Questo protocollo consente l'isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.
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Articolo metodologico
Isolamento e quantificazione del virus Epstein-Barr dalla linea cellulare P3HR1
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il virus di Epstein-Barr (EBV), formalmente designato come herpesvirus umano 4 (HHV-4), è il primo virus tumorale umano isolato. Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata da EBV. Con i recenti progressi nella biologia molecolare e nell'immunologia, l'applicazione di modelli sperimentali sia in vitro che in vivo ha fornito informazioni approfondite e significative sulla patogenesi dell'EBV in molte malattie e sulla tumorigenesi associata all'EBV. Lo scopo di questo esperimento visualizzato è quello di fornire una panoramica dell'isolamento delle particelle virali EBV dalle cellule della linea cellulare P3HR1, seguita dalla quantificazione della preparazione virale. Le cellule P3HR1, originariamente isolate da un linfoma di Burkitt umano, possono produrre un virus P3HR1, che è un ceppo EBV di tipo 2. Il ciclo litico EBV può essere indotto in queste cellule P3HR1 mediante trattamento con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), producendo particelle virali EBV.
Utilizzando questo protocollo per l'isolamento delle particelle EBV, le cellule P3HR1 vengono coltivate per 5 giorni a 37 °C e al 5% di CO2 in mezzo RPMI-1640 completo contenente 35 ng/mL PMA. Successivamente, il terreno di coltura viene centrifugato ad una velocità di 120 x g per 8 minuti per pellettare le cellule. Il surnatante contenente virus viene quindi raccolto e fatto girare ad una velocità di 16.000 x g per 90 minuti per pellettare le particelle EBV. Il pellet virale viene quindi risospeso in un mezzo RPMI-1640 completo. Questo è seguito dall'estrazione del DNA e dalla PCR quantitativa in tempo reale per valutare la concentrazione di particelle EBV nel preparato.
Introduzione
Il virus di Epstein-Barr (EBV) è il primo virus tumorale umano ad essere stato isolato1. EBV, formalmente indicato come Human herpesvirus 4 (HHV-4) 2, fa parte della sottofamiglia gamma herpes virus della famiglia dei virus dell'herpes ed è il prototipo del genere Lymphocryptovirus . Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata dal virus3. Nella maggior parte dei casi, l'infezione iniziale si verifica entro i primi 3 anni di vita ed è asintomatica, tuttavia, se l'infezione si verifica più tardi durante l'adolescenza, può dare origine a una malattia denominata mon....
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Protocollo
NOTA: l'EBV deve essere considerato un materiale potenzialmente biopericoloso e quindi deve essere manipolato con un livello di contenimento 2 o superiore. È necessario indossare un camice da laboratorio e guanti. Se esiste un potenziale di esposizione agli schizzi, dovrebbe essere presa in considerazione anche la protezione degli occhi. La seguente procedura deve essere condotta in un gabinetto di sicurezza biologica.
1. Conteggio delle celle P3HR1
- Centrifugazione e risospensione delle celle
- Trasferire la sospensione cellulare da una piastra di coltura da 100 mm (o pallone T-25) di una coltura cellulare P3....
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Risultati
L'obiettivo di questa procedura è quello di isolare le particelle di EBV in una sospensione con titolo virale noto, che potrebbe successivamente essere utilizzato per modellare l'infezione da EBV. Pertanto, è della massima importanza utilizzare concentrazioni ottimali dei diversi reagenti per ottenere la massima resa EBV dalla procedura.
È stato eseguito uno studio di ottimizzazione per determinare le concentrazioni di PMA e DMSO che produrrebbero il maggior numero di particelle EBV (
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Discussione
La produzione di particelle EBV è necessaria per comprendere la biologia di questo virus e le sue malattie associate. Qui abbiamo descritto la produzione di queste particelle dalla linea cellulare P3HR-1. Questa linea cellulare non è l'unica linea produttrice di EBV; infatti, particelle EBV sono state isolate anche dalle cellule B95-821,22 e dalla linea cellulare Raji18,19. Il ciclo litico EBV è stato in.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a ER dal Fondo di ricerca Asmar, dal Consiglio nazionale libanese per la ricerca scientifica (L-CNRS) e dal Piano di pratica medica (MPP) presso l'Università americana di Beirut.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per PCR a parete sottile da 0,2 mL | Thermo Scientific | AB0620 | Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso |
| 0,2-10 &; L Puntali con filtro per microvolumi | Corning | 4807 | Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso |
| 0,5-10 & micro; L Pipetta | BrandTech | 704770 | |
| Pipetta sierologica monouso da 10 ml | Corning | 4488 | |
| 1000 &; L Puntali per pipette filtrati | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 & micro; L Pipetta | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Piastre di cutura | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 & micro; L Pipetta | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Provette coniche | Corning | 430791 | |
| 200 &; micro; L Puntali per pipette filtrati | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 & L Pipetta | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Provette coniche | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Termociclatore | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| Acqua priva di DNasi/RNasi | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primer | Macrogen | N/A | Primer su misura |
| Controllo del DNA EBV (standard) | Vircell | MBC065 | |
| Etanolo (grado di reagente di laboratorio) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Siero fetale bovino | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 Microcentrifuga | Thermo Scientific | 10651805 | |
| soluzione di glicogeno | Qiagen | 158930 | |
| Emocitometro | BOECO | BOE 01 | |
| Microscopio a luce invertita | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Provetta per microcentrifuga | Costar (Corning) | 3621 | Deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso |
| Linea cellulare P3HR-1 | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillina-streptomicina Soluzione | Biowest | L0022 | |
| Fenolo | VWR | 20599.297 | |
| Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Riempitrice per pipette | Thermo Scientific | 9501 | |
| Salviette di precisione | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Terreno di coltura | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuga | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Acetato di sodio | Riedel-de Haë n (Honeywell) | 25022 | |
| Spettrofotomero | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Soluzione blu di tripano | Sigma | T8154 | |
| Incubatore a CO2 con rivestimento d'acqua | Thermo Scientific | 4121 |
Riferimenti
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. <....
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Ristampe e permessi
