C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

Sommario

Questo è un metodo comunemente usato per la dissezione delle gonadi di C. elegans seguita da crack congelato, che produce campioni della linea germinale per l'immunofluorescenza tramite colorazione anticorpale o per la semplice colorazione DAPI per visualizzare il DNA. Questo protocollo ha avuto successo per gli studenti universitari in un laboratorio di ricerca e in un'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.

Abstract

La linea germinale di C. elegans è un modello eccellente per lo studio della meiosi, in parte grazie alla facilità di condurre analisi citologiche su animali sezionati. I preparati a montatura intera preservano la struttura dei nuclei meiotici e, soprattutto, ogni braccio gonade contiene tutti gli stadi della meiosi, organizzati in una progressione temporale-spaziale che rende facile identificare i nuclei in diversi stadi. Gli ermafroditi adulti hanno due braccia gonadi, ciascuna organizzata come un tubo chiuso con cellule staminali germinali proliferanti all'estremità chiusa distale e ovociti cellularizzati all'estremità aperta prossimale, che si uniscono al centro dell'utero. La dissezione rilascia uno o entrambi i bracci gonadi dalla cavità corporea, consentendo di visualizzare l'intera meiosi. Qui viene presentato un protocollo comune per l'immunofluorescenza contro una proteina di interesse, seguito dalla colorazione DAPI per marcare tutti i cromosomi. I giovani adulti vengono immobilizzati in levamisolo e rapidamente sezionati usando due aghi da siringa. Dopo l'estrusione della linea germinale, il campione viene fissato prima di subire una fessura di congelamento in azoto liquido, che aiuta a permeabilizzare la cuticola e altri tessuti. Il campione può quindi essere disidratato in etanolo, reidratato e incubato con anticorpi primari e secondari. DAPI viene aggiunto al campione nel supporto di montaggio, che consente una visualizzazione affidabile del DNA e rende facile trovare animali da visualizzare al microscopio fluorescente. Questa tecnica è prontamente adottata da coloro che hanno familiarità con la manipolazione di C. elegans dopo alcune ore trascorse a praticare il metodo di dissezione stesso. Questo protocollo è stato insegnato a studenti delle scuole superiori e universitari che lavorano in un laboratorio di ricerca e incorporato in un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi presso un college di arti liberali.

Introduzione

La meiosi è la divisione cellulare specializzata utilizzata per creare gameti (uova e spermatozoi/polline) in tutti gli organismi sessualmente riproduttori ^1,2. La ricombinazione crossover è lo scambio reciproco di DNA tra cromosomi omologhi; È essenziale per la meiosi, fornendo un'importante fonte di diversità genetica e promuovendo la stabilità del genoma attraverso le generazioni. I cromosomi che non riescono a formare almeno un crossover durante la meiosi segregheranno in modo casuale, il che può comportare la non disgiunzione cromosomica, creando gameti con il numero errato di cromosomi - una condizione che di solito è fatale per la progenie risultante³. Durante la meiosi, i crossover sono indotti da rotture programmate del DNA a doppio filamento⁴. Un sottoinsieme di queste rotture sarà riparato come crossover che forniscono collegamenti fisici di DNA, chiamati chiasmata, che aiutano a orientare i cromosomi omologhi in preparazione della divisione cellulare⁵. Gli stadi meiotici sono altamente conservati in tutti gli eucarioti e la loro conformazione cromosomica consente di identificarli facilmente.

Come concetto fondamentale in biologia, la meiosi è un argomento che gli studenti incontrano più volte in diversi corsi di biologia. Sono spesso introdotti alla meccanica della segregazione cromosomica meiotica al liceo, mentre i corsi di livello universitario si concentrano sulla biologia cellulare della segregazione e sull'impatto genetico della ricombinazione crossover. Tuttavia, la meiosi è un concetto notoriamente complicato per molti studenti¹. L'incapacità di comprendere la relazione tra geni, DNA, cromosomi e meiosi può generare idee sbagliate e lacune nella comprensione degli studenti che impediscono una piena comprensione dell'eredità genetica ^6,7. Un modo per migliorare la comprensione degli studenti degli argomenti astratti è fornire attività concrete e pratiche. Ad esempio, quando insegnano la meiosi, gli istruttori possono scegliere tra attività che emulano l'analisi molecolare⁸, modelli 3D che consentono agli studenti di manipolare le molecole⁹ o giochi di ruolo in cui gli studenti stessi recitano la coreografia molecolare¹. Incorporare la ricerca con risultati sconosciuti è un modo particolarmente efficace per migliorare la comprensione degli studenti. Questa pratica è nota come esperienza di ricerca universitaria basata sul corso (CURE) e ha l'ulteriore vantaggio di rafforzare gli atteggiamenti e l'agenzia degli studenti, specialmente per coloro che appartengono a gruppi che rimangono sottorappresentati in STEM^10,11. Il verme nematode Caenorhabditis elegans è particolarmente adatto per studi in classe di comportamento, fertilità e incroci genetici ed è un modello efficace per introdurre gli studenti alla ricerca biologica¹².

C. elegans costituisce un potente organismo modello per la biologia cellulare combinando la genetica molecolare con una semplice analisi citologica. È anche particolarmente adatto per l'uso in un'aula di biologia ^13,14,15. Sono facili ed economici da mantenere in laboratorio, producendo centinaia di progenie ogni 3 giorni, sia a temperatura ambiente standard che a 20 °C, la temperatura di incubazione più comune. È importante sottolineare che possono essere congelati come scorte di glicerolo e conservati in un congelatore a -80 °C, il che significa che eventuali errori di allevamento commessi da ricercatori alle prime armi possono essere facilmente corretti¹⁶. Inoltre, il suo genoma ben annotato consente tecniche genetiche avanti e inversa^17,18, consentendo a C. elegans di essere utilizzato per affrontare questioni biologiche che vanno dal molecolare all'evolutivo. Infine, i ricercatori di C. elegans hanno creato una comunità solidale che è spesso disposta a fornire aiuto e consigli agli scienziati in erba¹⁹. Questi vantaggi hanno portato all'incorporazione di C. elegans in un certo numero di CURE in vari tipi di istituzioni 12,19,20,21,22,23.

Oltre ai suoi benefici per la ricerca e l'insegnamento, C. elegans è diventato un modello popolare per gli studi sulla meiosi e sullo sviluppo della linea germinale^24,25,26. La chiarezza ottica di questi animali semplifica gli approcci citologici²⁷ e, negli adulti, le gonadi rappresentano quasi la metà dell'animale, fornendo centinaia di cellule meiotiche da studiare. Nelle gonadi, i nuclei meiotici della linea germinale sono disposti come una catena di montaggio (Figura 1); La replicazione mitotica avviene sulla punta distale della gonade, con i nuclei che progrediscono attraverso stadi meiotici mentre migrano verso l'estremità prossimale della gonade, dove gli embrioni fecondati emergono dalla vulva. Poiché l'organizzazione spaziale stereotipata rappresenta anche una progressione temporale attraverso la meiosi, diversi stadi possono essere facilmente identificati in base alla loro organizzazione cromosomica e alla posizione nella gonade. Infine, i processi che interrompono la meiosi e causano aneuploidie creano fenotipi che sono semplici da caratterizzare, anche per i novizi: sterilità, letalità embrionale o un'alta incidenza di maschi (fenotipo Him)²⁸.

