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Articolo metodologico

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

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DOI:

10.3791/64308

⸱

20 gennaio 2023

 ,  , 
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Abstract

L'immunità innata fornisce la prima linea di difesa critica in risposta agli agenti patogeni e agli insulti sterili. Una componente meccanicistica chiave di questa risposta è l'inizio della morte cellulare immunoprogrammata innata (PCD) per eliminare le cellule infette o danneggiate e propagare le risposte immunitarie. Tuttavia, l'eccesso di PCD è associato a infiammazione e patologia. Pertanto, la comprensione dell'attivazione e della regolazione della PCD è un aspetto centrale della caratterizzazione delle risposte immunitarie innate e dell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici in tutto lo spettro della malattia.

Questo protocollo fornisce metodi per caratterizzare l'attivazione immunitaria innata della PCD monitorando le caspasi, una famiglia di proteasi dipendenti dalla cisteina che sono spesso associate a diversi percorsi di PCD, tra cui apoptosi, piroptosi, necroptosi e PANoptosi. I rapporti iniziali hanno caratterizzato la caspasi-2, la caspasi-8, la caspasi-9 e la caspasi-10 come caspasi iniziatrici e le caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7 come caspasi effettrici nell'apoptosi, mentre studi successivi hanno scoperto che le caspasi infiammatorie, caspasi-1, caspasi-4, caspasi-5 e caspasi-11, guidano la piroptosi. È ormai noto che esiste un'ampia diafonia tra le caspasi e altre molecole innate di morte immunitaria e cellulare attraverso i percorsi PCD precedentemente definiti, identificando una lacuna di conoscenza chiave nella comprensione meccanicistica dell'immunità innata e della PCD e portando alla caratterizzazione della PANoptosis. La PANoptosi è una via PCD infiammatoria immunitaria innata unica regolata da complessi PANoptosoma, che integrano componenti, comprese le caspasi, da altre vie di morte cellulare.

Qui vengono forniti metodi per valutare l'attivazione delle caspasi in risposta a vari stimoli. Questi metodi consentono la caratterizzazione delle vie della PCD sia in vitro che in vivo, poiché le caspasi attivate subiscono una scissione proteolitica che può essere visualizzata mediante western blotting utilizzando anticorpi e condizioni di blotting ottimali. Sono stati stabiliti un protocollo e un flusso di lavoro western blotting che consentono la valutazione dell'attivazione di più caspasi dalla stessa popolazione cellulare, fornendo una caratterizzazione completa dei processi PCD. Questo metodo può essere applicato in tutte le aree di ricerca in sviluppo, omeostasi, infezione, infiammazione e cancro per valutare i percorsi PCD attraverso i processi cellulari in salute e malattia.

Introduzione

Il sistema immunitario innato agisce come prima linea di difesa durante l'infezione e in risposta a stimoli sterili, come lesioni tissutali e alterazioni dell'omeostasi. I sensori immunitari innati sulla superficie cellulare e nel citoplasma rispondono ai modelli molecolari associati a patogeni o danni (PAMP o DAMP, rispettivamente) per innescare vie di segnalazione infiammatoria e risposte cellulari. Uno dei processi chiave della risposta immunitaria innata è l'induzione della morte cellulare per rimuovere le cellule infette o danneggiate e guidare ulteriori risposte immunitarie innate e adattative. La morte cellulare programmata (PCD) è un processo altamente conservato tra le specie, evidenziando la sua importanza evolutiva come meccanismo immunitario innato.

Esistono diversi percorsi immunitari innati della PCD che possono essere attivati in tutti i tipi di cellule. Le caspasi sono una famiglia chiave di proteasi altamente conservate, intracellulari, dipendenti dalla cisteina che sono fondamentali in molte vie della PCD, compresa la via dell'apoptosi tradizionalmente non infiammatoria, così come le vie infiammatorie della PCD come la piroptosi, la necroptosi e la PANoptosi 1,2,3,4,5 . Ci sono 11 caspasi umane e 10 murine che sono ben definite, così come pseudo-caspasi che possono essere funzionali, e la maggior parte sono costitutivamente espresse come pro-caspasi monomeriche o dimeriche inattive che richiedono la scissione per l'attivazione 6,7. Le caspasi contengono anche importanti domini per il reclutamento e la formazione di complessi multiproteici. Questi includono il dominio di attivazione e reclutamento delle caspasi (CARD), che può essere trovato in caspasi-1, caspasi-2, caspasi-4, caspasi-5, caspasi-9 e caspasi-11, o il dominio effettore della morte (DED), che si trova in caspasi-8 e caspasi-10. Attraverso la loro attività proteolitica e la loro capacità di formare complessi multiproteici, le caspasi sono fattori critici della PCD immunitaria innata.

Il ruolo delle caspasi nella PCD immunitaria innata è stato identificato per la prima volta nell'apoptosi, dove le caspasi iniziatrici, caspasi-2, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-10, attivano le caspasi del boia, caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7, per guidare la morte cellulare 8,9,10,11,12. Le caspasi iniziatrici possono essere attivate da diverse cascate di segnalazione; La via estrinseca attiva la caspasi-8 attraverso la segnalazione del recettore di morte indotta dal ligando extracellulare e la via intrinseca attiva la caspasi-9 attraverso l'interruzione dell'integrità mitocondriale13. Le caspasi iniziatrici attivate fendono il linker separando le subunità catalitiche grandi e piccole delle caspasi del boia per produrre le loro forme attive. Le caspasi del boia quindi fendono i loro substrati per disassemblare la cellula, con conseguente degradazione del DNA, blebbing della membrana, frammentazione nucleare e rilascio di corpi apoptotici14,15. Questo processo termina tipicamente in una forma non litica e non infiammatoria di morte cellulare quando accoppiato con l'immediata eliminazione delle cellule morenti mediante efferocitosi16. Tuttavia, difetti nell'efferocitosi o una mancanza di cellule fagocitiche possono portare all'accumulo di cellule apoptotiche, che poi subiscono la morte cellulare litica e infiammatoria17,18.

