Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati neonatali di batteriemia di Escherichia coli

Sommario

Escherichia coli provoca sepsi nei neonati che ingeriscono i batteri intorno al momento della nascita. Il processo coinvolto nella capacità di E. coli di viaggiare dal tratto enterico al flusso sanguigno è poco compreso. Questo modello in vitro valuta la capacità dei ceppi di E. coli di viaggiare attraverso le cellule epiteliali intestinali.

Abstract

I neonati ingeriscono ceppi materni di E. coli che colonizzano il loro tratto intestinale intorno al momento del parto. I ceppi di E. coli con la capacità di traslocare attraverso l'intestino invadono il flusso sanguigno del neonato, causando batteriemia pericolosa per la vita. La metodologia qui presentata utilizza cellule epiteliali intestinali polarizzate cresciute su inserti semipermeabili per valutare la transcitosi degli isolati neonatali di batteriemia di E. coli in vitro. Questo metodo utilizza la linea cellulare intestinale T84 stabilita che ha la capacità di crescere fino alla confluenza e formare giunzioni strette e desmosomi. Dopo aver raggiunto la confluenza, i monostrati maturi T84 sviluppano resistenza transepiteliale (TEER), che può essere quantificata utilizzando un voltmetro. I valori di TEER sono inversamente correlati con la permeabilità paracellulare dei componenti extracellulari, compresi i batteri, attraverso il monostrato intestinale. Il passaggio transcellulare dei batteri (transcitosi), d'altra parte, non altera necessariamente le misurazioni TEER. In questo modello, il passaggio batterico attraverso il monostrato intestinale viene quantificato fino a 6 ore dopo l'infezione e vengono effettuate misurazioni ripetute di TEER per monitorare la permeabilità paracellulare. Inoltre, questo metodo facilita l'uso di tecniche come l'immunocolorazione per studiare i cambiamenti strutturali nelle giunzioni strette e altre proteine di adesione cellula-cellula durante la transcitosi batterica attraverso l'epitelio polarizzato. L'uso di questo modello contribuisce alla caratterizzazione dei meccanismi attraverso i quali E. coli neonatale transcitosi attraverso l'epitelio intestinale per produrre batteriemia.

Introduzione

L'Escherichia coli è la causa più comune di sepsi ad esordio precoce nei neonati ^1,2,3. Il tasso di mortalità della batteriemia neonatale di E. coli può raggiungere il 40% e la meningite è una possibile complicanza associata a gravi disabilità dello sviluppo neurologico². L'ingestione di ceppi materni di E. coli da parte del neonato può produrre batteriemia neonatale; Questo processo è stato replicato in modelli animali ^2,4. Una volta ingeriti, i batteri patogeni viag....

Protocollo

NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni delle cellule T84, dei batteri, delle piastre e dei reagenti in un armadio di sicurezza di livello 2 (BSL-2) per evitare la contaminazione. Utilizzare aree separate e incubatori per tutto il lavoro che coinvolge cellule T84 sterili, cellule T84 infette ed E. coli. Gli isolati clinici di E. coli testati con i metodi qui descritti sono stati ottenuti seguendo le linee guida dell'Institutional Review Board presso il nostro istituto ^1,16.

1. Preparazione di inserti di transcitosi con cellule T84 (circa 1-2 settimane prima del....

Risultati

Figura 1: T84 TEER nel tempo. Man mano che lo strato di celle T84 matura sull'inserto, la resistenza elettrica del monostrato aumenta. Con un TEER di almeno 1.000 Ω·cm², lo strato cellulare è sufficientemente sviluppato per diminuire il trasporto batterico paracellulare e consentire la misurazione del transito batterico principalmente tra.......

Discussione

Questo metodo deriva da tecniche utilizzate in gastroenterologia e malattie infettive²⁰. Modelli in vitro della barriera epiteliale intestinale sono stati utilizzati per chiarire i meccanismi attraverso i quali i contenuti luminali interagiscono con questa componente rilevante dell'immunità innata ^6,8. Le interazioni ospite-patogeno di E. coli neonatale invasivo sono state anche caratterizzate separatamente attraverso ana.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10.000 U/ mL Miscela Penicillina/Streptomicina	Fisher Scientific	15-140-122
Provette coniche sterili da 15 mL	Provette	C15B
2 mL	Avant	AVSS2000
50 mL provette coniche sterili in polipropilene	Falcon	352070
Aspiratore	Corning	4930
Cabine di biosicurezza	Labconco	30441010028343	Nel metodo vengono utilizzati tre di questi: uno per il lavoro su tessuti sterili, uno per il lavoro su tessuti infetti e uno per il lavoro batterico.
Centrifuga	Sorvall	Legend RT
Anelli di inoculazione monouso	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Misuratore epiteliale di volt/ohm World	Precision Instruments	EVOM2
Siero fetale bovino	Fisher Scientific	10437028
Miscela di nutrienti F-12 di Ham's	Gibco	11765-047
Ematocitometro	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Agitatore per incubatori	New Brunswick	Innova 4080
	Incubatori Thermo Scientific	51030284	Tre di questi sono utilizzati nel metodo: uno per la coltura di tessuti sterili, uno per la coltura di tessuti infetti e uno per l'incubazione batterica.
Brodo di lisogenia	Difco	244610
Brodo di lisogenia agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscopio	Nikon
Spettrofotometro	Unico	1100RS
T84 Cellule Intestinali	Collezione di colture tissutali americane	CCL248
Inserti per colture tissutali, con membrana in polietilene treftalato, 3 µ m pori,  Piastra	Falcon	353096
pozzetti, 24 pozzetti Falcon		353504
Trypan colorazione blu	Fisher Scientific	T10282

per microcentrifuga MidSci per coltura tissutale formato 24