Questo è un semplice protocollo per visualizzare i cromosomi meiotici in C. elegans. Il montaggio, la dissezione, il fissaggio e la colorazione degli anticorpi vengono eseguiti tutti sullo stesso vetrino da microscopio, il che semplifica il protocollo e consente un recupero quasi perfetto del campione. Questo metodo funziona per una semplice colorazione DAPI per visualizzare i cromosomi e può essere utilizzato per l'immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine nella gonade. Gli studenti sezionano le gonadi usando microscopi da dissezione di base, generano preparati a montaggio intero per la visualizzazione del DNA o dell'immunofluorescenza e li visualizzano su un microscopio fluorescente composto. Questo protocollo è stato insegnato a studenti delle scuole superiori e studenti universitari che lavorano in un laboratorio di ricerca di C. elegans e incorporato in un CURE in un college di arti liberali¹². Sebbene il CURE avesse una dimensione relativamente piccola delle classi, questo protocollo sarebbe stato disponibile per le classi in una serie di istituzioni a causa del costo relativamente basso dei ceppi di vermi e dei reagenti. Gli istruttori sarebbero limitati solo dal numero di microscopi da dissezione disponibili per l'uso. La precedente implementazione prevedeva che gli studenti lavorassero in gruppi di tre per condividere un singolo microscopio e si svolgeva in tre sessioni di 90 minuti: la prima per praticare la dissezione, la seconda per implementare la dissezione e la colorazione DAPI e la terza per visualizzare diapositive su un microscopio a fluorescenza a campo largo. La partecipazione alla ricerca universitaria offre molti vantaggi per gli studenti^11,29, sia accademici che personali. L'integrazione della ricerca nei corsi tramite CURE consente agli studenti di partecipare alla ricerca durante il normale orario di lezione^11,30,31, il che rende l'esposizione a questi benefici più accessibile ed equa.

Protocollo

1. Allevamento di C. elegans

NOTA: Vedere C. elegans maintenance protocol¹⁶ e Elgin et al.32 per maggiori dettagli. I ceppi di C. elegans possono essere facilmente acquisiti dal Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) e vengono spediti tramite posta ordinaria in qualsiasi località negli Stati Uniti. Ogni ceppo costa $ 10 e ogni laboratorio / utente paga una quota annuale di $ 30.

1. Utilizzando una tecnica sterile, preparare piastre di agar con mezzo di crescita nematode da 6 cm (piastre di agar NGM).
   NOTA: Le piastre versate possono essere conservate capovolte nei loro manicotti di plastica originali o contenitori ermetici a 4 °C per diversi mesi.
   1. Per preparare le piastre di agar NGM, aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone di Bacto, 20 g di agar NGM e ddH₂O a 1 L (~975 ml). Autoclavare il fluido utilizzando un ciclo liquido che mantiene a 121 °C per 20 minuti. Lasciare raffreddare a 55 °C e, con tecnica sterile, aggiungere 1 mL di colesterolo, 0,5 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄ e 25 mL di tampone fosfato di potassio 1 M (pH 6).
      NOTA: Per ottenere 1 M tampone fosfato di potassio, mescolare 108,3 g di KH 2 PO 4(monobasico) e 35,6 g di K₂HPO₄ (bibasico); se necessario, regolare il pH a 6 usando KOH. Aggiungere ddH₂O fino a 1 L (di solito ~900 mL) e autoclavare per 40 minuti a 121 °C. 1 L di NGM produce circa 100 piastre contenenti 10 ml ciascuna.
2. Utilizzando un pipet sierologico o di trasferimento, individuare le piastre con tre gocce di colture batteriche di E.coli OP50 (~150 μL). Cerca di individuare al centro della piastra ed evita di posizionare punti troppo vicini ai bordi della piastra; Ciò scoraggerà gli animali dal strisciare sui lati dei piatti e dall'essiccarsi.
3. Una volta che il prato batterico si asciuga, conservare le piastre maculate capovolte a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 2 settimane. Le piastre di avvistamento almeno 1-2 giorni prima dell'uso consentiranno ai prati batterici di crescere più spessi e sostenere una maggiore densità di animali.
   NOTA: Per preparare le colture batteriche OP50, OP50 può essere ordinato dal Centro genetico Caenorhabditis. Il batterio OP50 viene striato da uno stock di glicerolo su una piastra LB per garantire singole colonie e mantenuto a 4 °C per 4-6 settimane. Le colture batteriche OP50 vengono coltivate in LB durante la notte a 37 °C da una singola colonia – non è necessario agitare. Per preparare il mezzo LB, aggiungere 10 g di triptone, 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, 950 ml di ddH 2 O, regolare il pH a 7con 10 N NaOH e regolare il volume finale a 1 L con ddH₂O. Aliquote in quantità di 100 ml e autoclave per 20 minuti a 121 °C.
4. Per creare uno stock funzionante per ogni ceppo, scegli tre ermafroditi allo stadio L4 su una piastra NGM maculata. Conservare le piastre a 15-25 °C. La condizione di coltura standard è di 20 °C. Se l'accesso agli incubatori a temperatura controllata non è disponibile, mantenere le colture sul banco di RT.
   NOTA: Gli ermafroditi allo stadio L4 possono essere facilmente messi in scena sia per le dimensioni (più piccole degli adulti) che per la presenza di un semicerchio distinto a metà del loro corpo (la vulva in via di sviluppo). A 20 °C, gli animali raggiungono lo stadio L4 34-46 ore dopo la schiusa (che è circa 40-52 ore dopo la deposizione degli embrioni). Vedi Corsi et ^al.14 per maggiori dettagli sui tempi delle fasi di sviluppo.
   1. Spostare le colture a varie temperature per controllare il tasso di sviluppo. Gli animali cresceranno più velocemente a temperature più elevate e più lentamente a temperature più basse. Inizieranno a diventare sterili a temperature superiori a 25 °C.
      NOTA: Alcuni genotipi mutanti sono sensibili alla temperatura e mostreranno fenotipi diversi a seconda della temperatura di coltura.
5. Mantenere le scorte di lavoro scegliendo tre ermafroditi a stadio L4 su una nuova piastra NGM maculata ogni 4 giorni. Ciò garantirà una popolazione costante e ben nutrita con una vasta gamma di fasi di sviluppo.