Le caspasi infiammatorie, tra cui caspasi-1 (uomo e topo), caspasi-4 e caspasi-5 (umana) e caspasi-11 (topo), sono state scoperte per essere attivate durante una forma di infiammatoria innata immune PCD (III-PCD) chiamata piroptosi. L'attivazione della caspasi-1 è associata alla formazione di inflammasomi, che sono complessi multiproteici contenenti un sensore immunitario innato citosolico, una molecola adattatrice (proteina simile allo speck associata all'apoptosi contenente una CARD [ASC]) e caspasi-1. La formazione di questo complesso consente alla caspasi-1 di sottoporsi ad autoproteolisi mediata dalla prossimità per rilasciare la sua forma attiva, che può scindere substrati bersaglio tra cui le citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 e la molecola formante pori gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspasi-11, caspasi-4 e caspasi-5 possono anche attivare GSDMD senza la formazione a monte dell'inflammasoma dopo aver rilevato PAMP come il lipopolisaccaride (LPS)19,20. Queste caspasi subiscono dimerizzazione seguita da oligomerizzazione e auto-scissione per l'attivazione dopo il legame a LPS citosolico, che porta all'attivazione non canonica dell'inflammasoma 24,25,26 e all'attivazione della caspasi-1 in modo intrinseco cellulare per indurre la maturazione di IL-1β e IL-18 20. La maturazione e il rilascio di queste citochine pro-infiammatorie caratterizzano queste caspasi come "infiammatorie". Inoltre, è stato scoperto che la caspasi-8 apoptotica si localizza nell'inflammasoma, fornendo un collegamento tra i processi apoptotici e piroptotici. Gli studi hanno scoperto che la caspasi-8 apoptotica è anche fondamentale per regolare un'altra forma di PCD chiamata necroptosi. La perdita di caspasi-8 provoca l'attivazione spontanea della serina-treonina chinasi 3 (RIPK3)-mediata dalla linea mista chinasi chinasi (MLKL) per guidare la via III-PCD della necroptosi 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mentre le caspasi sono state storicamente classificate come "apoptotiche" o "infiammatorie" in base al tipo di morte cellulare che iniziano, prove crescenti suggeriscono che esiste un'ampia diafonia tra le vie immunitarie innate della PCD attraverso le caspasi 3,4. Ad esempio, la caspasi-1 infiammatoria degli inflammasomi fende la caspasi-7 apoptotica nel suo sito di attivazione canonico34. L'attivazione della caspasi-1 può anche portare alla scissione di substrati apoptotici come la poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP1)36. Nelle cellule prive di GSDMD, la caspasi-1 può anche scindere la caspasi-337,38. Inoltre, la caspasi-3 canonicamente apoptotica può scindere il gasdermina E (GSDME) per indurre PCD17,18 e anche elaborare GSDMD in una forma inattiva40. Inoltre, il reclutamento della caspasi-8 nel complesso dell'inflammasoma è stato osservato 39,40,41,42,43,44,45, e la caspasi-8 è un regolatore chiave dell'attivazione dell'inflammasoma canonico e non canonico 39. Ci sono anche ruoli sovrapposti e ridondanti per la caspasi-8 e la caspasi-1 in molte condizioni infiammatorie, e la PCD immunitaria innata caratterizzata dall'attivazione di componenti piroptotiche, apoptotiche e necroptotiche si verifica attraverso lo spettro della malattia 39,46,47,48,49,50.

Sulla base di questa diafonia tra caspasi infiammatorie e apoptotiche, è stata identificata una lacuna chiave nella comprensione meccanicistica dell'immunità innata e della PCD, che ha portato alla scoperta della PANoptosi. La PANoptosi è una forma unica di III-PCD che viene attivata in risposta a patogeni, PAMP, DAMP e alterazioni dell'omeostasi ed è regolata da PANoptosomi - complessi macromolecolari sfaccettati che integrano componenti provenienti da altre vie di morte cellulare 44,50,51,52,53,54,55 . La totalità degli effetti biologici nella PANoptosi non può essere spiegata individualmente dalla piroptosi, dall'apoptosi o dalla necroptosi da sola 3,4,35,36,39,46,47,48, poiché la PANoptosi è caratterizzata dall'attivazione di più caspasi, tra cui caspasi-1, caspasi-11, caspasi-8, caspasi-9, caspasi-3 e/o caspasi-7, a seconda del contesto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La panoptosi è stata sempre più implicata nelle malattie infettive e infiammatorie, così come nei tumori e nelle terapie antitumorali 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Dato il ruolo essenziale delle caspasi attraverso le vie di morte cellulare, tra cui apoptosi, piroptosi, necroptosi e PANoptosi, è importante sviluppare tecniche per caratterizzare la loro attivazione e comprendere la piena complessità delle vie PCD. Il protocollo qui descrive un metodo per stimolare le cellule e misurare la successiva attivazione delle caspasi (Figura 1). Questo metodo sfrutta la scissione proteolitica delle caspasi, che è generalmente richiesta per la loro attivazione, come mezzo per studiarle. Attraverso il western blotting, le dimensioni delle proteine possono essere determinate, consentendo la chiara visualizzazione e differenziazione delle pro-caspasi inattive e delle loro forme attivate e scisse.

