Articolo metodologico

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

DOI:

10.3791/64321

⸱

7 aprile 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un nuovo imager di durata della fotoluminescenza progettato per mappare la concentrazione di ossigeno molecolare (O 2) in diversi campioni fosforescenti che vanno dai rivestimenti sensibili allo stato solido, O 2 a campioni di tessuto animale vivo colorati con sonde solubili sensibili all'O2. In particolare, è stata utilizzata la sonda nel vicino infrarosso basata su nanoparticelle NanO2-IR, che è eccitabile con un diodo a emissione luminosa (LED) da 625 nm ed emette a 760 nm. Il sistema di imaging si basa sulla telecamera Timepix3 (Tpx3Cam) e sull'adattatore opto-meccanico, che ospita anche un intensificatore di immagine. La microscopia a vita di imaging con fosforescenza (PLIM) O2 è comunemente richiesta per vari studi, ma le piattaforme attuali hanno limitazioni nella loro accuratezza, flessibilità generale e usabilità.

Il sistema qui presentato è un imager veloce e altamente sensibile, costruito su un sensore ottico integrato e un modulo chip di lettura, Tpx3Cam. È dimostrato che produce segnali di fosforescenza ad alta intensità e valori stabili nel corso della vita da campioni di tessuto intestinale macchiati in superficie o frammenti di intestino crasso colorati per via intraluminale e consente la mappatura dettagliata dei livelli di O2 del tessuto in circa 20 s o meno. Vengono inoltre presentati esperimenti iniziali sull'imaging dell'ipossia nei tumori innestati in animali incoscienti. Descriviamo anche come l'imager può essere riconfigurato per l'uso con materiali sensibili all'O2 basati su coloranti Pt-porfirina utilizzando un LED da 390 nm per l'eccitazione e un filtro passa banda 650 nm per l'emissione. Nel complesso, l'imager PLIM è risultato in grado di produrre misurazioni quantitative accurate dei valori di vita per le sonde utilizzate e le rispettive mappe bidimensionali della concentrazione di O2 . È anche utile per l'imaging metabolico di modelli di tessuto ex vivo e animali vivi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O 2 è uno dei parametri ambientali chiave per i sistemi viventi e la conoscenza della distribuzione di O 2 e della sua dinamica è importante per molti studi biologici 1,2,3. La valutazione dell'ossigenazione tissutale mediante sonde fosforescenti 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 sta guadagnando popolarità nella ricerca biologica e medica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Questo perché il PLIM, a differenza delle misurazioni dell'intensità di fluorescenza o fosforescenza, non è influenzato da fattori esterni come la concentrazione della sonda, il fotosbiancamento, l'intensità di eccitazione, l'allineamento ottico, la diffusione e l'autofluorescenza.

Tuttavia, le attuali piattaforme PLIM O2 sono limitate dalla loro sensibilità, velocità di acquisizione delle immagini, precisione e usabilità generale. Il conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC), combinato con una procedura di scansione raster, viene spesso utilizzato nei dispositivi PLIM e FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)20,21,22. Tuttavia, poiché PLIM richiede un lungo tempo di permanenza dei pixel (nell'intervallo dei millisecondi), il tempo di acquisizione dell'immagine è molto più lungo di quello richiesto per le applicazioni FLIM20,22,23. Altre tecniche, come le telecamere CCD / CMOS gated, mancano di sensibilità a singolo fotone e hanno frame rate bassi20,24,25,26. Inoltre, i sistemi PLIM esistenti sono per lo più utilizzati nel formato microscopico, mentre i sistemi macroscopici sono meno comuni27.

Il sequencer macro imager28 basato su TCSPC è stato configurato per superare molte di queste limitazioni. Il design dell'imager è stato notevolmente facilitato dall'uso di un nuovo adattatore opto-meccanico, Cricket, che ha quanto segue: i) due adattatori C-mount, che forniscono un facile accoppiamento del modulo fotocamera sul lato posteriore e dell'obiettivo sul lato anteriore; ii) un alloggiamento interno per un intensificatore di immagine e una presa di corrente per quest'ultimo sul lato esterno del Cricket; iii) uno spazio interno dietro l'adattatore frontale con montaggio a C in cui un filtro di emissione standard da 25 mm può essere alloggiato davanti all'intensificatore; e iv) un'ottica di collimazione della luce incorporata con regolatori ad anello, che consentono l'allineamento / messa a fuoco ottica tra l'obiettivo e la fotocamera per produrre immagini nitide sul chip della fotocamera.