2. Dissezione delle gonadi

1. Raccolta di adulti di pari età: 12-24 ore prima della dissezione, scegli ermafroditi in stadio L4 su una nuova piastra NGM maculata - questi crescono in giovani adulti il giorno seguente, che è l'ideale per la dissezione. Il numero di ermafroditi in stadio L4 dipenderà dall'analisi citologica eseguita; Di solito, 10-20 ermafroditi vengono sezionati per vetrino, con due o quattro vetrini generati per condizione.
   NOTA: Le gonadi sono estruse in modo più efficiente negli animali ben nutriti. Assicurati di scegliere ermafroditi L4 da scorte di lavoro che non sono affamate (cioè, hanno ancora un prato batterico visibile presente sul piatto). Gli animali affamati tendono a subire estrusioni gonadi incomplete, rendendoli difficili da visualizzare.
   1. Se si valutano le fasi successive della meiosi, come la diacinesi, sezionare gli anziani (48 ore post-L4) perché accumulano più nuclei in stadio di diacinesi, semplificando l'analisi. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero notare la possibilità che alcuni effetti possano essere causati dall'età materna avanzata.
2. Preparati per la dissezione.
   1. Preparare M9: aggiungere 3 g di KH 2 PO 4 (monobasico), 6 g di Na 2 HPO₄ (bibasico), 5 g di NaCl e aggiungere ddH₂O a 100 ml. Autoclavare la soluzione per 20 minuti a 121 °C, lasciarla raffreddare, quindi aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄ con tecnica sterile.
   2. Preparare il tampone di dissezione: mescolare 1 μL di 10% Tween 20, 12 μL di 100 mM di levamisolo, 10 μL di 10x M9 e 77 μL di ddH₂O.
      NOTA: Tween 20 è incluso nel tampone di dissezione per ridurre la tensione superficiale e permeabilizzare ulteriormente le membrane tissutali.
   3. Preparare la soluzione fissa (2% PFA [100 μL]): mescolare 12,5 μL di paraformaldeide (PFA) al 16%, 10 μL di 10x M9 e 77,5 μL di ddH₂O; assicurarsi di utilizzare una fiala fresca di PFA (aperta per non più di 2 settimane).
      ATTENZIONE: il PFA è una sostanza chimica pericolosa e la soluzione fissa deve essere preparata nella cappa aspirante.
   4. Impostare il metodo di congelamento: l'azoto liquido è più facile da gestire, ma se necessario, è possibile utilizzare un blocco di alluminio in cima al ghiaccio secco.
      1. Metodo dell'azoto liquido: impostare un becher di plastica o un barattolo di plastica Coplin in una scatola di polistirolo. Riempire il becher con azoto liquido (il troppo pieno nel contenitore di polistirolo va bene). Posiziona le pinzette nelle vicinanze. Idealmente, il becher dovrebbe essere abbastanza stretto da evitare che i vetrini del microscopio cadano completamente orizzontali: i vetrini dovrebbero trovarsi inclinati ed essere facili da afferrare con una pinzetta.
         NOTA: è importante utilizzare contenitori di plastica quando si lavora con azoto liquido piuttosto che con vetro per evitare la frantumazione dovuta al rapido raffreddamento.
      2. Metodo del ghiaccio secco:
         1. Posizionare un blocco di alluminio piatto su ghiaccio secco in un contenitore di polistirolo o in un secchiello rettangolare. È più facile congelare le diapositive se la parte superiore del blocco si trova sopra la parte superiore del contenitore.
         2. Indossare i guanti, premere delicatamente sul blocco di alluminio per garantire un buon contatto con il ghiaccio secco e accelerare il processo di raffreddamento (potrebbe rilasciare uno stridio mentre il metallo si raffredda rapidamente). Metti una lama di rasoio nelle vicinanze.
         3. Lasciare il blocco di alluminio sul ghiaccio secco per almeno 30 minuti prima dell'arresto del congelamento per consentire il raffreddamento completo, necessario per un congelamento rapido.
            NOTA: Idealmente, dovrebbero essere utilizzati blocchi solidi di ghiaccio secco, che aiutano la superficie a rimanere piana. Se necessario, il blocco di alluminio può essere posizionato su pellet di ghiaccio secco, ma è necessario prestare attenzione per garantire che la superficie rimanga piana.
         4. La superficie del blocco di alluminio raccoglierà il gelo, che può impedire il contatto ravvicinato tra le diapositive e il blocco. Utilizzare la lama del rasoio per raschiare la brina dalla superficie, liberando un'area per ogni vetrino. Coprire il contenitore di polistirolo con un coperchio aiuterà a prevenire un eccessivo accumulo di gelo.
   5. Riempi un barattolo Coplin con ~ 40 ml di etanolo al 95%.
   6. Riempire tre barattoli Coplin con ~40 ml di PBS-T.
      NOTA: Per preparare PBS-T, mescolare 100 ml di 10x PBS, 5 mL di Triton X-100 e 2 mL di 0,5 M EDTA (pH 8). Aggiungere 873 mL di ddH2O. Agitare vigorosamente per sciogliere Triton X-100. Per fare 10x PBS, mescolare 25,6 g di Na 2 HPO 4·7H 2 O,80 g di NaCl, 2 g di KCl e 2 g di KH₂PO₄. Aggiungere ddH₂O per portare il volume a 1 L. Autoclave per 40 minuti a 121°C. Il detergente Triton X-100 è incluso nel tampone di lavaggio PBS-T per ridurre la tensione superficiale e migliorare la ritenzione degli animali montati interi sul vetrino.
3. Sezionare gli animali su una copertina di vetro di 18 mm x 18 mm. Questo passaggio è sensibile al tempo a causa dell'evaporazione del tampone di dissezione. Dovrebbero essere necessari meno di 5 minuti per completare le dissezioni.
   NOTA: Il levamisolo è usato per immobilizzare gli animali per renderli più facili da sezionare, ma lasciarli in levamisolo per troppo tempo si tradurrà in una scarsa estrusione delle gonadi. È più facile ridurre il numero di animali sezionati per diapositiva in modo da adattarsi al lasso di tempo di 5 minuti.
   1. Posizionare un vetrino di tenuta sul palco di un microscopio da dissezione: il vetrino di tenuta viene utilizzato per spostare più facilmente il vetrino di copertura e può essere riutilizzato indefinitamente (Figura 2A, foto a sinistra).
   2. Posizionare il vetrino di copertura sopra il vetrino di tenuta e pipettare 4 μL della soluzione di dissezione al centro del vetrino. Spostare la diapositiva di tenuta su un lato dello stage per liberare la vista.
   3. Scegli 10-20 ermafroditi nella goccia della soluzione di dissezione. Scegli abbastanza animali per l'immagine ~ 10 per diapositiva, ma non così tanti da non poter essere sezionati entro 5 minuti.
   4. Sezionare gli animali usando due aghi da siringa, uno per ogni mano (Figura 2A).
