Articolo metodologico

Isolamento e quantificazione del virus Epstein-Barr dalla linea cellulare P3HR1

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 settembre 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente l'isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il virus di Epstein-Barr (EBV), formalmente designato come herpesvirus umano 4 (HHV-4), è il primo virus tumorale umano isolato. Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata da EBV. Con i recenti progressi nella biologia molecolare e nell'immunologia, l'applicazione di modelli sperimentali sia in vitro che in vivo ha fornito informazioni approfondite e significative sulla patogenesi dell'EBV in molte malattie e sulla tumorigenesi associata all'EBV. Lo scopo di questo esperimento visualizzato è quello di fornire una panoramica dell'isolamento delle particelle virali EBV dalle cellule della linea cellulare P3HR1, seguita dalla quantificazione della preparazione virale. Le cellule P3HR1, originariamente isolate da un linfoma di Burkitt umano, possono produrre un virus P3HR1, che è un ceppo EBV di tipo 2. Il ciclo litico EBV può essere indotto in queste cellule P3HR1 mediante trattamento con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), producendo particelle virali EBV.

Utilizzando questo protocollo per l'isolamento delle particelle EBV, le cellule P3HR1 vengono coltivate per 5 giorni a 37 °C e al 5% di CO2 in mezzo RPMI-1640 completo contenente 35 ng/mL PMA. Successivamente, il terreno di coltura viene centrifugato ad una velocità di 120 x g per 8 minuti per pellettare le cellule. Il surnatante contenente virus viene quindi raccolto e fatto girare ad una velocità di 16.000 x g per 90 minuti per pellettare le particelle EBV. Il pellet virale viene quindi risospeso in un mezzo RPMI-1640 completo. Questo è seguito dall'estrazione del DNA e dalla PCR quantitativa in tempo reale per valutare la concentrazione di particelle EBV nel preparato.

Introduzione

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Il virus di Epstein-Barr (EBV) è il primo virus tumorale umano ad essere stato isolato1. EBV, formalmente indicato come Human herpesvirus 4 (HHV-4) 2, fa parte della sottofamiglia gamma herpes virus della famiglia dei virus dell'herpes ed è il prototipo del genere Lymphocryptovirus . Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata dal virus3. Nella maggior parte dei casi, l'infezione iniziale si verifica entro i primi 3 anni di vita ed è asintomatica, tuttavia, se l'infezione si verifica più tardi durante l'adolescenza, può dare origine a una malattia denominata mononucleosi infettiva4. L'EBV è in grado di infettare le cellule B a riposo inducendole a diventare linfoblasti B proliferativi in cui il virus stabilisce e mantiene uno stato latente di infezione5. L'EBV può riattivarsi in qualsiasi momento e quindi portare a infezioni ricorrenti6.

Negli ultimi 50 anni, l'associazione tra alcuni virus e lo sviluppo di tumori maligni umani è diventata sempre più evidente e oggi si stima che dal 15% al 20% di tutti i tumori umani siano correlati a infezioni virali7. I virus dell'herpes, tra cui EBV, sono alcuni degli esempi meglio studiati di questi tipi di virus tumorali8. Infatti, l'EBV può causare molti tipi di tumori maligni umani, come il linfoma di Burkitt (BL), il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma diffuso a grandi cellule B e le malattie linfoproliferative negli ospiti immunocompromessi 9,10. L'EBV ha anche dimostrato di essere associato allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche. Alcuni esempi di questi disturbi autoimmuni sono l'artrite reumatoide (RA), la polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), il lupus eritematoso sistemico (LES), la malattia mista del tessuto connettivo (MCTD) e la sindrome di Sjögren (SS)11. L'EBV è anche associato allo sviluppo della malattia infiammatoria intestinale (IBD)12.

Molte di queste malattie possono essere studiate o modellate utilizzando colture cellulari, topi o altri organismi infetti da EBV. Ecco perché le particelle EBV sono necessarie per infettare cellule o organismi, sia in vitro che in vivo modelli13,14,15,16, da qui la necessità di sviluppare una tecnica che consenta l'isolamento delle particelle virali a basso costo. Il protocollo qui descritto fornisce linee guida per un modo semplice per isolare in modo affidabile le particelle EBV da una linea cellulare relativamente accessibile e per quantificare le particelle utilizzando la PCR in tempo reale, che è economica e prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori. Questo è in confronto a molti altri metodi che sono stati descritti per isolare EBV da diverse linee cellulari17,18,19,20.