I principali vantaggi di questo protocollo sono 1) la sua capacità di valutare l'attivazione di più caspasi in parallelo da una singola popolazione di cellule endogene per determinare con maggiore precisione l'attivazione della PCD e 2) l'uso di tecniche di laboratorio relativamente semplici che non richiedono una formazione approfondita o attrezzature costose. I protocolli precedenti hanno utilizzato western blotting, reporter fluorescenti o colorazione anticorpale per monitorare l'attivazione della caspasi in supernatanti di coltura, lisati cellulari e tissutali, cellule intere tramite microscopia e in vivo 67,68,69,70,71, ma queste tecniche generalmente monitorano solo una o due caspasi in un campione. Inoltre, mentre substrati peptidici sintetici contenenti siti di scissione delle caspasi che diventano fluorescenti sulla scissione sono stati utilizzati per monitorare l'attivazione della caspasi nei lisati cellulari o tissutali69, questi substrati possono spesso essere scissi da più di una caspasi, rendendo difficile determinare l'attivazione specifica delle singole caspasi in questo sistema. Inoltre, l'uso del western blotting piuttosto che l'uso di reporter fluorescenti o altri metodi basati su tag consente ai ricercatori di utilizzare cellule endogene piuttosto che creare linee cellulari specifiche con geni reporter. Ci sono molteplici vantaggi nell'utilizzare cellule endogene, incluso il fatto che molte linee cellulari immortalizzate sono carenti di molecole chiave di morte cellulare72,73, che potrebbero influenzare i risultati. Inoltre, l'utilizzo di cellule endogene consente la valutazione di diversi tipi di cellule, come macrofagi, cellule epiteliali e cellule endoteliali, piuttosto che un singolo lignaggio. Il Western blotting è anche una tecnica relativamente semplice ed economica che può essere eseguita nei laboratori di tutto il mondo senza la necessità di attrezzature grandi e costose o configurazioni complicate.

Questo protocollo è ampiamente applicabile in tutta la biologia per comprendere sia le funzioni dipendenti dalla morte cellulare che quelle indipendenti dalla morte cellulare delle caspasi, compresi i loro ruoli e funzioni di impalcatura in altre vie di segnalazione infiammatoria74. L'applicazione di questo metodo consente un approccio unificato nello studio delle vie immunitarie innate della PCD e della segnalazione infiammatoria attraverso malattie e condizioni, e questo protocollo può essere utilizzato per identificare processi regolatori critici e connessioni meccanicistiche che informeranno lo sviluppo di future strategie terapeutiche.

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Protocollo

L'uso e le procedure degli animali sono stati approvati dal comitato dell'ospedale pediatrico St. Jude sull'uso e la cura degli animali.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare i supporti condizionati da L929.
    1. Piastra 1 × 106 cellule L929 (vedere tabella dei materiali) in un matraccio di coltura tissutale da 182 cm2 contenente 50 ml di terreno di coltura L929 (vedere tabella 1 per la preparazione del terreno).
    2. Far crescere le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
    3. Dopo 7 giorni, raccogliere il surnatante e filtrare utilizzando un filtro da 0,45 μm. Preparare 50 ml di aliquote (conservare le aliquote congelate a -80 °C per un massimo di 1 anno).
  2. Preparare 500 ml di terreni di coltura per macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) (Tabella 1).
  3. Preparare 500 ml di mezzi di stimolazione BMDM (Tabella 1).
  4. Preparare 500 mL di terreno per l'infezione (Tabella 1).
  5. Preparare 100 mL di tampone Tris da 1 M (Tabella 1).
  6. Preparare 4x tampone di dodecilsolfato di sodio (SDS) (Tabella 1).
  7. Preparare 1 mL di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT, Tabella 1).
  8. Preparare 40 mL di tampone di lisi caspasica (Tabella 1).
  9. Preparare 100 mL di tampone Tris da 1,5 M (Tabella 1).
  10. Preparare 100 mL di una soluzione SDS al 10% (wt/vol) (Tabella 1).
  11. Preparare 50 ml di un tampone 2x per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Tabella 1).
  12. Preparare una soluzione di LPS da 5 mg/mL (Tabella 1).
  13. Preparare una soluzione di ATP 0,5 M (Tabella 1).
  14. Preparare le soluzioni di western blotting.
    1. Preparare 1 L di 5x scorta tampone funzionante (Tabella 1).
    2. Preparare 1 L di 10x scorta tampone di trasferimento (Tabella 1).
    3. Preparare 1 L di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 (TBST, Tabella 1).
    4. Preparare 100 mL di una soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol) (Tabella 1).
  15. Preparare le soluzioni anticorpali primarie.
    1. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-1 (Tabella 1).
    2. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-11 (Tabella 1).
    3. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-3 (Tabella 1).
    4. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-7 (Tabella 1).
    5. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-8 (Tabella 1).
    6. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-9 (Tabella 1).
    7. Preparare 10 mL di anticorpo primario β-actina coniugato HRP (Tabella 1).
  16. Preparare le soluzioni anticorpali secondarie.
    1. Preparare 10 mL di anticorpo secondario anti-coniglio (Tabella 1).
    2. Preparare 10 mL di anticorpo secondario anti-topo (Tabella 1).
    3. Preparare 10 ml di anticorpo secondario anti-ratto (Tabella 1).

2. Isolamento dei macrofagi derivati dal midollo osseo

NOTA: Per questo protocollo, possono essere utilizzati topi wild-type di 6-10 settimane con percorsi PCD intatti o topi mutanti con regolatori PCD, effettori o molecole di interesse cancellati o alterati.