      1. Incrocia le punte degli aghi per creare una forma a X e usa il fondo della X per fissare un adulto sulla superficie del vetrino.
         NOTA: Può essere necessaria pratica per scoprire il modo migliore per tenere ogni ago in termini di angolo e rotazione. Inizia tenendo gli aghi con i loro smussi (bordo inclinato) rivolti verso il basso. Vedere la discussione per suggerimenti su come imparare prima a sezionare in un volume più grande (Figura 2D).
      2. Posizionare la forma a X immediatamente dietro la faringe, circa 1/5 della lunghezza del corpo di un giovane adulto, o appena sotto la parte chiara della testa (Figura 2A, diagramma a destra).
      3. Decapitare l'animale con un movimento a forbice (come affettare il cibo con coltello e forchetta). Una buona estrusione si tradurrà in un braccio della gonade (o talvolta entrambi i bracci) che si libererà completamente dalla cavità corporea, insieme a una o entrambe le metà dell'intestino (Figura 2B, immagine a sinistra). L'intestino apparirà più scuro e di larghezza uniforme, mentre la gonade apparirà chiara con una punta affusolata distale.
         1. Ogni animale dovrebbe essere tagliato solo una volta; Se la gonade non estrude dopo aver effettuato il taglio, passa all'animale successivo. Il primo taglio riduce significativamente la pressione idrostatica nel corpo, il che rende improbabile che ulteriori tagli si traducano in una migliore estrusione. Gli estrusi incompleti o scadenti sono facilmente visibili durante l'imaging e possono essere ignorati (Figura 2B, immagine a destra).
            NOTA: Non tentare di separare la gonade dalla carcassa, in modo che di solito strappi il tessuto e limitino il numero di stadi meiotici che possono essere analizzati.
      4. Ripetere la dissezione per gli animali rimanenti sul foglietto di copertina.
4. Fissare il campione con formaldeide.
   1. Lavorando delicatamente, pipettare 4 μL della soluzione fissa sul coprislip molto vicino alla goccia con animali. Idealmente, le gocce sono abbastanza vicine da fondersi; Evitare il pipettaggio direttamente nella goccia di dissezione e spostare le carcasse sezionate.
   2. Appuntare il coprislip sul vetrino di tenuta usando un dito. Con l'altra mano, sfiorare delicatamente il copricopertina un paio di volte per mescolare le gocce. La concentrazione fissa finale è dello 0,8% di PFA.
   3. Tenendo una diapositiva caricata positivamente con il lato anteriore verso il basso, usala per raccogliere la vetrina al centro della diapositiva. Toccare delicatamente la goccia del campione e la tensione superficiale della goccia raccoglierà il vetrino.
      NOTA: I vetrini caricati positivamente hanno un rivestimento elettrostatico che aiuta i tessuti ad aderire alla superficie per prevenire la perdita del campione.
      1. Se lo si desidera, posizionare il coprislip in diagonale, in modo che un angolo penda dal bordo superiore o inferiore della diapositiva di 1 mm. Lasciare una sporgenza renderà più facile rompere il coperchio dopo il congelamento (Figura 2C).
   4. Impostare lo scivolo sulla panca e fissare per esattamente 5 minuti a RT. Durante questo periodo, etichettare la diapositiva con una matita.
      NOTA: È comune sovrafissare i campioni, che possono essere rilevati mediante un'esclusione di anticorpi dai nuclei o anche da tutti i tessuti. Inoltre, alcuni anticorpi sono particolarmente sensibili alla formaldeide. In questi casi, ridurre il tempo di fissazione o diminuire la concentrazione finale di formaldeide utilizzata.
5. Freeze-crack
   1. Immediatamente dopo la correzione, congelare le diapositive.
      1. Se si utilizza azoto liquido: tenere il bordo etichettato del vetrino con una pinzetta e abbassarlo delicatamente in azoto liquido. Rilasciare la slitta in modo che si appoggi al lato del becher con il lato del coperchio rivolto verso l'alto. I vetrini vengono congelati entro 10 secondi (una volta che il liquido smette di bollire).
      2. Se si utilizza ghiaccio secco: raschiare la brina dalla superficie del blocco di alluminio con un rasoio. Tenere saldamente il bordo etichettato della diapositiva e posizionarlo sulla superficie libera, esercitando una certa pressione verso il basso per garantire il pieno contatto con il blocco. Il coprislip dovrebbe essere completamente sulla superficie del blocco. Il congelamento avviene entro 10 secondi e può essere confermato visivamente quando il campione sotto il coprislip si trasforma in ghiaccio.
      3. Per entrambi i metodi, lasciare le diapositive per almeno 5 minuti per congelare completamente.
         NOTA: Una volta congelati, i vetrini possono essere lasciati in azoto liquido o sul blocco per 15-20 minuti, purché rimangano congelati. Ciò consente di raccogliere più vetrini in questa fase prima di procedere alla fase di cracking.
   2. Lavorando rapidamente, rompere il coperchio dal campione. Questo passaggio è sensibile al fattore tempo. Rimuovere il vetrino e immergere il vetrino in etanolo prima che il campione inizi a scongelarsi.
      1. Rimuovere il vetrino congelato (usando una pinzetta per azoto liquido).
      2. Afferrare saldamente il bordo corto etichettato della diapositiva e sostenere un bordo lungo contro la panca.
      3. Con l'altra mano, afferrare saldamente un rasoio e far scorrere il bordo del rasoio lungo il vetrino per far scorrere il coperchio e allontanarlo dal campione. Questo passaggio è leggermente più semplice se il coprivetrino è posizionato con una sporgenza angolare (Figura 2C).
6. Posizionare immediatamente il vetrino in un barattolo Coplin contenente il 95% di etanolo a RT. Lasciare i vetrini in etanolo per almeno 5 minuti.
   NOTA: i vetrini possono essere lasciati in etanolo per un po ', questo consente di raccogliere più vetrini in questa fase prima di procedere ai lavaggi. Le diapositive possono anche essere memorizzate in questa fase per diversi giorni. In caso di conservazione, spostare il barattolo Coplin di vetrini in etanolo a -20 °C.
7. Lavare i vetrini in PBS-T tre volte per 5 minuti ciascuno a RT. Utilizzare PBS-T fresco per ogni lavaggio.
8. In caso di colorazione con anticorpi, procedere al passaggio 3 (colorazione anticorpale). Se si colora solo con DAPI per visualizzare i cromosomi, procedere al passaggio 4 (montaggio e imaging).

