Il presente protocollo descrive l'induzione dell'autofagia nel corpo grasso larvale della Drosophila melanogaster attraverso l'esaurimento dei nutrienti e analizza i cambiamenti nell'autofagia utilizzando ceppi di mosca transgenici.
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Articolo metodologico
Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'autofagia è un processo di autodigestione cellulare. Trasporta il carico ai lisosomi per la degradazione in risposta a vari stress, tra cui la fame. Il malfunzionamento dell'autofagia è associato all'invecchiamento e a molteplici malattie umane. Il macchinario dell'autofagia è altamente conservato, dal lievito all'uomo. Il corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster, un analogo per il fegato dei vertebrati e il tessuto adiposo, fornisce un modello unico per il monitoraggio dell'autofagia in vivo. L'autofagia può essere facilmente indotta dalla fame di nutrienti nel corpo grasso larvale. La maggior parte dei geni correlati all'autofagia sono conservati in Drosophila. Sono stati sviluppati molti ceppi di mosche transgeniche che esprimono marcatori autofagici marcati, il che facilita il monitoraggio di diverse fasi del processo di autofagia. L'analisi clonale consente un confronto ravvicinato dei marcatori di autofagia in cellule con genotipi diversi nello stesso pezzo di tessuto. L'attuale protocollo descrive le procedure per (1) generare cloni somatici nel corpo grasso larvale, (2) indurre l'autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare il corpo grasso larvale, con l'obiettivo di creare un modello per analizzare le differenze nell'autofagia utilizzando un marcatore autofagosomico (GFP-Atg8a) e l'analisi clonale.
Introduzione
L'autofagia è un processo di "auto-alimentazione" indotto da vari stress, tra cui la fame di aminoacidi1. La macroautofagia (di seguito denominata autofagia) è il tipo più studiato di autofagia e svolge un ruolo insostituibile nel mantenimento dell'omeostasi cellulare2. Il malfunzionamento dell'autofagia è associato a diverse malattie umane3. Inoltre, alcuni geni correlati all'autofagia sono potenziali bersagli per il trattamento di varie malattie4.
L'autofagia è regolata in modo altamente sofisticato5. Dopo la fame, le m....
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Protocollo
1. Incrocio della Drosophila e deposizione delle uova
- Introdurre 3 moscerini adulti maschi (genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) e 15 femmine (genotipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) in un flaconcino di coltura (con farina di mais/melassa/agar Drosophila media standard a 25 °C) per l'accoppiamento.
NOTA: Devono essere installati più flaconcini di coltura della stessa croce per garantire un numero sufficiente di larve per ulteriori esperimenti. Il ceppo di mosca maschio con genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a trasporta un sito FRT sul cromosoma X vi....
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Risultati
In condizioni di alimentazione, la proteina ubiquitina-simile marcata con GFP, GFP-Atg8a, è diffusa all'interno delle cellule. Alla fame, forma puncta verde ed etichetta autofagosomi. Una volta che gli autofagosomi si fondono con i lisosomi, la GFP viene spenta negli autolisosomi acidi e la puncta verde scompare. Se l'autofagia non viene indotta o la maturazione dell'autofagosoma viene accelerata, il numero di GFP puncta dovrebbe essere basso. Tuttavia, se la fusione tra autofagosomi e lisosomi è bloccata o il pH dell'au.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive i metodi per (1) generare mosche che trasportano cloni mutanti nei corpi grassi larvali, (2) indurre l'autofagia attraverso la fame di aminoacidi e (3) sezionare i corpi grassi larvali. Per generare cloni con successo nei corpi grassi larvali, i seguenti passaggi critici devono essere eseguiti diligentemente. (1) La tempistica accurata dello shock termico è fondamentale perché la ricombinazione mitotica avviene solo quando il tessuto è sottoposto a mitosi e (2) sia la temperatura che la du.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati a THFC e BDSC per aver fornito le varietà di mosche. Il Dr. Tong Chao è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) e dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali. Ringraziamo la struttura principale del Life Sciences Institute (LSI) per la fornitura di servizi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Pinze | Dumont | RS-5015 | |
| 9 medicazioni Piastra spot | PYREX | 7220-85 | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | SMZ1500 | |
| glicerolo | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composizione di 1x soluzione PBS |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composizione di 1x soluzione PBS |
| Spatola | da laboratorio Fisher | 14-375-10 | |
| Pinza lunga | R' DEER | RST-14 | |
| Vetro di copertura del microscopio | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Vetrini per microscopio | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composizione di 1x soluzione PBS |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composizione di 1x soluzione PBS |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Piastra di Petri | Corning | 430166 | |
| Standard farina di mais/melassa/agar cibo per mosche | Tong Lab-made Stereomicroscopio | ||
| Nikon | SMZ745 | ||
| Saccarosio | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Mezzo di montaggio antisbiadimento Vectashield con DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Mezzo |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
Riferimenti
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushi....
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Ristampe e permessi