  1. Eutanasia di un topo in una camera CO 2 con una portata che sposta il 10% -30% del volume della gabbia al minuto per2-3 minuti. Quindi, eseguire un metodo di eutanasia secondaria, come la lussazione cervicale. Seguire tutte le linee guida e i regolamenti aggiuntivi specifici per strutture, istituzioni e governi, ove applicabili.
  2. Seziona il topo per recuperare le ossa della zampa posteriore.
    1. Blocca il mouse sulla schiena in modo che l'addome sia esposto. Spruzzare con etanolo al 70% (vol/vol) per sterilizzare le zampe posteriori e l'addome.
      ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile. Tenerlo lontano da fiamme libere.
    2. Usa le forbici per fare un'incisione sulla linea mediana dell'addome; Continua a tagliare verso le gambe per rendere visibili i femori.
    3. Prendi la gamba posteriore destra e allontana la pelle dal corpo verso la linea mediana. Staccare la gamba dal corpo recidendo i muscoli adduttori verso la linea mediana; Quindi, tagliare la gamba tra l'articolazione dell'anca e la colonna vertebrale. Quindi, tagliare la zampa distalmente alla caviglia e rimuovere il tessuto in eccesso dall'osso staccando la pelle e usando le forbici leggermente aperte per rimuovere il tessuto del polpaccio.
    4. Posizionare la gamba su un asciugamano imbevuto di etanolo al 70% (vol / vol) e sezionare la tibia e il femore.
      1. Stringere la tibia e il femore ciascuno con una pinza separata. Premere delicatamente la tibia contro la direzione naturale dell'articolazione del ginocchio; Ciò causerà la rottura della tibia al ginocchio.
      2. Utilizzare la pinza e le forbici da dissezione, se necessario, per rimuovere eventuali tessuti appesi rimanenti. Salvare la tibia per un uso successivo posizionandola sull'asciugamano imbevuto di etanolo.
      3. Raccogli il femore allo stesso modo, staccando il ginocchio.
    5. Ripeti i passaggi 3 e 4 sopra per la gamba sinistra per rimuoverla dal corpo e sezionare la tibia e il femore.
    6. Spruzzare le ossa con etanolo al 70% (vol/vol).
    7. Pulire le ossa mettendole su un asciugamano pulito imbevuto di etanolo al 70% (vol / vol), schiacciando la parte carnosa nell'asciugamano e strofinando l'asciugamano contro l'osso per rimuovere il tessuto in eccesso.
  3. Una volta che entrambi i femori ed entrambe le tibie sono puliti, spruzzare tutte e quattro le ossa con etanolo al 70% (vol / vol). Raccogliere le ossa in una capsula di Petri sterile e sciacquarle con 10 ml di terreno di coltura BMDM facendo scorrere delicatamente il terreno nel piatto.
  4. Riempire una siringa da 10 mL con 10 mL di terreno di coltura BMDM fresco e inserire un ago da 25 G.
  5. Raccogli la tibia usando una pinza; Quindi, tagliare l'articolazione della caviglia con un angolo di ~ 45 °.
  6. Lavare il midollo osseo dalla tibia.
    1. Tenere la tibia su un tubo da 50 ml, con l'estremità stretta della tibia rivolta verso il basso. Erogare il supporto sulla tibia dalla siringa piena.
    2. Inserire l'ago (delicatamente all'inizio) all'estremità superiore del midollo ed erogare il supporto.
    3. Rimuovere l'ago e quindi inserirlo di nuovo. Utilizzare brevi spinte ad alta pressione per erogare il supporto e spostare l'ago nel midollo.
    4. Una volta che il mezzo inizia a fluire dal fondo dell'osso, utilizzare brevi spinte ad alta pressione per continuare a scovare le cellule. Monitorare il colore dell'osso durante questo processo e, quando l'osso è bianco, scartarlo.
    5. Fallo per entrambe le tibie.
  7. Ripeti i passaggi 5 e 6 sopra per i femori, tagliando l'articolazione dell'anca poiché la tibia è stata tagliata all'articolazione della caviglia. Utilizzare lo stesso tubo da 50 ml per raccogliere i terreni di coltura BMDM mentre il midollo viene lavato.
  8. Una volta che tutte e quattro le ossa sono state lavate, aspirare il midollo e il mezzo dal tubo da 50 mL su e giù 3 volte attraverso un ago da 18 G su una siringa da 10 ml, sciacquando i lati del tubo ogni volta per disperdere il midollo.
  9. Regolare il volume finale nel tubo da 50 mL a 30 mL con terreni di coltura BMDM e assicurarsi che le cellule siano completamente sospese.
  10. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per filtrare il terreno di coltura BMDM dal tubo da 50 ml.
  11. Placcare la sospensione cellulare risultante, che contiene le cellule progenitrici del midollo osseo, in tre piastre di coltura tissutale da 150 mm aggiungendo 10 ml (o ~ 20 × 106 cellule) a ciascuna. Quindi, aggiungere altri 10 ml di terreno di coltura BMDM a ciascun piatto. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C.

3. Differenziazione dei BMDM e placcatura per gli esperimenti

  1. Incubare le cellule progenitrici del midollo osseo placcate a 37 °C per 3 giorni. Quindi, rimuovere ogni piatto e aggiungere altri 5-8 ml di terreno di coltura BMDM (Tabella 1). Tornare all'incubatore a 37 °C.
  2. Il giorno 5 dopo la placcatura iniziale, rimuovere ogni piatto e aggiungere altri 5 ml di terreno di coltura BMDM. Tornare all'incubatore a 37 °C.
  3. Il giorno 6, rimuovere ogni piatto e scartare il supporto. Quindi, aggiungere 10 ml di PBS freddo (conservato a 4 °C) per lavare una volta. Eliminare i 10 mL di lavaggio PBS freddo. Quindi, aggiungere 10 ml di PBS fresco e freddo a ciascun piatto e incubare ogni piatto sul ghiaccio per 5 minuti.
  4. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare delicatamente le cellule da tutti e tre i piatti in un tubo da 50 ml. Far ruotare delicatamente le cellule a 270 × g a 4 °C per 5 minuti; Quindi, scartare il surnatante.
  5. Aggiungere 20 ml di terreno di coltura BMDM, pipettare su e giù per risospendere il pellet e contare le cellule.
    NOTA: Si prevede che ogni topo produrrà circa 60 × 10 6-100 × 106 celle.
  6. Pianificare il layout della piastra a 12 pozzetti per il test di stimolazione della morte cellulare / infiammazione in vitro desiderato. Pianificare di placcare 1 × 106 celle per pozzetto. Per ogni stimolazione pianificata, includere almeno tre repliche biologiche e placcare una serie di pozzetti da raccogliere in tampone di lisi caspasi e una seconda serie di pozzetti da raccogliere in tampone RIPA.
  7. Piastra 1 × 106 cellule in 1 mL di terreno di coltura BMDM per pozzetto in piastre da 12 pozzetti. Coltura durante la notte in incubatore umidificato a 37 °C prima di procedere alla valutazione della morte cellulare/infiammazione. Dopo l'incubazione durante la notte, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di PBS caldo (37 °C) a ciascun pozzetto per lavare le cellule.
  8. Rimuovere il lavaggio PBS e aggiungere 500 μL di mezzi di stimolazione BMDM con antibiotici (se si eseguono stimolazioni non batteriche) o mezzi di stimolazione BMDM senza antibiotici (se si eseguono stimolazioni batteriche) (Tabella 1). Incubare per 2 ore prima di passare alla fase 4 per la stimolazione/infezione in vitro .

