Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.
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Articolo metodologico
Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis
In questo articolo
Sommario
Abstract
La mosca della frutta orientale, Bactrocera dorsalis, è una specie di parassiti altamente invasiva e adattativa che causa danni agli agrumi e ad oltre 150 altre colture da frutto in tutto il mondo. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le femmine depongono le uova sotto le bucce della frutta, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita di solito funzionano male sul campo. Con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento, molti scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell'ambiente. Questi includono RNAi o pesticidi basati sull'editing genetico che sottoregolano o silenziano i geni (bersagli molecolari), come i geni olfattivi coinvolti nel comportamento di ricerca, in vari insetti nocivi. Per adattare queste strategie per il controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale. I geni con funzioni critiche nella sopravvivenza e nella riproduzione di B. dorsalis servono come buoni bersagli molecolari per l'abbattimento e/o il silenziamento dei geni. Il sistema CRISPR / Cas9 è una tecnica affidabile utilizzata per l'editing genetico, specialmente negli insetti. Questo articolo presenta un metodo sistematico per la mutagenesi CRISPR/Cas9 di B. dorsalis, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l'iniezione di embrioni, l'allevamento di insetti e lo screening mutante. Questi protocolli serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.
Introduzione
La mosca orientale della frutta, Bactrocera dorsalis , è una specie cosmopolita di insetti nocivi che causa danni a oltre 150 specie di colture da frutto, tra cui guava, mango, Eugenia spp., ciliegia del Suriname, agrumi, nespolo e papaia1. I danni causati nella sola provincia del Guangdong (Cina) sono stimati in oltre 200 milioni di yuan. Le femmine adulte inseriscono le loro uova sotto la buccia dei frutti maturi o maturi, causando il decadimento e l'abscissione del frutto, che diminuisce la qualità dei frutti e la resa complessiva del raccolto2. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità....
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Protocollo
1. Progettazione del target e sintesi in vitro di sgRNA
- Prevedere la struttura dei geni bersaglio di interesse e determinare i confini tra esoni e introni tramite l'analisi bioinformatica del genoma di B. dorsalis (le applicazioni software utilizzate qui sono elencate nella Tabella dei materiali).
NOTA: BLAT20 è stato utilizzato per cercare potenziali loci genici nel genoma. Le letture di alta qualità dell'RNA-seq (trascrittoma) sono state allineate ai loci genici acquisiti utilizzando Hisat221. Samtools22 è stato utilizzat....
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Risultati
Questo protocollo presenta passaggi dettagliati per lo sviluppo di mutanti di B. dorsalis utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9, compresi i risultati rappresentativi della selezione del gDNA, la raccolta di embrioni e microiniezione, il mantenimento degli insetti e lo screening dei mutanti.
L'esempio del sito bersaglio del gene selezionato si trova nel terzo esone (Figura 1C). Questo sito è altamente conservato e una singola banda è stata rilevata media.......
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Discussione
Il sistema CRISPR / Cas9 è lo strumento di editing genetico più utilizzato e ha varie applicazioni, come il gene threpy30, il crop breeding 31 e gli studi di base sulle funzioni geniche32. Questo sistema è già stato applicato per l'editing genetico in varie specie di insetti ed è servito come strumento efficace per gli studi genetici funzionali nei parassiti. I protocolli che presentiamo qui standardizzano la procedura di progettazione e sintesi degl.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di scienza e tecnologia di Shenzhen (sovvenzione n. KQTD20180411143628272) e fondi speciali per l'innovazione della tecnologia scientifica e lo sviluppo industriale del nuovo distretto di Shenzhen Dapeng (sovvenzione n. PT202101-02).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6x tampone di caricamento del DNA | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Camera climatica artificiale | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Kit di miniestrazione del DNA genomico | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | Per la ricerca di potenziali loci genici nel genoma |
| Vetro capillare | WPI | 1B100F-4 | |
| Micromanipolatore Eppendorf InjectMan 4 | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| Kit di sintesi gRNA di precisione | GeneArt Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA Per | allineare il trascrittoma ai loci genici acquisiti |
| IGV | NA NA | Per visualizzare i risultati del Microgrinder Transdecoder | |
| NARISHIGE | EG-401 | ||
| Microscopio Olympus Olympus | Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Kit di clonazione | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Soluzione di rosso fenolo | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Libro di cucina per pipette 2018 P-97 & P-1000 Estrattori per micropipette | Azienda di strumenti | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA Per | generare i file bam ordinati |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Estrattore per micropipette Sutter Sutter | Società di strumenti | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA Per | combinare i risultati di assemblare le trascrizioni e le informazioni sui loci genici https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-tracce biologiche rivelatore | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Riferimenti
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. P....
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Ristampe e permessi