Nell'imager assemblato, il modulo della fotocamera è accoppiato al lato posteriore dell'adattatore Cricket, che ospita anche un intensificatore di immagine costituito da un fotocatodo seguito da una piastra a microcanali (MCP), un amplificatore e uno scintillatore veloce, il fosforo P47. Un filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm è montato all'interno del Cricket e un obiettivo, NMV-50M11'', è collegato all'adattatore C-mount frontale. Infine, l'obiettivo e la fotocamera sono allineati otticamente con i regolatori ad anello.

Il ruolo dell'intensificatore è quello di rilevare i fotoni in arrivo e convertirli in rapide esplosioni di luce sul chip della fotocamera, che vengono registrati e utilizzati per generare decadimenti di emissione e immagini a vita. Il modulo telecamera comprende un avanzato array di sensori ottici basati su TCSPC (256 pixel x 256 pixel) e un chip di lettura di nuova generazione 29,30,31,32,33, che consentono la registrazione simultanea del tempo di arrivo (TOA) e del tempo oltre la soglia (TOT) dei burst di fotoni su ciascun pixel del chip di imaging con una risoluzione temporale di 1,6 ns e una velocità di lettura di 80 Mpixel/s.

In questa configurazione, la telecamera con l'intensificatore ha una sensibilità a fotone singolo. È basato sui dati e si basa sul sistema di lettura del rilevatore di pixel veloci (SPIDR)34. La risoluzione spaziale dell'imager era precedentemente caratterizzata da sensori O2 fosforescenti planari e una maschera a piastre di risoluzione. La funzione di risposta dello strumento (IRF) è stata misurata mediante l'imaging di un sensore fluorescente planare con le stesse impostazioni utilizzate per tutte le altre misurazioni. La durata del colorante di circa 2,6 ns è stata abbastanza breve da poter essere utilizzata per la misurazione IRF in modalità PLIM. L'imager può visualizzare oggetti di dimensioni fino a 18 mm x 18 mm con risoluzioni spaziali e temporali di 39,4 μm e 30,6 ns (larghezza completa a metà massima), rispettivamente28.

I seguenti protocolli descrivono l'assemblaggio del macro imager e il suo successivo utilizzo per mappare la concentrazione di O 2 in campioni biologici colorati con la sonda O2 nel vicino infrarosso precedentemente caratterizzata, NanO2-IR35. La sonda è una sonda O2 luminosa, fotostabile, permeabile alle cellule basata sul colorante benzoporfirina di platino (II) (PtBP). È eccitabile a 625 nm, emette a 760 nm e fornisce una robusta risposta ottica a O 2 nell'intervallo fisiologico (0% -21% o 0-210 μM di O2). È stato inoltre dimostrato che l'imager caratterizza diversi materiali del sensore basati su coloranti Pt(II)-porfirina. Nel complesso, l'imager è compatto e flessibile, simile a una comune fotocamera fotografica. Nella configurazione corrente, l'imager è adatto per diverse applicazioni PLIM a campo ampio. La sostituzione del LED con una sorgente laser veloce migliorerà ulteriormente le prestazioni dell'imager e potrebbe potenzialmente consentire applicazioni FLIM in nanosecondi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure con gli animali sono state eseguite sotto autorizzazioni rilasciate dalla Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) in conformità con la Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico per la sperimentazione animale dell'University College Cork.