P3HR-1 è una linea cellulare BL che cresce in sospensione ed è latente infettata da un ceppo EBV di tipo 2. Questa linea cellulare è un produttore di EBV e può essere indotta a produrre particelle virali. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di mostrare un metodo che consente l'isolamento delle particelle EBV dalla linea cellulare P3HR-1, seguito dalla quantificazione dello stock virale che potrebbe essere successivamente utilizzato per modelli sperimentali EBV sia in vitro che in vivo .

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Protocollo

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NOTA: l'EBV deve essere considerato un materiale potenzialmente biopericoloso e quindi deve essere manipolato con un livello di contenimento 2 o superiore. È necessario indossare un camice da laboratorio e guanti. Se esiste un potenziale di esposizione agli schizzi, dovrebbe essere presa in considerazione anche la protezione degli occhi. La seguente procedura deve essere condotta in un gabinetto di sicurezza biologica.

1. Conteggio delle celle P3HR1

  1. Centrifugazione e risospensione delle celle
    1. Trasferire la sospensione cellulare da una piastra di coltura da 100 mm (o pallone T-25) di una coltura cellulare P3HR1 in corso all'80% di confluenza in un tubo conico da 15 ml. La densità di semina delle cellule P3HR-1 è 1 x 106 cellule / ml. Mantenere in completo terreno di coltura RPMI (79% RPMI terreno di coltura, 20% siero bovino fetale, 1% antibiotico Pen-Streptococco) a 37 °C e 5% CO2, e passare ogni 3-4 giorni.
    2. Centrifugare per 8 min a 120 x g. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura RPMI completo e mescolare bene (questa soluzione sarà indicata come sospensione A).
  2. Preparazione della sospensione cellulare per il conteggio
    1. Preparare una sospensione cellulare diluita B mescolando 2 μL di sospensione cellulare A con 8 μL di terreno di coltura. Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% alla sospensione B per ottenere la sospensione C. Mescolare bene la preparazione mediante pipettaggio delicato.
  3. Conteggio delle cellule mediante emocitometro
    1. Posizionare un vetrino di vetro sull'emocitometro e caricare 10 μL di sospensione C. Posizionare l'emocitometro al microscopio ottico e contare il numero di cellule che non sono colorate di blu in ciascuno dei quattro quadranti della camera dell'emocitometro utilizzando l'obiettivo del microscopio 40x (Figura 1).
    2. Il blu di Trypan colora le cellule morte di blu; Non contare queste cellule, né le cellule che toccano uno qualsiasi dei bordi superiore, inferiore, destro o sinistro di ciascun quadrante emocitometrico.
    3. Calcolare la concentrazione di cellule per ml utilizzando la seguente formula:
      figure-protocol-1
      NOTA: Il numero di quadranti contati è quattro e 10-4 ml è il volume dei quadrati sull'emocitometro. I quattro quadranti che devono essere contati sono rappresentati in verde nella figura 1. Celle totali contate nella formula è la somma del numero di celle nei quadranti 1, 2, 3 e 4. Le celle rappresentate in blu nella Figura 1 devono essere contate, mentre le celle in rosso non devono essere contate poiché toccano i bordi superiore, destro, inferiore o sinistro del quadrante.

figure-protocol-2
Figura 1: Conteggio delle cellule utilizzando una camera emocitometrica. Quattro quadranti sono contati usando un microscopio ottico; Questi quadranti sono rappresentati in verde. Totale Celle Contate nella formula indicata al punto 1.3.3 del protocollo qui descritto è la somma del numero di celle nei quadranti 1, 2, 3 e 4. Le celle indicate in blu devono essere contate, mentre le celle in rosso non devono essere contate poiché toccano i bordi superiore, destro, inferiore o sinistro del quadrante Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparare il piatto per la cultura