4. Stimolare o infettare le cellule

ATTENZIONE: Gli agenti inclusi in questo protocollo sono potenzialmente patogeni e devono essere maneggiati con le precauzioni appropriate in una struttura di livello di biosicurezza 2 (BSL2) con l'approvazione delle autorità istituzionali e governative competenti.

  1. Stimolare i BMDM ad attivare la morte cellulare con il trigger di interesse.
    NOTA: Ai fini del presente protocollo, virus dell'influenza A (IAV), virus dell'herpes simplex 1 (HSV1), Francisella novicidae LPS + ATP vengono utilizzati per l'illustrazione, ma è possibile utilizzare altri trigger.
    1. Esempio di stimolazione 1: Infettare con IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (costruito secondo Hoffmann et al.75; il titolo virale per la determinazione della molteplicità dell'infezione [MOI] è calcolato da un test di placca nelle cellule MDCK):
      1. Calcolare il volume di virus necessario per l'infezione a una molteplicità di infezione (MOI) di 20 unità formanti placca (PFU) utilizzando l'equazione (1) e l'equazione (2):
        figure-protocol-1
        figure-protocol-2
        figure-protocol-3
      2. Rimuovere il mezzo dai BMDM e lavare le cellule una volta con 500 μL di PBS. Aggiungere 450 μL di IAV (20 MOI) in DMEM ad alto contenuto di glucosio senza termo-inattivato (HI)-FBS a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 1 h in un incubatore umidificato per consentirne l'assorbimento.
      3. Rimuovere le piastre e aggiungere 50 μL di HI-FBS. Riportare le piastre nell'incubatore a 37 °C. Incubare per un totale di 12 h.
    2. Esempio di stimolazione 2: Infettare con HSV1 (ceppo HF; coltivato come descritto in precedenza44; il titolo virale per la determinazione del MOI è calcolato mediante un test di placca nelle cellule Vero):
      1. Calcola il volume di virus necessario per l'infezione a un MOI di 10 PFU utilizzando l'equazione (1) e l'equazione (2) dal passaggio 1 nella sezione sull'infezione IAV sopra.
        figure-protocol-4
      2. Rimuovere il supporto dai BMDM. Aggiungere 450 μL di HSV1 (MOI 10) in DMEM ad alto contenuto di glucosio senza HI-FBS a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 1 h in un incubatore umidificato per consentirne l'assorbimento.
      3. Rimuovere le piastre e aggiungere 50 μL di HI-FBS. Riportare le piastre nell'incubatore a 37 °C. Incubare per un totale di 12 h.
    3. Esempio di stimolazione 3: Infettare con F. novicida (ceppo U112; coltivato come descritto in precedenza44 in condizioni aerobiche a 37 °C in BBL Brodo di soia tripticasi integrato con 0,2% di L-cisteina durante la notte. Quindi, sottocoltura i batteri in un rapporto di 1:10 a 37 °C per altre 4 ore in mezzo fresco prima di prendere la densità ottica (OD) a 600 nm usando il terreno fresco come un bianco. Un valore OD pari a 1 equivale a 1 × 109 unità formanti colonie (CFU) per ml.)
      1. Calcolare il volume di F. novicida necessario per l'infezione a un MOI di 50 CFU utilizzando l'equazione (3) e l'equazione (4):
        figure-protocol-5
        figure-protocol-6
        figure-protocol-7
      2. Rimuovere il supporto dai BMDM. Aggiungere 500 μL di F. novicida (MOI 50) in mezzi di stimolazione BMDM senza antibiotici a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 4 ore in un incubatore umidificato per consentirne l'assorbimento.
      3. Lavare le cellule tre volte con PBS riscaldato (37 °C) e aggiungere 500 μL di mezzi di stimolazione BMDM contenenti 50 μg/mL di gentamicina. Riportare le piastre nell'incubatore a 37 °C. Incubare durante la notte (16 h).
    4. Esempio di stimolazione 4: Stimolare con LPS + ATP.
      1. Rimuovere il mezzo dai BMDM. Aggiungere 500 μL di mezzi di stimolazione BMDM con antibiotici (Tabella 1) contenenti 100 ng/mL LPS a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 3,5 ore in un incubatore umidificato.
      2. Aggiungere 5 μL di soluzione madre di ATP 0,5 M (Tabella 1) a ciascun pozzetto. Riportare le piastre nell'incubatore a 37 °C. Incubare per 30 min.

