cloruro di sodioSigma-AldrichS7653Utilizzato per preparare il tampone TBS-T
Dodecil solfato di sodioSigma-AldrichL5750Utilizzato per realizzare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
ortovanadato di sodioSigma-AldrichS6508Utilizzato come componente del tampone di lisi
Piruvato di sodioSigma-AldrichS8636Utilizzato per colture cellulari
sodio-beta;-glicerofosfatoMerck UKG9422Utilizzato come componente del tampone di lisi
Staurosporina (da Streptomyces sp.)Forniture di laboratorio scientifico, Regno UnitoS4400-1MGUtilizzato per l'esperimento di coltura cellulare
Forniture di laboratorio scientifichesaccarosioS0389Utilizzato come componente del tampone di lisi
TEMEDSigma-AldrichT7024Utilizzato per realizzare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
Camera di trasferimentoBioRad1658005EDUUtilizzato nel western blotting per trasferire proteine sulla membrana
TrisSigma-AldrichT6066Utilizzato per fare gel di separazione e impilamento per SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Utilizzato come componente del tampone di lisi
Soluzione di tripsina-EDTAMerck Life Sciences UKT4049Utilizzato per la coltura cellulare
Tween-20Sigma-AldrichP3179Utilizzato come pompa per vuoto tampone TBS-T
Charles AustenDymax 5Utilizzato per la coltura cellulare
VortexScientific IndustriesK-550-GEUtilizzato nella preparazione del campione
Miscelatore a vorticeScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUtilizzato per miscelare il campione risolto Bagno
d'acquaGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Utilizzato per incubare soluzioni
WB

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
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