  1. Posizionare un volume di sospensione cellulare A in un tubo conico da 15 ml. Il volume richiesto dipende dal numero di cellule. Regolare il volume in modo tale che il numero di celle sia di circa 2,2 x 106 celle per una piastra di coltura da 100 mm.
  2. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo alla provetta e quindi trasferire il contenuto della provetta in una piastra di coltura da 100 mm. Aggiungere 80 μL di dimetilsolfossido (DMSO) alla piastra di coltura.
    NOTA: DMSO è sensibile alla luce, quindi deve essere conservato in un contenitore resistente alla luce o coperto con un materiale opaco come un foglio di alluminio.
  3. Aggiungere 350 μL di 1 mg/mL di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) al tubo. La concentrazione finale di PMA dovrebbe essere di 35 ng/ml e quella di DMSO dovrebbe essere dello 0,08%.
    ATTENZIONE: la PMA è tossica, corrosiva e cancerogena, quindi deve essere maneggiata con estrema cura. PMA è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere conservato in un contenitore resistente alla luce o coperto con un materiale opaco come un foglio di alluminio.
  4. Aggiungere 4,27 ml di terreno di coltura in modo che il volume totale sia di 10 ml. Mescolare il contenuto del tubo inclinandolo, quindi trasferire il contenuto in una piastra di coltura da 100 mm. Lasciare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 5 giorni a 37 °C, 5% CO2.

3. Induzione e isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr

  1. Dopo 5 giorni nell'incubatore, centrifugare il contenuto della piastra a 120 x g per 8 minuti per pellettare le celle. Raccogliere il surnatante privo di cellule, contenente virus e scartare il pellet cellulare.
  2. Centrifugare il surnatante a 16.000 x g per 90 minuti a 4 °C per pellettare le particelle virali. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet virale in 5 ml di terreno di coltura.
    NOTA: La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) può essere utilizzata per risospendere il pellet virale anziché il terreno di coltura.
  3. Aliquot la sospensione virale ottenuta in 20 provette, ciascuna contenente 250 μL della sospensione virale. Conservare la sospensione a -80 °C.

4. Estrazione del DNA da particelle virali

ATTENZIONE: È necessario prestare estrema attenzione quando si maneggia il fenolo, poiché è tossico e corrosivo e ha la capacità di causare gravi ustioni. Il fenolo è sensibile alla luce e si ossida a contatto con la luce o l'aria. Conservalo in un contenitore resistente alla luce o in alternativa coprire il tubo di fenolo con un materiale opaco come un foglio di alluminio.

  1. Separazione delle proteine dal DNA
    1. Aggiungere 500 μL di fenolo saturo di TrisCl in uno dei tubi da 250 μL. Aggiungere 100 μL di acqua (per aumentare il volume della fase acquosa) e vortice bene per ottenere un'emulsione rosa. Centrifugare per 15 minuti a 9650 x g.
  2. Precipitazione del DNA
    1. Raccogliere il surnatante (fase acquosa trasparente) e trasferirlo in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
    2. Aggiungere un equivalente di 1/10 del volume di acetato di sodio freddo del surnatante (3 M, pH 5,2) e mescolare mediante pipettaggio su e giù. Aggiungere 1 μL di 20 mg/mL di glicogeno e mescolare mediante pipettaggio.
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo, ma l'aggiunta di glicogeno migliora la precipitazione del DNA e rende più facile visualizzare il pellet di DNA.
    3. Aggiungere tre volte il volume del supernatante di etanolo freddo al 100%. Conservare a -80 °C durante la notte.
      NOTA: la procedura può essere interrotta qui per essere ripresa in un secondo momento. Il campione può essere conservato a -80 °C per 1 ora o, in alternativa, durante la notte. La conservazione durante la notte migliora la precipitazione del DNA ed è quindi raccomandata.
  3. Isolare il DNA virale
    1. Il giorno seguente, centrifugare a 9650 x g per 15 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per ottenere una pallina di DNA.
    2. Lavare il pellet tre volte con 1 ml di etanolo freddo al 70%, centrifugare a 9650 x g per 15 minuti e scartare il surnatante.
    3. Asciugare all'aria il pellet per circa 10 minuti. Risospendere il pellet in 10-50 μL di acqua distillata priva di nucleasi (a seconda delle dimensioni del pellet di DNA).
    4. Conservare i campioni a -20 °C per la lavorazione successiva o a 4 °C durante la notte per garantire la massima dissoluzione del DNA seguita dalla conservazione a -20 °C. In alternativa, procedere direttamente con il passaggio 5.

