Articolo metodologico

Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

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DOI:

10.3791/64196

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4 agosto 2022

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1TUM Medical Graduate Center, Technical University of Munich, 2Max Planck Institute of Neurobiology, 3TUM School of Medicine, Institute of Neuronal Cell Biology, Technical University of Munich, 4Munich Cluster for Systems Neurology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive la semina e la colorazione dei mitocondri neuronali in camere microfluidiche. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere consente il trattamento selettivo dei mitocondri negli assoni per analizzare le loro proprietà in risposta alle sfide farmacologiche senza influenzare il compartimento corporeo cellulare.

Abstract

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. La disfunzione mitocondriale è un fenotipo comune in molte malattie neurodegenerative. Data l'architettura elaborata e l'estrema lunghezza di alcuni assoni, non sorprende che i mitocondri negli assoni possano sperimentare ambienti diversi rispetto alle loro controparti del corpo cellulare. È interessante notare che la disfunzione dei mitocondri assonali spesso precede gli effetti sul corpo cellulare. Per modellare la disfunzione mitocondriale assonale in vitro, i dispositivi microfluidici consentono il trattamento dei mitocondri assonali senza influenzare i mitocondri somali. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere impedisce la diffusione delle molecole contro il gradiente, consentendo così l'analisi delle proprietà mitocondriali in risposta alle sfide farmacologiche locali all'interno degli assoni. L'attuale protocollo descrive la semina di neuroni ippocampali dissociati in dispositivi microfluidici, la colorazione con un colorante sensibile al potenziale di membrana, il trattamento con una tossina mitocondriale e la successiva analisi microscopica. Questo metodo versatile per studiare la biologia assonale può essere applicato a molte perturbazioni farmacologiche e letture di imaging ed è adatto a diversi sottotipi neuronali.

Introduzione

I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. Poiché la salute neuronale è intimamente legata alla funzione mitocondriale, non sorprende che la regolazione disfunzionale di questi organelli sia stata associata all'insorgenza di varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson1. Inoltre, l'intossicazione mitocondriale è stata utilizzata con successo per modellare i sintomi parkinsoniani negli animali2. Sia nei modelli animali che nelle malattie umane, la scomparsa dei neuroni inizia alle parti distali3,4, suggerendo che i mitocondri assonali potrebbero essere più suscettibili agli insulti. Tuttavia, la biologia dei mitocondri negli assoni non è ben compresa a causa delle difficoltà associate al trattamento mirato e all'analisi dei mitocondri assonali senza disturbi simultanei dei processi del corpo cellulare.

I recenti progressi nelle tecniche di coltura di neuroni dissociati in vitro consentono ora la separazione fluidica di assoni e corpi cellulari attraverso dispositivi microfluidici5. Come illustrato nella Figura 1A, questi dispositivi sono dotati di quattro pozzetti di accesso (a/h e c/i), con due canali che collegano ogni coppia (d e f). I grandi canali sono collegati tra loro da una serie di microcanali lunghi 450 μm (e). Le differenze intenzionali nei livelli di riempimento tra le due camere creano un gradiente di pressione del fluido (Figura 1B) che impedisce la diffusione di piccole molecole dal canale con un livello di fluido inferiore all'altro lato (Figura 1C, illustrata con colorante blu Trypan).

Recentemente abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici per studiare i requisiti di traduzione locale nella mitofagia assonale, la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati6. Nel presente protocollo, vengono presentati diversi passaggi per indurre danni mitocondriali locali attraverso il trattamento selettivo degli assoni utilizzando l'inibitore del complesso mitocondriale III Antimicina A 6,7.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti del governo dell'Alta Baviera. I neuroni primari sono stati preparati da E16.5 C57BL/6 embrioni di topo wild-type di entrambi i sessi seguendo metodi standard come precedentemente descritto6.