5. Raccolta del supernatante combinato e del lisato proteico da utilizzare per le caspasi western blots

  1. Dopo 4 ore, 12 ore o 16 ore di incubazione (la tempistica specifica dipende dal grilletto utilizzato), rimuovere la piastra dall'incubatore.
  2. Rimuovere 150 μL del surnatante; scartarlo o conservarlo per altre analisi del surnatante (ad esempio, saggio di immunoassorbimento enzimatico [ELISA]). Non rimuovere il surnatante rimanente.
  3. Creare la soluzione di raccolta proteica combinando 50 μL di tampone di lisi caspasica + 100 μL di 4x tampone SDS per pozzetto (Tabella 1). Quindi, aggiungere 150 μL della miscela a ciascun pozzetto.
  4. Per ogni pozzetto, pipettare la miscela su e giù per raccogliere le cellule lisate e surnatante. Durante il pipettaggio, raschiare anche il fondo del pozzetto con la punta della pipetta per interrompere le cellule. Dopo aver raschiato e pipettato, raccogliere il lisato proteico in provette marcate da 1,5 ml.
  5. Utilizzare un blocco termico per riscaldare tutti i tubi a 100 °C per 12 minuti.
  6. Pellettare eventuali componenti insolubili centrifugando a 14.500 × g per 30 s a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo è un punto di pausa: la proteina del surnatante combinato e dei lisati proteici può essere utilizzata immediatamente o conservata a -20 °C per un massimo di 2 mesi o a -80 °C per un massimo di 6 mesi fino al momento dell'uso.

6. Raccolta del lisato proteico da utilizzare per le macchie occidentali di caspasi

  1. Dopo 4 ore, 12 ore o 16 ore di incubazione (la tempistica specifica dipende dal grilletto utilizzato), rimuovere la piastra dall'incubatore. Rimuovere tutto il surnatante; scartarlo o salvarlo per altre analisi surnatanti (ad esempio, ELISA).
  2. Creare il tampone 1x RIPA diluendo la soluzione madre 2x RIPA (Tabella 1) in un volume uguale di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere una compressa di inibitore della fosfatasi e una compressa di inibitore della proteasi e lasciarli dissolvere. Aggiungere 150 μL di 1x tampone RIPA e 50 μL di 4x SDS a ciascun pozzetto.
  3. Per ogni pozzetto, pipettare la miscela su e giù per raccogliere le cellule lisate. Durante il pipettaggio, raschiare anche il fondo del pozzetto con la punta della pipetta per interrompere le cellule. Dopo aver raschiato e pipettato, raccogliere il lisato proteico in provette marcate da 1,5 ml.
  4. Utilizzare un blocco termico per riscaldare tutti i tubi a 100 °C per 12 minuti.
  5. Pellettare eventuali componenti insolubili centrifugando a 14.500 × g per 30 s a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo è un punto di pausa: i lisati proteici possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -20 °C o -80 °C fino al momento dell'uso.

7. Esecuzione del western blotting utilizzando i lisati raccolti dai BMDM seguendo i passaggi precedenti o da omogenati tissutali

NOTA: Se si utilizza il tessuto, può essere omogeneizzato a mano o attraverso un omogeneizzatore tissutale azionato elettricamente. Il protocollo di Simpson76 fornisce una descrizione dettagliata dell'omogeneizzazione dei tessuti.