1. Preparazione del campione

  1. Colorazione con sonda di campioni di tessuto vivo ex vivo
    1. Per le applicazioni ex vivo , utilizzare campioni di tessuto appena isolati da topi Balb/c femmina di 4 settimane.
    2. Il giorno dell'esperimento, eutanasia di un topo per decapitazione e sezionare rapidamente frammenti del colon (intestino crasso), di circa 10 mm di dimensione. Lavarli immediatamente con tampone PBS, metterli in mezzo DMEM integrato con tampone Hepes 10 mM (pH 7,2) e incubare a 37 °C36.
    3. Per la colorazione superficiale del lato sieroso dell'intestino, trasferire i campioni di tessuto vivo in un mini-piatto, applicare 2 ml di DMEM completo contenente 1 mg/mL di sonda NanO2-IR per coprire i campioni di tessuto e incubare per 30 minuti a 37 °C.
      NOTA: Le cellule nel tessuto post-mortem rimangono vive per molte ore in coltura. NaNO2-IR mostra una citotossicità minore, quindi tutti gli esperimenti sono stati completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
    4. Per la colorazione intraluminale ex vivo dei tessuti profondi, trasferire i pezzi dell'intestino in una capsula di Petri asciutta e rimuovere qualsiasi DMEM in eccesso con carta da filtro.
    5. Iniettare 1 μL di DMEM contenente 1 mg/mL di NanO2-IR 35 nel lume con una siringa di Hamilton e incubare i campioni per15 minuti o fino a 4 ore.
      NOTA: NaNO2-IR mostra effetti citotossici minori a lungo termine; Pertanto, tutti gli esperimenti dovrebbero essere completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
  2. Preparazione di tessuto tumorale colorato in animali vivi
    1. Per applicazioni in vivo, pre-colorare le cellule CT26 per 18 ore in mezzo privo di siero contenente sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/ml.
    2. Prenda un topo, rada l'area di iniezione nel fianco destro e inietti con una siringa 200 μL di una miscela di 1 × 10 5 cellule non colorate e 1 × 105 cellule pre-colorate con NanO2-IR .
    3. Consentire ai tumori di crescere nei topi, monitorando periodicamente le dimensioni del tumore con una pinza e il peso dell'animale periodicamente37. Gli animali con tumori innestati diventano pronti per l'imaging il settimo giorno di crescita del tumore.
      NOTA: Il volume del tumore è stato calcolato utilizzando l'equazione (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      dove L è il diametro del tumore e W èil diametro perpendicolare al diametro L.
    4. Sacrificare gli animali per dislocazione cervicale poco prima dell'imaging.

2. Configurazione dell'imaging PLIM

  1. Prendi l'adattatore Cricket e rimuovi l'adattatore C-mount sul retro per accedere all'alloggiamento dell'intensificatore all'interno. Inserire l'intensificatore d'immagine MCP-125 in questo scomparto e riposizionare l'adattatore C-mount.
  2. Rimuovere l'adattatore C-mount frontale del Cricket, inserire il filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm e ripararlo rimettendo il C-mount.
  3. Collegare il modulo fotocamera Tpx3Cam al lato posteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount
  4. Collegare l'obiettivo al lato anteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount.
  5. Montare l'intero gruppo telecamera sulla parte superiore della scatola nera ottica, rivolta verso il basso verso il basso verso il palco su cui verranno ripresi i campioni (Figura 1).
  6. Montare il LED super-luminoso da 624 nm su un palo collegato a una breadboard all'interno della scatola nera.
  7. Collegare il LED a un alimentatore e a un generatore di impulsi. Accendere il LED e metterlo a fuoco per garantire un'eccitazione efficace e uniforme dei campioni visualizzati.
  8. Collegare la telecamera a un altro generatore di impulsi e sincronizzare gli impulsi inviati alla fotocamera e al LED38.
  9. Utilizzando il cavo speciale e la presa sull'unità Cricket, collegare l'intensificatore a un alimentatore standard e impostare il guadagno su 2,7 V.
  10. Utilizzando le funzionalità di messa a fuoco dell'obiettivo e dell'adattatore Cricket, mettere a fuoco l'ottica della fotocamera sul palco campione per generare immagini nitide dei campioni con buon contrasto e luminosità.
  11. Per l'utilizzo dell'imager con coloranti Pt-porfirina, sostituire il LED da 625 nm con un LED da 390 nm per l'eccitazione e sostituire il filtro da 760 nm ± 50 nm con un filtro da 650 nm ± 50 nm nel modulo Cricket.