5. Controllo della concentrazione e della purezza del DNA

  1. Dopo aver pulito il piedistallo di un microspettrofotometro con un delicato tergicristallo, caricare 1 μL della preparazione del DNA.
  2. Notare la concentrazione del DNA nel campione. Controllare i rapporti di assorbanza in entrambi figure-protocol-3 e figure-protocol-4. Il DNA assorbirà a 260 nm, le proteine a 280 nm e le sostanze organiche come il fenolo assorbiranno a 230 nm. Un rapporto di 1,8-2 è considerato sufficiente per la PCR in tempo reale.

6. Quantificazione mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale

  1. Preparazione delle miscele di reazione PCR
    1. Posizionare 5 μL di una miscela di PCR in tempo reale verde SYBR in provette da 0,2 mL di PCR. Aggiungere a ciascun tubo 1 μL di primer in avanti da 7,5 pmol/μL e 1 μL di primer inverso da 7,5 pmol/μL. Sequenza di primer in avanti: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; sequenza di primer inversa: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Il gene amplificato per determinare il numero di copie del genoma EBV è il gene Epstein-Barr virus small RNA 2 (EBER-2).
    2. A una delle provette, aggiungere 2 μL di acqua priva di nucleasi e 1 μL di DNA virale dal punto 4. Il volume totale della miscela di reazione è di 10 μL.
      NOTA: A seconda della concentrazione di DNA nel campione, può essere necessaria una fase di diluizione. Il fattore di diluizione F deve essere annotato e sarà integrato nella formula al punto 6.3.
    3. Preparare altre provette che verranno utilizzate come standard con numeri di copia del genoma EBV noti (1000, 2000, 5000, 10.000 e 54.000 copie).
  2. Eseguire le miscele PCR iniziando con una fase iniziale di attivazione a 95 °C per 5 minuti, quindi 40 cicli a 95 °C e 58 °C (ricottura) per 15 s e 30 s, rispettivamente.
  3. Generare una curva standard qPCR tracciando i valori Ct degli standard rispetto al log del numero di copie del genoma EBV per provetta standard. Utilizzando l'equazione del grafico della curva standard, derivare il numero di copie del genoma EBV nella provetta PCR contenente il DNA virale indotto. Quindi, utilizzare la seguente formula per calcolare la concentrazione della preparazione virale indotta:
    figure-protocol-5
    Dove X è il numero di copie del genoma EBV derivate dalla curva standard e F è il fattore di diluizione utilizzato per impostare il DNA utilizzato per reazione PCR.

7. Controllo dell'attività biologica/infettività delle particelle virali

  1. Trasferire le cellule BC-3 da una piastra di coltura da 100 mm alla confluenza dell'80% a un tubo conico da 15 ml. La densità di semina delle cellule P3HR-1 è 1 x 106 cellule / ml. Mantenere in completo terreno di coltura RPMI (79% RPMI terreno di coltura, 20% siero bovino fetale, 1% antibiotico Pen-Streptococco) a 37 °C e 5% CO2, e passare ogni 3-4 giorni.
  2. Contare le cellule BC-3 nello stesso modo in cui sono state contate le cellule P3HR-1 seguendo il passaggio 1. A una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 10celle 5 BC-3 a ciascun pozzetto. Utilizzare tre, sei, nove o 12 pozzetti per garantire l'importanza dei risultati e ridurre al minimo gli errori.
  3. Aggiungere un volume di stock virale a ciascun pozzetto, a seconda della concentrazione della preparazione virale determinata nel passaggio 6.3. Il MOI può variare e l'ottimizzazione di questo protocollo rivelerà il miglior MOI per l'infezione (si raccomanda un intervallo MOI di 2-50). Assicurarsi che il volume totale della miscela presente in ciascun pozzetto sia di 250 μL.
    1. Per determinare il volume richiesto, è necessario conoscere la concentrazione dello stock virale e selezionare un MOI. Ad esempio, se il MOI è 2, il numero di particelle virali aggiunte dovrebbe essere il doppio del numero di cellule. Calcolare il volume V dello stock virale richiesto utilizzando la formula: figure-protocol-6, dove n è il numero di particelle virali necessarie e C la concentrazione nota dello stock virale
  4. Incubare il contenuto della piastra a 96 pozzetti per 5 giorni. Dopo 5 giorni, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un tubo da 1,5 ml.
  5. Centrifugare le provette a 120 x g per 8 minuti per separare le cellule dal terreno di coltura contenente virus. Sottoporre i pellet cellulari e i surnatanti all'estrazione del DNA seguita da quantificazione PCR in tempo reale per verificare la presenza di genomi virali in ogni frazione, valutando così l'infettività delle particelle virali.