  1. Preparare 1x tampone corrente: combinare 200 ml di 5x tampone corrente (Tabella 1) e 800 mL di acqua deionizzata. Crea questo buffer in esecuzione 1x appena prima di ogni esperimento.
  2. Preparare l'apparecchio di elettroforesi con un gel di poliacrilammide al 12% (wt/vol) con 10 pozzetti. Riempire l'apparecchio di elettroforesi con 1x tampone di funzionamento. Quindi, rimuovere il pettine in gel.
    NOTA: Per analizzare caspasi-1, caspasi-11, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8 e caspasi-9 per ciascun campione, saranno necessari sei gel.
  3. Per i blot caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7 e caspasi-8, pianificare di utilizzare 30 μL del supernatante combinato e del lisato proteico nel tampone di lisi caspasica o nell'omogenato tissutale. Per le macchie di caspasi-11 e caspasi-9, pianificare di utilizzare 20 μL del lisato proteico nel tampone RIPA o nell'omogenato tissutale. Se i campioni sono stati conservati a -20 °C o -80 °C, scongelarli prima sul ghiaccio.
  4. Per tutti i campioni, riscaldare a 100 °C per 5 minuti e centrifugare a 14.500 × g per 30 s a 4 °C prima del carico. Quindi, caricare lentamente 20 o 30 μL del campione in ciascuna corsia. Evitare che il campione trabocchi nelle altre corsie. Per valutare tutte e sei le caspasi contemporaneamente, utilizzare la stessa procedura per caricare i campioni appropriati in ciascuno dei sei gel.
  5. Collegare l'apparecchio di elettroforesi alla fonte di alimentazione. Quindi, impostare la potenza su 80 V per 20 minuti per iniziare la corsa del gel, quindi regolare la potenza su 130 V per 45-60 minuti.
  6. Osservare attentamente la parte anteriore del colorante e spegnere l'alimentazione quando la parte anteriore del colorante si trova nella parte inferiore del gel ma non è ancora stata espulsa dal gel.
  7. Mentre il gel è in funzione, preparare 1x tampone di trasferimento combinando 700 mL di acqua deionizzata, 100 mL del buffer di trasferimento 10x (Tabella 1) e 200 mL di metanolo. Rendere la soluzione 1x fresca ogni volta.
    NOTA: Prestare attenzione poiché il metanolo è infiammabile. Eseguire la preparazione del buffer di trasferimento lontano da fiamme libere.
  8. Rimuovere delicatamente il gel dall'apparecchio di elettroforesi utilizzando il raccoglitore di gel.
  9. Impostare uno stack di trasferimento per ogni gel.
    1. Attivare una membrana PVDF immergendola nel metanolo per 1 minuto.
    2. Pre-bagnare due pezzi di carta da filtro, il gel e la membrana PVDF in tampone di trasferimento per 5 minuti. Conservare la membrana PVDF e il gel in contenitori separati durante questa incubazione di 5 minuti.
    3. Assemblare la pila di trasferimento sul sistema semi-secco. Iniziando dal lato inferiore dell'anodo di platino, posizionare un pezzo di carta da filtro, la membrana PVDF, il gel e infine un pezzo di carta da filtro. Stendere delicatamente o premere le bolle d'aria tra gli strati e chiudere la parte superiore del sistema. Assicurarsi che la copertura di sicurezza sia assicurata prima di procedere ulteriormente.
  10. Collegare alla fonte di alimentazione. Impostare l'alimentazione su 25 V per 45 min.
  11. Al termine del trasferimento, smontare la pila di trasferimento e raccogliere la membrana; metterlo in una capsula di Petri quadrata (vassoio di incubazione).
  12. Eseguire il blocco della membrana aggiungendo 15 ml di una soluzione di latte scremato al 5% (wt/vol) (Tabella 1). Incubare la membrana su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 1 h.
    NOTA: Questo è un punto di pausa: la membrana può essere rimossa dopo 1 ora o conservata in soluzione bloccante a 4 °C durante la notte.
  13. Dopo 1 ora o incubazione notturna, rimuovere la soluzione bloccante. Aggiungere 10 mL della soluzione anticorpale diluita (anticorpo anti-caspasi-1, anticorpo anti-caspasi-11, anticorpo combinato anti-caspasi-3 e anti-scissione caspasi-3, anticorpo combinato anti-caspasi-7 e anti-scissione caspasi-7, anticorpo combinato anti-caspasi-8 e anti-scissione caspasi-8 o anti-caspasi-9) (Tabella 1). Mettere su uno shaker a dondolo a 50 rpm a 70 rpm per incubare a temperatura ambiente per 2 h o a 4 °C durante la notte (16 h).
  14. Raccogliere la soluzione anticorpale (riutilizzarla fino a 3x o eliminarla) e lavare aggiungendo 15 ml di TBST (Tabella 1) alla membrana su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 10 min. Eliminare il TBST.
  15. Ripetere il lavaggio con 15 ml di TBST dopo il passaggio 14 per un totale di 3 volte.
  16. Aggiungere 10 mL della soluzione anticorpale secondaria diluita coniugata HRP (anti-coniglio per macchie colorate con anticorpi primari contro caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8 o caspasi-9; anti-topo per macchie colorate con anticorpo primario contro caspasi-1; anti-ratto per macchie colorate con anticorpo primario contro caspasi-11) (Tabella 1). Incubare su uno shaker a dondolo a 50 giri / min a 70 giri / min a temperatura ambiente per 1 ora.
  17. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare aggiungendo 15 ml di TBST alla membrana su uno shaker a dondolo a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 10 minuti. Eliminare il TBST.
  18. Ripetere il lavaggio con 15 ml di TBST dopo il passaggio 17 per un totale di 3 volte.
  19. Aggiungere 10 ml del substrato HRP ad alta sensibilità alla membrana. Lasciare riposare a temperatura ambiente al buio per 1 minuto.
  20. Rimuovere la membrana dal substrato. Procedere direttamente all'imaging, utilizzando un imager a chemiluminescenza con l'accessorio vassoio trans bianco inserito nella posizione inferiore. Esporre la membrana utilizzando la modalità di esposizione automatica (generalmente ~ 1-2 minuti di tempo di esposizione).
  21. Utilizzando la membrana dal blotting caspasi-9 o caspasi-11 (cioè una membrana con campioni di lisato RIPA), aggiungere 10 ml di tampone di stripping e incubare su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti.
  22. Eliminare il tampone di strippaggio e lavare aggiungendo 15 ml di TBST alla membrana su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 10 minuti. Eliminare il TBST.
  23. Ripetere il lavaggio con 15 ml di TBST dopo il passaggio 22 per un totale di 3 volte.
  24. Eseguire il blocco della membrana aggiungendo 15 ml di una soluzione di latte scremato al 5% (wt/vol). Incubare la membrana su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 1 h.
    NOTA: Questo è un punto di pausa: la membrana può essere rimossa dopo 1 ora o conservata in soluzione bloccante a 4 °C durante la notte.
  25. Dopo 1 ora o incubazione notturna, rimuovere la soluzione bloccante. Aggiungere 10 ml della soluzione anticorpale diluita anti-β-actina (coniugata HRP). Posizionare su uno shaker a dondolo a 50 giri / min a 70 giri / min per incubare a temperatura ambiente per 1,5 ore.
  26. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare aggiungendo 15 ml di TBST alla membrana su uno shaker oscillante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente per 10 min. Eliminare il TBST.
  27. Ripetere il lavaggio con 15 ml di TBST seguendo il passaggio 26 per un totale di 3 volte.
  28. Aggiungere 10 ml del substrato HRP a sensibilità standard alla membrana. Lasciare riposare a temperatura ambiente al buio per 1 minuto.
  29. Procedere direttamente all'imaging, utilizzando un imager a chemiluminescenza con l'accessorio vassoio trans bianco inserito nella posizione inferiore. Esporre la membrana utilizzando la modalità di esposizione automatica (generalmente <1 minuto di tempo di esposizione).

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Risultati

La panoptosi è stata osservata in risposta a numerose infezioni batteriche, virali e fungine e ad altri stimoli infiammatori, nonché nelle cellule tumorali 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 ...

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Discussione

Il monitoraggio della scissione e dell'attivazione delle caspasi fornisce uno dei quadri più completi dell'attivazione immunitaria innata della PCD come parte della risposta immunitaria innata. Il protocollo qui descritto dimostra una strategia per monitorare l'attivazione delle caspasi in risposta alle infezioni da IAV, HSV1 e F. novicida e al trigger sterile LPS + ATP, ma numerosi altri stimoli possono indurre PCD e potrebbero essere utilizzati in questo metodo, come è stato dimostrato in diverse pubblicazioni...

