Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere le conseguenze metaboliche delle interazioni microbiche che si verificano durante l'infezione rappresenta una sfida unica nel campo dell'imaging biomedico. La spettrometria di massa con imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) rappresenta una modalità di imaging in situ senza etichetta in grado di generare mappe spaziali per un'ampia varietà di metaboliti. Mentre i campioni di tessuto sottilmente sezionati vengono ora analizzati di routine tramite questa tecnologia, le analisi di spettrometria di massa di imaging di substrati non tradizionali, come le colonie batteriche comunemente coltivate su agar nella ricerca microbiologica, rimangono impegnative a causa dell'elevato contenuto di acqua e della topografia irregolare di questi campioni. Questo documento illustra un flusso di lavoro di preparazione dei campioni per consentire l'analisi di spettrometria di massa di imaging di questi tipi di campioni. Questo processo è esemplificato utilizzando macrocolonie di co-coltura batterica di due patogeni gastrointestinali: Clostridioides difficile e Enterococcus faecalis. Lo studio delle interazioni microbiche in questo ambiente di agar ben definito ha anche dimostrato di integrare gli studi sui tessuti volti a comprendere la cooperazione metabolica microbica tra questi due organismi patogeni in modelli murini di infezione. Le analisi di spettrometria di massa per immagini dei metaboliti aminoacidici arginina e ornitina sono presentate come dati rappresentativi. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri analiti, patogeni microbici o malattie e tipi di tessuto in cui è richiesta una misura spaziale della biochimica cellulare o tissutale.
Introduzione
Il microbioma umano è un ecosistema altamente dinamico che coinvolge interazioni molecolari di batteri, virus, archea e altri eucarioti microbici. Mentre le relazioni microbiche sono state intensamente studiate negli ultimi anni, molto resta da capire sui processi microbici a livello chimico 1,2. Ciò è in parte dovuto all'indisponibilità di strumenti in grado di misurare con precisione ambienti microbici complessi. I progressi nel campo della spettrometria di massa per immagini (IMS) nell'ultimo decennio hanno permesso la mappatura spaziale in situ e label-free di molti metaboliti, lipidi e proteine i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico di Filadelfia e dalla Perelman School of Medicine dell'Università della Pennsylvania (protocolli IAC 18-001316 e 806279).
ATTENZIONE: Clostridium difficile (C. difficile) e Enterococcus faecalis (E. faecalis) sono patogeni BSLII e devono essere maneggiati con estrema cautela. Utilizzare protocolli di decontaminazione adeguati quando necessario.
1. Crescita di macrocolonie di coltura batterica e preparazione per la spedizione durante la notte
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo eseguito la spettrometria di massa con imaging MALDI di colonie batteriche modello e topi co-colonizzati con E. faecalis e C. difficile per studiare il ruolo degli amminoacidi nelle interazioni microbo-microbo. Le macrocolonie batteriche coltivate su agar fungono da modello ben definito per analizzare i cambiamenti biochimici distinti nella formazione del biofilm batterico. È importante garantire un processo di essiccazione controllato per le macrocolonie di coltura batterica coltivate su terren.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Durante la spettrometria di massa per imaging MALDI, è importante disporre di una superficie piana del campione per fornire un diametro focale costante del laser MALDI incidente sul substrato del campione. Le deviazioni nell'altezza del campione possono causare lo spostamento del raggio laser MALDI fuori fuoco, causando alterazioni del diametro e dell'intensità del fascio, che possono influire sull'efficienza della ionizzazione MALDI. Queste alterazioni nell'efficienza di ionizzazione possono provocare differenze nell'in.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) con il premio GM138660. J.T.S. è stato sostenuto dalla Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship dell'Università della Florida. J.P.Z. è stato supportato dalle sovvenzioni NIH K22AI7220 (NIAID) e R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. è stato supportato dal Cell and Molecular Biology Training Grant presso l'Università della Pennsylvania (T32GM07229).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Filtri per siringhe in nylon Titan3 | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diamminonaftalene matrice MALDI | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock siringhe | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| Vacuometro a convezione serie 275i | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| spettrometro di massa 7T solariX FTICR dotato di sistema laser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Soluzione di acido acetico, adatto per HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, adatto per HPLC, grado gradiente, ≥ 99,9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| , 28% NH3 in H2O, ≥ 99,99% di metalli in tracce | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Sacchetti autoclavabili per il trasporto di campioni a rischio biologico: 55 galloni | Grainger | 45TV10 | |
| Sacchetti per il trasporto di campioni a rischio biologico (8 x 8 pollici) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brodo per infusione di cuore cerebrale | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 topi maschi | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II scanner di foto e documenti | Canon | ||
| CM 3050S criomicrotomo di ricerca | Leica Biosystems | ||
| Armadio essiccatore | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Graffiatore a punta di diamante, Microscopia elettronica Scienze | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Pellet essiccante Drierite | Drierite | 21005 | |
| Etanolo, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging Software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsSoftware di controllo | Bruker Daltonics | ||
| Trappola sottovuoto in vetro | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| Spruzzatore robotizzato HTX M5 TM | HTX Technologies | ||
| Vetrini per microscopio rivestiti in ossido di indio e stagno (ITO) | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| Filtro HEPA in linea per pompa a vuoto | LABCONCO | 7386500 | |
| Metanolo, grado HPLC Fisher | Chemical | 67-56-1 | |
| MTP adattatore per vetrini II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Composto per temperatura di taglio ottimale (OCT) | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicida, disinfettante e detergente | CONTEC | CR85335 | |
| Vetrini stampati in PTFE (Teflon), Microscopia elettronica | Scienze VWR | 100488-874 | |
| Pompa per vuoto rotativa a palette RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Monouso ad alto profilo Lame per microtomo Microscopia | elettronica | Scienze 63068-HP | |
| Tubo a vuoto trasparente | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 olio per pompe a vuoto | Edwards | H11025011 | |
| Trasformatore a tensione variabile | Powerstat | ||
| Water, adatto per HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Pallone dewar a bocca larga | Sigma | Aldrich Z120790 |
Riferimenti
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexan....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