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Risultati

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L'obiettivo di questa procedura è quello di isolare le particelle di EBV in una sospensione con titolo virale noto, che potrebbe successivamente essere utilizzato per modellare l'infezione da EBV. Pertanto, è della massima importanza utilizzare concentrazioni ottimali dei diversi reagenti per ottenere la massima resa EBV dalla procedura.

È stato eseguito uno studio di ottimizzazione per determinare le concentrazioni di PMA e DMSO che produrrebbero il maggior numero di particelle EBV (

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Discussione

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La produzione di particelle EBV è necessaria per comprendere la biologia di questo virus e le sue malattie associate. Qui abbiamo descritto la produzione di queste particelle dalla linea cellulare P3HR-1. Questa linea cellulare non è l'unica linea produttrice di EBV; infatti, particelle EBV sono state isolate anche dalle cellule B95-821,22 e dalla linea cellulare Raji18,19. Il ciclo litico EBV è stato in...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a ER dal Fondo di ricerca Asmar, dal Consiglio nazionale libanese per la ricerca scientifica (L-CNRS) e dal Piano di pratica medica (MPP) presso l'Università americana di Beirut.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per PCR a parete sottile da 0,2 mLThermo ScientificAB0620Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso
0,2-10 &; L Puntali con filtro per microvolumiCorning4807Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso
0,5-10 & micro; L PipettaBrandTech704770
Pipetta sierologica monouso da 10 mlCorning4488
1000 &; L Puntali per pipette filtratiQSPTF-112-1000-Q
100-1000 & micro; L PipettaEppendorf3123000063
100x20 mm Piastre di cuturaSarstedt83.1802
10-100 & micro; L PipettaBrandTech704774
15 mL Provette conicheCorning430791
200 &; micro; L Puntali per pipette filtratiQSPTF-108-200-Q
20-200 & L PipettaEppendorf3123000055
50 mL Provette conicheCorning430828
CFX96 Real-Time C-1000 TermociclatoreBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
Acqua priva di DNasi/RNasiZymo ResearchW1001-1
EBER PrimerMacrogenN/APrimer su misura
Controllo del DNA EBV (standard)VircellMBC065
Etanolo (grado di reagente di laboratorio)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Siero fetale bovinoSigmaF9665
Fresco 21 MicrocentrifugaThermo Scientific10651805
soluzione di glicogenoQiagen158930
EmocitometroBOECOBOE 01
Microscopio a luce invertitaZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Provetta per microcentrifugaCostar (Corning)3621Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso
Linea cellulare P3HR-1ATCCHTB-62
Penicillina-streptomicina SoluzioneBiowestL0022
FenoloVWR20599.297
Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139
Riempitrice per pipetteThermo Scientific9501
Salviette di precisioneKimtech7552
RPMI-1640 Terreno di colturaSigmaR7388
SL 16R CentrifugaThermo Scientific75004030
Acetato di sodioRiedel-de Haë n (Honeywell)25022
SpettrofotomeroDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Soluzione blu di tripanoSigmaT8154
Incubatore a CO2 con rivestimento d'acquaThermo Scientific4121

Riferimenti

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