3. Colorazione anticorpale

1. Incubazione di anticorpi primari
   NOTA: Quando si elaborano le condizioni appropriate per nuovi anticorpi, è importante includere i seguenti controlli negativi per verificare la specificità del segnale fluorescente: 1) Un vetrino che manca di un anticorpo primario e ha solo un anticorpo secondario; 2) un vetrino con un solo anticorpo primario che manca di un anticorpo secondario. Ognuno di questi controlli negativi dovrebbe produrre una completa mancanza di segnale. Se la fluorescenza viene identificata sul vetrino secondario di soli anticorpi, la diluizione dell'anticorpo secondario deve essere aumentata o deve essere utilizzata una secondaria diversa. Se la fluorescenza viene identificata sul vetrino primario di soli anticorpi, è probabile che sia dovuta all'autofluorescenza o ad altri potenziali contaminanti.
   1. Diluire l'anticorpo primario nel tampone anticorpale (50 mg di BSA + 50 μL di azoturo di sodio al 10% + 10 ml di PBS-T ) - preparare una diluizione anticorpale sufficiente per utilizzare 20-30 μL per vetrino.
   2. Preparare una camera umida: foderare il fondo di un contenitore di plastica con un coperchio ermetico con carta assorbente umida. Posare un singolo strato di pipet Pasteur di vetro sopra i tovaglioli di carta. Questi pipet creano una superficie che consente alle diapositive di rimanere in piano e le mantiene sollevate dai tovaglioli di carta.
      NOTA: Per le camere umide, è meglio utilizzare contenitori di plastica per alimenti con coperchi a scatto, che semplificano l'apertura e la chiusura del contenitore senza interrompere i vetrini all'interno. Cercane uno che sia abbastanza lungo per i pipetti Pasteur ma abbia anche un fondo relativamente piatto senza rientranze per consentire alle guide di riposare completamente orizzontali.
   3. Rimuovere il vetrino dal lavaggio finale PBS-T. Lavorare rapidamente da questo passo in avanti per mantenere il campione sempre umido ed evitare l'evaporazione. Se il campione si asciuga, la colorazione degli anticorpi sarà influenzata negativamente.
   4. Asciugare l'intera superficie del vetrino usando un fazzoletto piegato in un rettangolo compatto. Pulire la parte anteriore e posteriore della diapositiva, ma lasciare molto spazio intorno al campione. Prestare particolare attenzione quando si asciuga la superficie vicino al campione: evitare di avvicinarsi troppo al campione, che lascia un'area delle dimensioni del vetrino non asciugata. Tuttavia, assicurarsi che il perimetro del campione sia asciutto per la fase successiva.
   5. Disegnare un cerchio attorno al campione utilizzando una penna PAP idrofoba. Prestare attenzione per racchiudere l'intera area del campione, ma evitare di interrompere le carcasse di animali visibili sulla superficie del vetrino. Attendere ~ 5 s per consentire alla barriera di asciugarsi completamente.
      NOTA: Una barriera idrofobica è necessaria per contenere la soluzione anticorpale primaria perché la superficie del vetrino è stata rivestita in PBS-T, che contiene un detergente. La penna PAP funziona meglio su una superficie di scorrimento asciutta, quindi è importante creare un perimetro asciutto attorno al campione. Lasciare l'area più vicina al campione non essiccata protegge il campione durante questa fase.
   6. Lavorando rapidamente, utilizzare l'angolo o il bordo del tessuto piegato per allontanare il liquido dal campione all'interno della barriera idrofobica. Fare attenzione a evitare di disturbare le carcasse degli animali.
   7. Pipetare immediatamente 20 μL della soluzione anticorpale primaria nell'anello creato dalla barriera idrofobica. Fare attenzione a pipettare delicatamente e ad angolo per evitare di interrompere le carcasse. Evitare il pipettaggio direttamente su qualsiasi carcassa.
   8. Inclinare delicatamente il vetrino per assicurarsi che l'intera superficie all'interno della barriera idrofobica sia coperta dalla soluzione.
      NOTA: È meglio se le barriere idrofobiche hanno una circonferenza interna di 1-1,5 cm, che è completamente coperta da 20 μL della soluzione anticorpale. La larghezza della circonferenza dipenderà da come le carcasse sono distribuite durante la fase di congelamento. Barriere più ampie possono richiedere un volume maggiore di soluzione anticorpale. Se lo si desidera, piccoli quadrati di parafilm (tagliati alle dimensioni del coprivetrino 18 mm x 18 mm) possono essere posizionati delicatamente sopra il campione. I quadrati del parafilm assicureranno che la soluzione anticorpale copra l'intero campione e aiuteranno anche a prevenire l'evaporazione.
   9. Ripetere i passaggi 3.1.3-3.1.8 per il resto delle diapositive.
   10. Trasferire con cautela i vetrini nella camera umida, assicurandosi che la soluzione rimanga contenuta all'interno della barriera idrofobica e che i vetrini siano completamente in piano.
   11. Incubare i vetrini durante la notte a RT. A seconda dell'anticorpo, questo passaggio potrebbe essere ridotto a 6 ore o eseguito durante la notte a 4 °C mantenendo la camera umida in una cella frigorifera o in frigorifero.
       NOTA: L'uso di una camera umida e di barriere idrofobiche è di solito sufficiente per prevenire l'evaporazione della soluzione anticorpale, anche per lunghe incubazioni notturne. Tuttavia, se l'evaporazione si rivela un problema, piccoli quadrati di parafilm possono essere posizionati delicatamente su ciascun campione, il che aiuterà a prevenire l'evaporazione. Questi possono essere rimossi nella prima fase di lavaggio: immergere ogni vetrino in un barattolo Coplin riempito con PBS-T (che non contiene altri vetrini) e lasciare che il parafilm galleggi lontano dal campione. Rimuovere il parafilm dal barattolo Coplin prima di utilizzare lo stesso barattolo per rimuovere il parafilm dalla diapositiva successiva.
2. Lavare i vetrini in barattoli Coplin contenenti ~ 40 ml di PBS-T tre volte per 5 minuti ciascuno a RT. Utilizzare PBS-T fresco per ogni lavaggio.
   1. Durante questi lavaggi, diluire l'anticorpo secondario nel tampone anticorpale. Preparare una diluizione anticorpale sufficiente per utilizzare 20-30 μL per vetrino. È comune utilizzare anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor diluiti a 1:200.
3. Incubazione di anticorpi secondari
   1. Rimuovere il vetrino dal lavaggio finale PBS-T. Lavorare rapidamente da questo passo in avanti per mantenere il campione sempre umido ed evitare l'evaporazione.
   2. Asciugare il vetrino con un fazzoletto piegato. Evitare di asciugare l'area contenuta dalla barriera idrofobica.
   3. Lavorando rapidamente, utilizzare l'angolo o il bordo del tessuto piegato per allontanare il liquido dal campione all'interno della barriera idrofobica. Fare attenzione a evitare di interrompere le carcasse degli animali.
   4. Pipetare immediatamente 20 μL della soluzione anticorpale secondaria nell'anello creato dalla barriera idrofobica. Fare attenzione a pipettare delicatamente e ad angolo per evitare di interrompere le carcasse.
   5. Evitare il pipettaggio direttamente su qualsiasi carcassa. Assicurarsi che l'intera superficie all'interno della barriera idrofobica sia coperta dalla soluzione. Circonferenze barriera più ampie possono richiedere un volume maggiore di soluzione anticorpale. Se lo si desidera, coprire il campione con un piccolo quadrato di parafilm (vedere la nota sotto il punto 3.1.8).
   6. Trasferire con cautela il vetrino nella camera umida, assicurandosi che la soluzione rimanga contenuta all'interno della barriera idrofobica e che il vetrino sia completamente in piano. Riposizionare il coperchio sulla camera umida per mantenere il vetrino al buio.
   7. Ripetere i passaggi 3.3.1-3.3.6 per il resto delle diapositive.
   8. Incubare al buio per 4 ore a RT.
      NOTA: A seconda dell'anticorpo, questo passaggio può essere ridotto a 2 ore o esteso a 6 ore. Se la camera umida non è buia, metterla in un cassetto o coprirla con una scatola di cartone. In alternativa, la camera umida può essere avvolta in un foglio di alluminio per mantenere i vetrini al buio.
4. Lavare i vetrini in barattoli Coplin contenenti ~ 40 ml di PBS-T tre volte per 5 minuti ciascuno a RT. Utilizzare PBS-T fresco per ogni lavaggio.

