Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.
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Articolo metodologico
Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il midollo osseo (BM) è il tessuto molle trovato all'interno delle ossa dove si verifica principalmente l'ematopoiesi, il processo mediante il quale vengono generate nuove cellule del sangue. Come tale, contiene cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), oltre a sostenere le cellule stromali che contribuiscono al mantenimento e alla regolazione delle HSPC. I disturbi ematologici e altri disturbi del BM interrompono l'ematopoiesi colpendo direttamente le cellule ematopoietiche e/o attraverso l'alterazione della nicchia BM. Qui, descriviamo un metodo per studiare l'ematopoiesi in salute e malignità attraverso l'analisi fenotipica di BM HSPC murini e popolazioni di nicchia stromali mediante citometria a flusso. Il nostro metodo descrive in dettaglio i passaggi necessari per arricchire le cellule BM nelle frazioni BM endostali e centrali, nonché le strategie di gating appropriate per identificare i due tipi di cellule di nicchia chiave coinvolte nella regolazione HSPC, le cellule endoteliali e le cellule staminali mesenchimali. L'analisi fenotipica qui proposta può essere combinata con mutanti murini, modelli di malattia e saggi funzionali per caratterizzare il compartimento HSPC e la sua nicchia.
Introduzione
La citometria a flusso è un metodo inestimabile per caratterizzare e isolare prospetticamente le cellule immunitarie ed ematopoietiche. Viene anche sempre più utilizzato per analizzare popolazioni stromali ed epiteliali di diversi tessuti. La cellula staminale ematopoietica (HSC) ha proprietà uniche di auto-rinnovamento e multipotenza. Nei mammiferi adulti, le HSC risiedono principalmente nel midollo osseo (BM), dove ricevono segnali di quiescenza e sopravvivenza dal microambiente circostante o dalla nicchia1. Le HSC sono formalmente definite secondo i saggi funzionali2. Tuttavia, diversi documenti di riferimento hanno d....
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Protocollo
Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati alloggiati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in un ciclo luce-buio di 12 ore e in un ambiente a temperatura controllata. È stato fornito l'accesso gratuito al chow e all'acqua standard dei roditori. Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati dalla Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio per la cura e la manipolazione degli animali da laboratorio (Direttiva UE 2010/63 / UE). La procedura sperimentale eseguita sugli animali (eutanasia) è stata approvata dal Comitato etico animale i3S (rif. DD_2019_....
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Risultati
I grafici rappresentativi dell'analisi citometrica a flusso di HSC e MPP in un topo C57Bl/6 adulto sano sono mostrati nella Figura 1. La strategia di gating segue l'ultima nomenclatura armonizzante proposta dall'ISEH13. Quando si analizza l'impatto di una perturbazione, come un'infezione o un cancro, è importante utilizzare un mouse di controllo come riferimento per le porte normali. I controlli a fluorescenza meno uno (FMO) possono essere particolarmente utili per de.......
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Discussione
Mentre il protocollo descritto è semplice e facile da eseguire, è necessario prestare particolare attenzione a passaggi specifici. Ad esempio, quando si ottiene BM lavato (fase 5.2), il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato, in quanto ciò potrebbe comportare una contaminazione significativa del campione lavato da popolazioni di cellule endosteali.
È possibile apportare modifiche al protocollo per.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
LM è stato sostenuto da una sovvenzione del Lady Tata Memorial Trust. JR è stato supportato da una borsa di dottorato della Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML è stato supportato da una borsa di dottorato di dottorato da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). La DD è stata sostenuta da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Pablove Foundation, della FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e della Società portoghese di ematologia. Ringraziamo il supporto della Dott.ssa Catarina Meireles ed Emilia Cardoso della struttura TRACY di i3s.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anti-topo CD54/ICAM-1 anticorpo | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidina | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit) anticorpo | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-topo CD45 anticorpo | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-topo TER-119/cellule eritroidi anticorpo | BioLegend | 116223 | |
| Biotina anti-topo CD3ε anticorpo | BioLegend | 100304 | |
| Biotina anti-topo CD4 anticorpo | BioLegend | 100404 | |
| Biotina anti-topo CD8a anticorpo | BioLegend | 100704 | |
| Biotina anti-topo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) anticorpo | BioLegend | 108404 | |
| Biotina anticorpo anti-topo TER-119/cellule eritroidi | BioLegend | 116204 | |
| Biotina anti-topo/umano anticorpo CD11b | BioLegend | 101204 | |
| Biotina anti-topo/umano CD45R/B220 anticorpo | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-topo CD150 (SLAM) anticorpo | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 perline colorate | BD Biosciences | ||
| Collagenasi IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Siero fetale bovino, qualificato, inattivato termicamente, approvato dall'UE, Sud America Origine | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Anticorpo biotinilato R di topo | D systems | BAF497 | |
| NucBlue Reagente a cellule fisse (DAPI) | Reagente ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI |
| PE anti-topo anticorpo endomucina | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-topo Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-topo CD31 anticorpo | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cianina7 anti-topo Anticorpo CD48 | BioLegend | 103424 | |
| PerCP Anti-topo Anticorpo Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 108122 | |
| Soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) | Merck Life Science | P4417 | |
| Anticorpo purificato CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| tampone di lisi dei globuli rossi 10x | BioLegend | 420302 | |
| Colorante di vitalità fissabile viola | zombie BioLegend | 423114 | colorante fluorescente |
Riferimenti
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
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Ristampe e permessi