1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico

  1. Rivestire una piastra di coltura tissutale con fondo di vetro a sei pozzetti con una concentrazione finale di 20 μg/ml di poli-D-lisina e 3,4 μg/ml di laminina in PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) (vedere Tabella dei materiali).
  2. Incubare la piastra rivestita durante la notte al buio a temperatura ambiente.
    NOTA: Il rivestimento può essere eseguito anche a 37 °C per 1-2 h. La scelta del rivestimento dipende dal tipo di cella utilizzato.
  3. Dopo il rivestimento, portare le piastre a sei pozzetti sul cappuccio sterile e lavarle due volte conddH 2O sterile.
    NOTA: Non lavare con tamponi contenenti sale come PBS, poiché i cristalli di sale interferiscono con la formazione delle guarnizioni.
  4. Lasciare asciugare la piastra in posizione inclinata per 3-5 minuti. Rimuovere l'acqua in eccesso mediante aspirazione sottovuoto o pipettaggio.
  5. Immergere la camera microfluidica in etanolo all'80%.
    NOTA: La camera microfluidica è stata ottenuta da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
  6. Lasciare asciugare la camera microfluidica per 3-5 minuti in posizione inclinata. Rimuovere l'etanolo in eccesso mediante vuoto, aspirazione o pipettaggio.
  7. Quando è completamente asciutto, posizionare la camera microfluidica al centro del pozzetto.
    NOTA: La formazione della guarnizione può essere osservata come un cambiamento nelle proprietà riflettenti per esclusione dell'aria dall'interfaccia tra la piastra e il dispositivo in silicone. Sia la piastra che la camera microfluidica devono essere completamente asciutte prima del montaggio per creare una buona tenuta. Tuttavia, il tempo di asciugatura deve essere ridotto al minimo il più possibile per garantire una corretta aderenza alle cellule. Pertanto, i pozzetti e le camere devono essere ispezionati visivamente per le goccioline liquide rimanenti. Se non sono visibili goccioline, assemblare immediatamente le camere.
  8. Picchiettare delicatamente la camera microfluidica ai bordi e la sezione microsolco al centro per un corretto fissaggio alla lastra di vetro.

2. Semina e mantenimento dei neuroni

  1. Raccogliere il numero desiderato di neuroni ippocampali dissociati per camera in una provetta di reazione da 1,5 ml.
    NOTA: Per il presente studio, 1,5 x 105 neuroni sono stati seminati per dispositivo per applicazioni basate sull'imaging.
  2. Centrifugare i neuroni a 1000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
  3. Eliminare il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in 8 μL di terreno B27-Neurobasale (vedere Tabella dei materiali).
  4. Pipettare la soluzione cellulare nell'ingresso del canale della camera microfluidica (b in Figura 1A).
  5. Toccare il retro della piastra per facilitare il flusso attraverso il canale.
    NOTA: il tocco può essere eseguito con forza senza preoccuparsi che il sigillo si rompa.
  6. Aspirare con una pipetta qualsiasi sospensione di cella residua all'uscita del canale (g nella Figura 1A) per ridurre il numero di celle all'esterno del canale.
  7. Incubare la camera microfluidica con cellule per 15-20 minuti a 37 °C e 5% CO2.
  8. Riempire il pozzetto assonale superiore con 50 μL di B27-Neurobasale media in (c in Figura 1A).
  9. Toccare il retro della piastra per facilitare il flusso attraverso il canale.
  10. Riempire i pozzetti sul lato soma (a e h in Figura 1A) con 150 μL di mezzo B27-Neurobasale ciascuno, creando una bolla di tensione sulla parte superiore. Il volume della bolla è di circa 20 μL.
    NOTA: La creazione di una bolla di tensione non è necessaria per ottenere l'isolamento fluidico, ma fornisce una visione chiara del volume più elevato sul lato soma.
  11. Riempire entrambi i pozzetti del lato assonale (c e i in Figura 1A) con 100 μL di B27-Neurobasale media ciascuno.
    NOTA: Per promuovere la crescita assonale attraverso i microsolchi, si raccomanda che i pozzetti sul lato soma contengano più mezzi rispetto ai pozzetti sul lato assone. Tuttavia, gli assoni cresceranno per caso attraverso i microsolchi anche senza differenze di volume.
  12. Incubare la camera microfluidica a 37 °C e 5% CO2 per 7-8 giorni.
    NOTA: La crescita degli assoni nella camera assonale di solito può essere osservata a partire dal giorno in vitro (DIV) 5. Tempi di coltura più lunghi sono possibili se si desiderano culture più mature.
  13. Nutrire i neuroni ogni 2-3 giorni rimuovendo il mezzo dai due pozzetti superiori (a e c) e sostituendolo con un mezzo B27-Neurobasale fresco fino a formare una bolla di tensione.