4. Montaggio e imaging

1. Preparare il montaggio del campione avendo a portata di mano il mezzo di montaggio + DAPI (2 μg/ml), vetrini da 18 x 18 mm e smalti per unghie.
2. Rimuovere il vetrino dal lavaggio finale e asciugare con un panno piegato. Evitare di asciugare l'area contenuta dalla barriera idrofobica.
3. Utilizzando l'angolo del tessuto piegato, rimuovere con cura il liquido dal campione all'interno della barriera. Rimuovere la maggior parte del liquido in questa fase, ma senza lasciare che le carcasse si asciughino completamente.
4. Lavorando rapidamente, aggiungere 8 μL del mezzo di montaggio al campione. Pipet delicatamente e ad angolo per evitare di interrompere le carcasse. Evitare il pipettaggio direttamente sulle carcasse.
5. Lavorando ancora rapidamente, abbassare con attenzione un vetrino di vetro sul campione.
   1. Le bolle d'aria possono interrompere l'imaging e portare alla degradazione del campione. Per ridurre al minimo le bolle d'aria, appoggiare un bordo del vetrino sul vetrino accanto al campione, in modo che venga tenuto in diagonale sul campione. Può aiutare ad appoggiare il bordo superiore della copertina su una matita o una pinzetta. Quindi abbassare lentamente il bordo superiore della slitta di copertura verso il basso: questo movimento consente al mezzo di montaggio di creare una tenuta liquida che progredisce da un bordo all'altro bordo.
6. Ripetere i passaggi 4.2-4.5 per il resto delle diapositive.
7. Sigillare le copertine con lo smalto. Fare attenzione a evitare di premere verso il basso sul coprivetrino (che schiaccerà il campione) o di spostare il coprivetrino orizzontalmente (che spalmerà il campione).
   1. Aggiungi un piccolo punto di smalto per unghie a ciascun angolo di una copertina (~ 1 mm di larghezza). Questi aiuteranno a mantenere il coprislip in posizione. Lasciare asciugare completamente i puntini.
   2. Quando gli angoli sono completamente asciutti, sigillare i bordi con lo smalto. Assicurarsi che lo smalto riempia completamente lo spazio tra il vetrino e il vetrino, ma evitare di coprire troppo il vetrino. È meglio mantenere una sovrapposizione di 1 mm sul coprivetrino. Utilizzare solo lo smalto necessario. Evitare di usare troppo o di avere uno smalto in eccesso, che può richiedere molto tempo per asciugarsi e corre il rischio di danneggiare l'obiettivo del microscopio.
      NOTA: è preferibile utilizzare smalto colorato anziché trasparente, che rende più facile vedere il bordo del sigillo e aiuta a prevenire l'imaging degli animali che si trovano sotto il bordo dello smalto.
   3. Lasciare asciugare completamente lo smalto prima di procedere all'imaging. Questo passaggio è importante, poiché lo smalto bagnato può danneggiare gravemente gli obiettivi del microscopio.
      NOTA: Le diapositive devono essere tenute al buio il più possibile da qui in poi. Usa una scatola di cartone piatta per coprirli mentre si asciugano sulla panchina.
8. Conservare i vetrini al buio a 4 °C per 1-2 settimane prima dell'imaging. Se necessario, conservare i vetrini a -20 °C per una durata maggiore.
9. Immagine mediante microscopia a luce composta a fluorescenza standard.
   1. Per ogni diapositiva, in primo luogo, esaminare l'intero campione a 10x nel canale DAPI per identificare le gonadi ben estruse e annotarne la posizione. Per la maggior parte delle applicazioni, evitare di visualizzare eventuali gonadi recise, incomplete o parzialmente coperte da un'altra parte dell'animale. Per la maggior parte degli animali, solo un braccio gonade sarà completamente estruso e visibile.
      NOTA: può essere utile acquisire un'immagine a ingrandimento inferiore a 10x dell'intera gonade nel canale DAPI da utilizzare per un orientamento successivo o identificare la posizione di nuclei specifici.
   2. A seconda dell'applicazione, le immagini possono essere scattate a 40x, 63x o 100x. Se l'intera gonade deve essere catturata, create un montaggio con bordi sovrapposti. Durante l'imaging, ricorda che la gonade è un tubo cavo, con nuclei più densi nella parte superiore e inferiore.

Risultati

DAPI si lega fortemente al DNA e la sua colorazione è robusta anche in un'ampia varietà di condizioni (Figura 3A,B). Dovrebbe essere presente in tutti i nuclei e quindi rende un efficace controllo positivo per la presenza di qualsiasi tessuto verme sul vetrino e la capacità di rilevare la fluorescenza al microscopio. La colorazione è efficace quando l'anticorpo è presente all'interno dei nuclei meiotici (Figura 3A,B). Ad esempio, la Figura 3A,B mostra nuclei di pachitene medio colorati con DAPI e un anticorpo che ha come bersaglio RAD-51, un marker per le rotture a doppio filamento. KLE-2 è un componente della condensante, un complesso proteico altamente conservato che struttura i cromosomi in preparazione alla mitosi e alla meiosi. I mutanti kle-2/+ hanno difetti minori nella struttura cromosomica, come mostrato dalla colorazione DAPI leggermente disordinata e da un aumento del numero di rottura del doppio filamento riflesso nel maggior numero di focolai di RAD-51 (Figura 3B). Un errore comune per l'immunofluorescenza è lasciare il campione nella soluzione fissa per troppo tempo. L'over-fixing può portare a una colorazione infruttuosa perché di solito impedisce agli anticorpi di diffondersi nei nuclei. Questo errore può essere identificato quando l'anticorpo è diffuso nelle regioni citoplasmatiche della gonade, ma sembra essere escluso dai nuclei.

Nella linea germinale (Figura 1), i nuclei proliferano mitoticamente sulla punta distale, entrano nella meiosi durante la zona di transizione e progrediscono attraverso il pachitene (che è spesso diviso in tre stadi uguali da un numero di file di nuclei) prima di entrare nel diplotene e infine nella diakinesis. Gli ovociti in diacinesia sono numerati in base alla loro vicinanza alla spermateca, con l'ovocita -1 che è più prossimale alla spermateca, l'ovocita -2 è il successivo distale e così via. C. elegans ha sei cromosomi, che si manifestano come ovali compatti nei nuclei di diacinesi. Ognuno di questi rappresenta una coppia omologa di due cromatidi fratelli tenuti insieme da un chiasma, chiamato anche bivalente (Figura 3C). I mutanti, come spo-11, che interrompono la formazione di crossover non riusciranno a formare chiasmata; pertanto, i nuclei di diacinesia avranno 12 corpi DAPI separati (chiamati anche univalents), uno per ogni cromatide fratello (Figura 3D).

