Il presente protocollo descrive l'uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l'associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l'interpretazione dei dati risultanti.
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Articolo metodologico
Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La determinazione dell'affinità e del comportamento di legame tra un aptamero e il suo bersaglio è il passo più cruciale nella selezione e nell'utilizzo di un aptamero per l'applicazione. A causa delle drastiche differenze tra l'aptamero e le piccole molecole, gli scienziati devono impegnarsi molto per caratterizzare le loro proprietà leganti. La calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è un approccio potente per questo scopo. L'ITC va oltre la determinazione delle costanti di dissociazione (Kd) e può fornire le variazioni di entalpia e la stechiometria di legame dell'interazione tra due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione, in modo che il processo possa misurare sensibilmente il legame tra le macromolecole e i loro piccoli bersagli. Qui, l'articolo introduce una procedura passo-passo della misurazione ITC di un aptamero selezionato con un piccolo bersaglio, la tetraciclina. Questo esempio dimostra la versatilità della tecnica e il suo potenziale per altre applicazioni.
Introduzione
Gli aptameri sono frammenti di ssDNA o RNA selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati 1,2, che possono funzionare come elementi di riconoscimento avanzato o anticorpi chimici 3,4,5. Pertanto, l'affinità di legame e la specificità degli aptameri ai loro bersagli svolgono un ruolo cruciale nella selezione e nell'applicazione di un aptamero e la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stata ampiamente utilizzata per questi scopi di caratterizzaz....
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Protocollo
NOTA: La Figura 2 mostra le fasi principali dell'esperimento ITC per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e della tetraciclina.
1. Preparazione dei campioni
NOTA: I campioni per ITC devono essere preparati nello stesso tampone sia per l'aptamero che per il ligando per evitare il rilascio di calore causato dalla miscelazione di tamponi diversi dalla cella del campione e dalla siringa. Ciò si ottiene in genere attraverso la dialisi di tutti i materiali nello stesso tampone. Il buffer viene scambiato utilizzando un protocollo adattato....
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Risultati
ITC fornisce un'accurata costante di dissociazione (Kd), la stechiometria di legame e i parametri termodinamici delle interazioni a due molecole6. In questo esempio, l'aptamero selezionato da Kim et al.9,11 si lega alla tetraciclina con affinità di legame di K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. È interessante notare che questo legame è stato determinato utilizzando il metodo di filtrazio.......
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Discussione
Il metodo qui presentato è stato modificato secondo le istruzioni di TA Instruments ed è sufficiente per determinare l'affinità di legame e la termodinamica di molti aptameri e bersagli selezionati presso il nostro centro. I passaggi cruciali di questa procedura includono lo scambio del buffer per avere un target corrispondente al ligando, l'esecuzione di campioni con parametri appropriati e la ricerca del modello di adattamento di binding appropriato per analizzare i dati. La registrazione continua del rilascio di calor.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated | DNA Technologies, Inc | La sequenza è adottata dalla ricerca di Gu, che non ha identificato Kd utilizzando ITC (fare riferimento ai riferimenti 8 e 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 &; micro; L) Sistema completo– Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Sistema di calorimetria a titolazione isotermica |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Cloruro di calcio 1 M in soluzione acquosa, Centrifuga sterile di grado biotecnologico |
| Eppendorf | 5417R | L'Eppendorf 5417R è insuperabile in termini di sicurezza, affidabilità e facilità d'uso. Molto facile da mantenere con un motore brushless che gira fino a 16.400 giri/min con RCF massimo fino a 25.000 x g. | |
| Stazione di degasaggio completa (110/230V) | TA Instruments | 6326 | Questo degasatore fornisce una piattaforma di agitazione autonoma, una camera a vuoto, una porta per il vuoto, un controllo della temperatura e un timer elettronico per una corretta preparazione del campione. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7,5 |
| NanoDrop One Spettrofotometro UV-Vis a microvolume Spettrofotometro UV-Vis | ThermoFisher | ND-ONE-W | |
| Dispositivi centrifughi Nanosep, Nanosep MF e NAB Pall Laboratory | OD030C34 | Concentratore di taglio del peso molecolare da 3 kDa | |
| PBS pH 7,4 | IBI Scientific | IB70165 | Tampone contenente fosfato di sodio, cloruro di sodio, fosfato di potassio e cloruro di potassio Grado ultrapuro Sterile filtrato con 0,2 &5; m filtro. Autoclavato a 121 gradi C per più di 20 min. |
| Posi-Click 1,7 mL Provette per microcentrifuga a grande tappo | labForce (un marchio Thomas Scientific) | 1149K01 | |
| Tetraciclina, idrocoreride | EMD Millipore Corperazione | CAS64-75-5 |
Riferimenti
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.....
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Ristampe e permessi