3. Colorazione con colorante sensibile alla membrana mitocondriale

  1. A DIV 7-8, valutare che gli assoni sono cresciuti attraverso i microsolchi e si estendono nel compartimento assonale sotto un microscopio ottico.
    NOTA: Sono possibili anche diverse fasi DIV a seconda dell'età desiderata.
  2. Eseguire due lavaggi con mezzo di imaging preriscaldato (37 °C) rimuovendo il mezzo B27-Neurobasale da tutti i pozzetti e aggiungendo circa 100 μL del mezzo di imaging ai pozzetti superiori di entrambi i canali assonale e soma (a e c). Lascia che il mezzo fluisca attraverso i pozzi inferiori (h e i).
    1. Rimuovere il terreno dai pozzetti inferiori e qualsiasi mezzo rimanente nei pozzetti superiori e ripetere con terreno fresco, lasciando i pozzetti vuoti alla fine del lavaggio.
      NOTA: A causa dell'elevata forza capillare nei canali (d e f), ci sarà un mezzo di lavaggio rimanente nei canali che non deve essere rimosso per evitare che i neuroni si secchino. Qui può essere utilizzato qualsiasi mezzo di imaging privo di rosso fenolo, ad esempio Hibernate E (vedi Tabella dei materiali). Se il microscopio non è configurato con un'alimentazione di CO 2, assicurarsi che il mezzo di imaging utilizzi un sistema tampone alternativo al carbonato/CO2 (ad esempio, HEPES)8.
  3. Diluire 1 mM di estere etilico tetrametilrodamina (TMRE, rosso; vedere la tabella dei materiali) a 5 nM nel mezzo di imaging.
    NOTA: Non superare l'1% di DMSO nella diluizione finale per evitare tossicità.
  4. Aggiungere 100 μL della diluizione TMRE 5 nM ai pozzetti somatici e assonali superiori (a e c) e lasciare che il mezzo fluisca attraverso entrambi i compartimenti somatici e assonale fino a quando non c'è un volume uguale in tutti i pozzetti. Riempire con il supporto contenente TMRE.
  5. Rimettere i neuroni in una camera ad ambiente controllato (37 °C e 5% CO2) per 25 minuti.
  6. Eseguire due lavaggi con il mezzo di imaging preriscaldato (37 °C) come descritto in precedenza (fase 3.2). All'ultimo lavaggio, riempire con 100 μL in ciascun pozzetto e creare una bolla di tensione del mezzo sui pozzetti somatici (a e c).

4. Imaging delle cellule vive

NOTA: Le immagini fisse mostrate sono state acquisite su un microscopio confocale a disco rotante, utilizzando un obiettivo ad immersione 40x NA 1.25 (vedi Tabella dei materiali). Sono stati scelti un tempo di esposizione di 200 ms e una potenza laser del 10% per il canale rosso e un tempo di esposizione di 500 ms per il campo chiaro. Tuttavia, i normali microscopi invertiti confocali o a largo campo possono essere utilizzati anche per studiare l'intensità della TMRE.