Figura 1: I nuclei germinali sono disposti in modo spazio-temporale che rappresenta la loro progressione attraverso la meiosi . (A) Ermafrodito giovane adulto a montaggio intero colorato con DAPI. Sono delineati stadi gonadi e meiotici, dalla punta distale (asterisco) alla regione prossimale (l'ovocita -1, indicato con una freccia), che contiene la spermateca (triangolo). La barra della scala rappresenta 100 μm. (B) Immagine di fluorescenza proiettata di una gonade ermafrodita sezionata colorata con DAPI. Gli stadi meiotici sono denotati, con nuclei rappresentativi mostrati in inserti (tutti gli inserti sono mostrati in scala l'uno con l'altro). I nuclei possono essere facilmente messi in scena in base alla loro posizione nella germinale e alla morfologia cromosomica caratteristica, progredendo dalla zona mitotica all'estremità distale (asterisco), alla zona di transizione, attraverso il pachitene, il diplotene e la diakinesi. La spermateca è contrassegnata da un triangolo. Questa cifra è stata adattata da Hillers et al. sotto licenza CC BY 3.0²⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Dimostrazione della configurazione della dissezione . (A) Fase del microscopio durante la dissezione. Gli animali vengono sezionati in 4 μL di soluzione di dissezione su un vetrino di copertura posto sul vetrino di tenuta, che viene utilizzato per spostare il vetrino di copertura in vista. Il diagramma mostra il posizionamento ideale dell'ago. Gli aghi sono tenuti con un bordo smussato rivolto verso il basso, attraversato sulla regione faringea. Le frecce rosa dimostrano un movimento a forbice per gli aghi. La linea tratteggiata rosa mostra la posizione di taglio ideale. (B) Immagini di animali sezionati, con un esempio di estrusione completa e di estrusione incompleta. Le sezioni di gonadi e budella estruse sono etichettate. (C) Immagine che illustra la fase di congelamento. Il vetrino deve essere tenuto saldamente in una mano, con il lato del coperchio rivolto lontano dal corpo. Il bordo opposto è controventato contro la panca. Il rasoio dovrebbe essere tenuto nell'altra mano. La freccia rosa indica la direzione di movimento del rasoio per far scorrere il coperchio dalla diapositiva, con una leggera rotazione tale che il coprislip si allontani dal corpo. Si noti che il coprivetrino è stato posizionato in modo tale che un angolo penda sul bordo lungo della diapositiva. (D) Immagine della configurazione per la pratica di dissezione in una capsula di colorazione degli embrioni di vetro. Gli animali vengono posti in 50-200 μL di soluzione di dissezione, che annulla il problema dell'evaporazione e prolunga il tempo per la dissezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi della fluorescenza dei nuclei germinali. (A,B) Proiezioni Z-stack di nuclei di pachitene tardivi colorati con anticorpo RAD-51 (verde) e DAPI (rosso) in eterozigoti (A) wild-type e (B) kle-2/+. (C,D) Proiezioni Z-stack di un singolo nucleo di diacinesia colorato con DAPI in (C) wild-type (con sei corpi di colorazione DAPI) e (D) mutanti spo-11 (con 12 corpi coloranti DAPI). Le barre della scala rappresentano 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La riproduzione sessuale richiede la creazione di gameti aploidi, che vengono prodotti attraverso la divisione cellulare specializzata della meiosi. C. elegans è diventato un modello popolare per lo studio citologico della meiosi grazie alla sua trasparenza ottica, alla comoda anatomia della linea germinale e alla potente genetica²⁸. Semplici esperimenti di organismi che valutano la fertilità e la letalità embrionale possono essere combinati con la genetica molecolare per affrontare molte domande in laboratorio o in classe. Ad esempio, poiché i crossover sono essenziali per una corretta segregazione cromosomica, i processi che interrompono la loro formazione o risoluzione genereranno gameti aneuploidi. A sua volta, l'aneuploidia porta a una progenie non vitale, che può essere facilmente valutata contando la progenie o attraverso il metodo leggermente più complicato di determinare la letalità embrionale. Citologicamente, la mancanza di crossover influenzerà il numero di corpi di colorazione DAPI osservati durante la diakinesis. La robustezza della colorazione DAPI e la facilità di punteggio rendono questo esperimento ideale per insegnare tecniche citologiche. La disposizione spazio-temporale dei nuclei nella linea germinale ermafrodita fornisce un'istantanea di ogni stadio della meiosi in un singolo momento nel tempo. I nuclei impiegano circa 54 ore per procedere dall'estremità mitotica distale della linea germinale all'estremità prossimale (per esempi, vedi Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 e Libuda et ^al.35). Questa tempistica ben consolidata del progresso meiotico consente l'etichettatura a impulsi o esperimenti dannosi per il DNA.

Poiché la colorazione DAPI funziona quasi sempre, serve come utile controllo tecnico per la microscopia a fluorescenza (e può fornire soddisfazione ai microscopisti in formazione). La colorazione anticorpale può essere più variabile ed è una buona misura di riproducibilità tra le repliche. Le gonadi di C.elegans possono essere difficili da risolvere in modo coerente, poiché questa fase richiede un equilibrio tra la conservazione della struttura cromosomica e la possibilità di una sufficiente diffusione degli anticorpi. Il fissaggio con formaldeide preserva al meglio la morfologia cromosomica e la preparazione della formaldeide fresca dalle fiale di paraformaldeide ha fornito i risultati più riproducibili. È anche possibile utilizzare formaldeide preparata dalla formalina (37% di formaldeide acquosa e metanolo). Potrebbe essere necessario determinare empiricamente la forza e la tempistica di fissazione per ciascun anticorpo. I metodi alternativi prevedono di saltare la fissazione della formaldeide nella fase 2.4 e, dopo il freeze-crack, l'immersione in etanolo al 100% a -20 °C o l'immersione in metanolo al 100% per 10 minuti seguita da un'immersione in acetone al 100% per 10 minuti a -20 °C. Queste condizioni di correzione consentono una migliore penetrazione degli anticorpi, ma influenzeranno negativamente la morfologia dei tessuti (i cromosomi appariranno esplosi e più puffier).

La tempistica è molto importante per la dissezione e la correzione dei passaggi descritti nel passaggio 2. Poiché il volume della soluzione di dissezione è così piccolo, l'evaporazione può influire sulla concentrazione finale di fissazione, che causerà una colorazione anticorpale variabile. Un gestore esperto di C. elegans può preparare una diapositiva in meno di 2 minuti dall'inizio (passaggio 2.3) da correggere (passaggio 2.4). Il principale ostacolo tecnico è la capacità di raccogliere animali nella goccia della soluzione di dissezione e sezionarli rapidamente. Può essere più facile imparare a sezionare in volumi più grandi. I nuovi tirocinanti iniziano innanzitutto raccogliendo gli animali in 50-200 μL di soluzione di dissezione in un piatto di colorazione dell'embrione di vetro (Figura 2D); La superficie più ampia offre più spazio di manovra quando si identifica una posizione ideale dell'ago per buone estrusioni gonadiche, mentre il maggiore volume di liquido rende l'evaporazione meno problematica. Una volta a proprio agio con i movimenti di dissezione, i tirocinanti iniziano a sezionare usando solo 50 μL nel piatto, quindi passano alla dissezione in 20 μL su un vetrino. Una volta sezionati i vetrini, i tirocinanti possono iniziare rapidamente a ridurre la quantità di soluzione fino a quando non sono abbastanza veloci da lavorare in 4 μL da rendere trascurabile l'evaporazione.