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Dichiarazioni

T.-D.K. è consulente per Pfizer.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Kanneganti per i loro commenti e suggerimenti, e ringraziamo J. Gullett, PhD, per il supporto all'editing scientifico. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dalle sovvenzioni AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 e CA253095 (a T.-D.K.) e dall'American Lebanese Syrian Associated Charities (a T.-D.K.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 μ m filterMilliporeSCHVU05RE
siringa da 10 mLBD Biosciences309604
gel di poliacrilammide al 12% con 10 pozzetti Piastra Bio-Rad4561043
a 12 pozzetti Corning07-200-82
Ago da 18 G BD Biosciences305195
ago da 25 G BD Biosciences305122
provetta da 50 mLFisher Scientific50-809-218
70 μ filtro cellulare m Piastre431751
150 mm
182 cm2Genesee Scientific25-211
Accessorio vassoio trans biancoCytiva29-0834-18
Anti– anticorpo della caspasi-1AdipoGenAG-20B-0042-C100
Anti– anticorpo caspasi-11Novus BiologicalsNB120-10454
Anti– tecnologia di segnalazione cellulare anticorpo caspasi-39662
Anti– tecnologia di segnalazione cellulare anticorpo caspasi-79492
Anti– tecnologia di segnalazione cellulare dell'anticorpo della caspasi-84927
Anti– tecnologia di segnalazione cellulare dell'anticorpo della caspasi-99504
anti– anticorpo caspasi-3 scissato Tecnologia di segnalazione cellulare9661
Anti– anticorpo caspasi-7 scissionato Tecnologia di segnalazione cellulare9491
Anti– anticorpo caspasi-8 scissato Tecnologia di segnalazione cellulare8592
Anticorpo secondario coniugato HRP anti-topo Jackson ImmunoResearch Laboratories315-035-047
Anticorpo secondario coniugato HRP anti-coniglio Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-047
Anticorpo secondario coniugato HRP anti-ratto Jackson ImmunoResearch Laboratories112-035-003
Anti– β-Actina anticorpo (C4) HRPSanta Cruzsc-47778 HRP
ATPInvivoGentlrl-atpl
BBL Tripticasi Brodo di soiaBD Biosciences211768
Bagno di perlineChemglass Life SciencesCLS-4598-009
Biofotometro D30Eppendorf6133000010
BMESigmaM6250
Blu di bromofenoloRaschietti cellulari SigmaBO126
CellTreat Scientific Products229315
Imager a chemiluminescenza (Amersham 600) Cytiva29083461
CO2  cameraVetEquip901703
CuvetteFisher Scientific14-955-129
Forbici da dissezioneThermo Fisher Scientific221S
DMEMThermo Fisher Scientific11995-073
DTTSigma43815
Apparecchio per elettroforesi Bio-Rad1658004
EtanoloPharmco111000200
Siero fetale bovino BiowestS1620
Carta da filtroBio-Rad1703965
PinzeFisher Scientific22-327379
Francisella novicida (ceppo U112)BEI ResourcesNR-13
Gel releaser Bio-Rad1653320
GentamicinaGibco15750060
GliceroloSigmaG7893
GlicinaSigmaG8898
HClSigmaH9892
Blocco termicoFisher Scientific23-043-160
Herpes simplex virus 1 (ceppo HF)ATCCVR-260
DMEM ad alto contenuto di glucosioSigmaD6171
Umano anti– anticorpo caspasi-1R& D SistemiMAB6215
Umano anti– anticorpo caspasi-8EnzoALX-804-242
Incubatrice umidificata Thermo Fisher Scientific51026282
Software di analisi delle immaginiImageJv1.53a
IMDM ThermoFisher Scientific12440-053
Virus dell'influenza A (A/Porto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) costruito secondo Hoffmann et al.
Cellule L929 LineaATCCCCL-1per la creazione di terreni condizionati con L929
L-cisteina SubstratoBP376-100
Luminata Forte Substrato HRP occidentaleMilliporeWBLUF0500substrato HRP a sensibilità standard
Celle MDCKLinea cellulare ATCCCCL-34per la determinazione del titolo virale IAV
Microcentrifuga
Aminoacidi non essenzialiGibco11140050
Latte in polvere scremato in polvereKroger
NP-40 soluzione Sigma492016
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Penicillina e streptomicina SigmaP4333
Piastra di PetriFisher Scientific07-202-011
PhosSTOPRochePHOSS-RO
Fonte di alimentazione Bio-Rad164-5052
Compresse inibitore della proteasiSigmaS8820
membrana PVDF MilliporeIPVH00010
Agitatore a dondoloLabnetS2035-E
SDSSigmaL3771
Cloruro di sodio SigmaS9888
Desossicolato di sodioSigma30970
Idrossido di sodioSigma72068
Piruvato di sodioGibco11360-070
Piastra di Petri quadrataFisher ScientificFB0875711A
Tampone di strippaggioThermo Fisher Scientific21059
Substrato Super Signal Femto HRPThermo Fisher Scientific34580substrato HRP ad alta sensibilità
Centrifuga da tavoloThermo Fisher Scientific75004524
Sistema semi-secco Trans-Blot Bio-Rad170-3940
TrisSigmaTRIS-RO
Tween 20 SigmaP1379
Lipopolisaccaride ultrapuro (LPS) da E. coli 0111:B4InvivoGentlrl-3pelps
Vero cellsATCCCCL-81cell line per la determinazione del titolo virale HSV1
per coltura tissutale Corning Pallone per coltura tissutale Corning 430597 cellulare HRP Thermo Fisher Scientific Methanol Sigma 322415 Sigma Thermo Scientific 75002401

Riferimenti

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