  1. Immagina le cellule con un microscopio invertito.
  2. Assicurarsi che il microscopio sia dotato di un incubatore a stadio per mantenere la coltura neuronale a 37 °C durante l'esperimento.
  3. Seleziona una regione di interesse nel compartimento somatico e seguila attraverso i microsolchi nel compartimento assonale. Assicurarsi che i microsolchi ripresi corrispondano a quelli nei compartimenti somatico e assonale (per facilitare il confronto di base e post-trattamento).
  4. Cattura immagini di fluorescenza utilizzando l'eccitazione a 561 nm e l'emissione a 625 nm per il segnale di fluorescenza rossa.
  5. Acquisisci le immagini.
  6. Per indurre la depolarizzazione mitocondriale, aggiungere 20 μM di antimicina A (vedere Tabella dei materiali) nel mezzo di imaging al compartimento assonale. Per garantire una differenza di volume tra il soma e le camere assonali, controllare la presenza di una bolla di tensione sul lato somatico (uguale al volume >110 μL).
    1. Rimuovere tutti i supporti di imaging dal pozzetto inferiore del lato assonale (i), ad eccezione del mezzo all'interno del canale (f). Aggiungere 160 μL di 20 μM di antimicina A al pozzetto assonale superiore (c) e lasciarlo fluire attraverso il canale fino a quando non c'è un volume uguale in entrambi i pozzetti assonali. I volumi nei pozzetti assonali sono di circa 80 μL per pozzetto.
      NOTA: Assicurarsi che il volume nei pozzetti assonale sia inferiore rispetto ai pozzetti somatici per garantire una corretta pressione del fluido. Si raccomanda una differenza di almeno 10 μL (10% del volume del pozzo), ma sono possibili anche differenze più elevate.
  7. Incubare i neuroni nella camera dell'ambiente controllato (37 °C) per 20-30 minuti.
  8. Ripetere l'imaging come descritto sopra (fasi 4.3-4.5). Assicurarsi che vengano visualizzate le stesse posizioni (facilmente identificabili dai microsolchi) come durante l'acquisizione della linea di base.

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Risultati

I neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici per 7-8 giorni prima che i mitocondri fossero colorati con il colorante sensibile alla membrana (TMRE) per 25 minuti in entrambi i canali. Come mostrato nella Figura 2A, questo ha prodotto una colorazione omogenea dei mitocondri su entrambi i lati dei microsolchi, ma era insufficiente per equilibrare la colorazione nel mezzo dei microsolchi. Dopo l'aggiunta di Antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali ha...

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Discussione

Il presente protocollo descrive un metodo per seminare e coltivare neuroni ippocampali dissociati in un dispositivo microfluidico per trattare separatamente i mitocondri assonali. L'utilità di questo approccio con il colorante sensibile alla membrana TMRE e l'inibitore III complesso Antimicina A (come precedentemente dimostrato7) è dimostrata qui, ma questo metodo può essere facilmente adattato ad altri coloranti mitocondriali o sensori geneticamente codificati di funzioni mitocondriali che consen...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e dalla Max Planck Society.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra inferiore in vetro a 6 pozzettiCellvisP06.1.5H-NDispositivo in silicone
Antimicina ASigmaA8674
B27Gibco17504044
EVOS M5000 microscopio a campo largoThermofischer ScientificEVOS M5000microscopio digitale a campo largo completamente integrato
Hibernate EBrainBitsHE500
Disco rotante invertito confocaleNikonTI2-E + CSU-W1Con camera incubatrice
LamininInvitrogenL2020
Dispositivi microfluidiciXONA microfluidicaRD450
Medium neurobasaleGibco21103049
Poli-D-lisinaSigmaP2636
TMRESigma87917

Riferimenti

  1. Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663(2021).
  2. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
  3. Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
  4. Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
  5. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  6. Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
  7. Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
  8. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
  9. Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
  10. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
  11. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).

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