Se la tempistica della dissezione rimane un problema, i tirocinanti possono sezionare 8 μL della soluzione di dissezione durante la fase 2.3. Quindi, durante la fase 2.4, possono aggiungere 8 μL della soluzione fissa, pipettare delicatamente per miscelare accuratamente (osservando attentamente per garantire che le carcasse non vengano interrotte o pipettate via) e rimuovendo 8 μL dalla soluzione miscelata. Questo approccio alternativo porterà allo stesso volume finale di 8 μL e alla stessa concentrazione fissa finale; Questo volume è importante per garantire che le carcasse entrino in contatto sia con il vetrino che con la superficie del vetrino durante la fessura congelata nella fase 2.5. Se i tempi di preparazione di ciascun vetrino rimangono un problema anche in volumi di dissezione maggiori, un metodo di sospensione per il protocollo di immunofluorescenza germinale è descritto da Gervaise e Arur²⁶.

La principale limitazione dell'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare le proteine in situ è la disponibilità di anticorpi primari mirati a una particolare proteina di interesse. Tuttavia, se è stata progettata una versione marcata della proteina, questo protocollo può essere adattato per visualizzare il tag proteico. Gli anticorpi che prendono di mira tag comuni, come FLAG, HA o GFP, sono comunemente disponibili. I tag fluorescenti come la GFP possono spesso essere spenti mediante fasi di fissazione, quindi si consiglia di utilizzare un anticorpo primario mirato alla GFP, piuttosto che fare affidamento sul segnale di fluorescenza nativo stesso. Un'altra limitazione di questo protocollo è che cattura la linea germinale entro un singolo lasso di tempo (anche se tutte le fasi dell'oogenesi saranno rappresentate all'interno della linea germinale). Pertanto, questa tecnica può perdere i cambiamenti dinamici che possono verificarsi quando un ovocita progredisce attraverso l'oogenesi. Tuttavia, la tempistica della gametogenesi è stata ben studiata in C. elegans; In un giovane adulto wild-type, un ovocita impiega circa 60 ore per progredire dalla punta distale della linea germinale (la zona mitotica) alla diacinesia³³. Pertanto, un inseguimento del polso o un intervento specifico come l'irradiazione seguito da un corso temporale consentirebbe l'osservazione degli effetti nelle diverse fasi della meiosi.

In conclusione, questo protocollo descrive la dissezione delle gonadi di C. elegans seguita da DAPI e colorazione anticorpale per microscopia a fluorescenza. La dissezione e il fissaggio (fase 2) richiedono 60-90 minuti, a seconda del numero di vetrini generati. La colorazione degli anticorpi (fase 3) è per lo più hands-off e può variare da 7 ore a 1,5 giorni, a seconda dei tempi di incubazione degli anticorpi. Il montaggio (fasi 4.1-4.7) richiede circa 15 minuti. Questo approccio generale alla visualizzazione dei cromosomi germinali e della gonade può essere utilizzato per studi citologici di qualsiasi proteina se esiste un anticorpo o un reagente fluorescente. Nella sua forma più semplice, la colorazione DAPI dei nuclei di diacinesia può essere utilizzata per lo screening di fattori che influenzano la ricombinazione meiotica. Se abbinato alle analisi degli organismi del numero di progenie, dell'incidenza dei maschi (fenotipo Him) e della letalità embrionale, questo approccio citologico fornisce un contrappunto a singola cellula alle analisi basate sulla popolazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 488 Asino Anti-Coniglio IgG Anticorpo Secondario	Sonde Molecolari	711-545-152
Blocco di riscaldamento/raffreddamento in alluminio	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Pipette Pasteur in vetro borosilicato, monouso, 5,75 pollici	Fisherbrand	13 678 20B	Utilizzato per fare plettri a vite senza fine
BSA, Albumina sierica bovina	VWR	97061 420
C. elegans wild type (ancestrale)	Caenorhabditis Genetics Center	N2 (ancestrale)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutanti	Caenorhabditis Genetics Center	VC768	Il genotipo completo di questo ceppo è: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Ha kle-2 bilanciato con un cromosoma bilanciatore marcato con GFP farangeale. Scegli animali non verdi per identificare i mutanti omozigoti kle-2.
C. elegans spo-11 (me44) mutanti	Caenorhabditis Centro di genetica	TY4342	Il genotipo completo di questo ceppo è: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). Ha spo-11 bilanciato con un cromosoma bilanciatore marcato con GFP farangeale. Scegli animali non verdi per identificare i mutanti omozigoti spo-11.
Cloruro di calcio anidro	VWR	97062 590
Colesterolo	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, sale disodico diidrato	Apice Bioresearch Prodotti	20 147
Piatto per embrioni, vetro, cavità da 30 mm Servizi	di microscopia elettronica	100492-980	Usato per esercitarsi nella dissezione; il vetro è preferito perché gli animali sezionati possono attaccarsi alla plastica
Escherichia coli	>Caenorhabditis Centro di genetica	OP50
Contenitore per la conservazione degli alimenti, vari		contenitori in	plastica con (1) fondi relativamente piatti, per consentire ai vetrini di riposare a livello; (2) i coperchi ermetici, ma che possono comunque essere facilmente rimossi senza disturbare il contenuto del contenitore, e (3) sono lunghi circa 9 pollici per 6 pollici di larghezza sono preferiti
Barattolo di vetro Coplin DWK	Life Sciences. Wheaton	08-813E
Penna PAP con barriera idrofobica	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Levamisolo cloridrato	Sigma Aldrich	L0380000
Solfato di magnesio anidro	Fisher Chemical	M65 500
aghi, monouso, 25 g	BD PrecisionGlide	14 821 13D	blu, agar NGM da 1 pollice
, apice granulato	Prodotti Bioresearch	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldeide (16% p/v) Soluzione acquosa	Microscopia elettronica Scienze	50 980 487
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10x)	Fisher BioReagents	BP399500
piastre di Petri, 60 mm	Tritech Research	NC9321999	non ventilato e tagliente
(90% platino, 10% iridio)	Tritech Research	PT 9010	Utilizzato per realizzare picconi a vite senza fine
Fisher		BP366-500
Fosfato di potassio	VWR BDH bibasico	BDH9266 500G
Fosfato di potassio	VWR BDH Chemical	BDH9268 500G
Occhiali Premium Cover 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0.13– Lamette da barba con spessore di 0,17 mm
, bordo singolo	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant	Sonde molecolari	S36937	Alternative: mezzo di montaggio VectaShield Antifade (Vector Laboratories, H-1000-10) o ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). Se si utilizza ProLong Diamond, non è necessario lo smalto per unghie per la sigillatura, ma i vetrini devono polimerizzare per 24 ore prima dell'imaging.
Sodio Azide	Fisher BioReagents	BP922I 500
Cloruro di sodio	Fisher Chemical	S271 500
Sodio Fosfato bibasico anidro	Sigma Aldrich	7558 79 4
Sodio fosfato bibasico eptaidrato	Sigma Aldrich	S9390
Scatola di polistirolo	vari	n/a	Dimensioni approssimative dell'interno: 12 pollici di lunghezza, 9 pollici di larghezza, 8 pollici di profondità
Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Tryptone	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Estratto di lievito	Apex Prodotti Bioresearch	20 254