3. Acquisizione di immagini

  1. Posizionare il campione davanti all'obiettivo della fotocamera.
    NOTA: utilizzare uno stadio regolabile x-y-z come supporto del campione per regolare la posizione del campione per una buona messa a fuoco.
  2. Spegni tutte le luci nella stanza.
  3. Accendere il software Sophy per la messa a punto dei parametri operativi, come la messa a fuoco e l'allineamento del campione.
    NOTA: il software Sophy viene fornito insieme alla fotocamera per impostare i parametri di imaging e registrare i dati. Assicurarsi che il software sia collegato alla fotocamera controllando il codice della fotocamera. Tuttavia, abbiamo utilizzato un programma diverso per l'acquisizione dei dati.
  4. In Moduli, selezionate fotogrammi infiniti e impostate la modalità operativa pixel su soglia di tempo.
  5. In Moduli, vai a Anteprima e seleziona Modulo attivo. Verrà visualizzata la finestra Medpix/Timpix Frames .
  6. In questa finestra, modificare la scala dei colori e ruotare l'immagine con l'orientamento desiderato.
  7. Accendere l'intensificatore e avviare la registrazione.
    NOTA: Utilizzare la schermata di registrazione del software Sophy per confermare visivamente l'allineamento e la messa a fuoco del campione e per ottimizzare i parametri di eccitazione LED per la registrazione.
  8. Interrompere la registrazione e chiudere il software Sophy.
  9. Vai al terminale e utilizza il software progettato su misura per acquisire i dati grezzi in formato binario e post-elaborarli (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Nel terminale, eseguire i seguenti comandi per registrare i dati:
      Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nome del file} - t {tempo di acquisizione}
      NOTA: dopo aver digitato "ls", controllare l'elenco dei file nella directory corrente; confermare che Tpx3daq è visto.
    2. Attendere che tutti i fotogrammi vengano registrati.
    3. Per elaborare i dati, eseguire i seguenti comandi nel terminale:
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      radice
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Attendere l'apertura di una finestra RRGui . Selezionare tutte le variabili a sinistra e Tutti i dati, File singolo e Centroid a destra.
    5. Selezionare il file da elaborare ed eseguire il riduttore di dati.
      NOTA: tutti i file elaborati verranno visualizzati nella stessa cartella del file raw.

4. Analisi dei dati

  1. Analizza i dati post-elaborati con un programma dedicato scritto in linguaggio C che scriverà i dati in un file immagine .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Aprire i file di immagine .ics utilizzando il software Time Resolved Imaging disponibile gratuitamente (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare due funzioni esponenziali per adattarsi ai decadimenti della fosforescenza.
  3. Aprire i file di immagine .ics dotati con il software di analisi delle immagini disponibile (vedere Tabella dei materiali).
  4. Utilizzando le tabelle di ricerca, generare immagini di durata della fosforescenza e codificarle in scala pseudocolore (ad esempio, colore blu per brevi vite e rosso per lunghe vite). Utilizzare la funzione Misura per calcolare i valori medi di durata per l'intera immagine o specifiche regioni di interesse (ROI).
  5. Convertire i valori di vita nella concentrazione di ossigeno utilizzando l'equazione ottenuta dal montaggio della calibrazione O2 della sonda36.
    NOTA: L'equazione (2) è stata utilizzata per questo lavoro:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per le applicazioni di imaging ex vivo , frammenti di tessuti intestinali sono stati colorati dall'applicazione topica della sonda NanO2-IR sul lato sieroso del tessuto. Per una colorazione più profonda, 1 μL della sonda è stato iniettato nel lume. In quest'ultimo caso, la parete intestinale spessa 0,2-0,25 mm ha schermato la sonda dalla fotocamera. I due processi di colorazione sono illustrati nella Figura 2A.

L'intensità risultante e le immagini PLIM so...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I protocolli di cui sopra forniscono una descrizione dettagliata dell'assemblaggio del nuovo imager e del suo funzionamento in modalità FLIM/PLIM al microsecondo. La telecamera Tpx3Cam di nuova generazione basata su TCSPC, accoppiata mediante l'adattatore optomeccanico Cricket con l'intensificatore di immagine, il filtro di emissione e il macroobiettivo, produce un modulo ottico stabile, compatto e flessibile facile da usare. L'imager ha dimostrato di funzionare bene con una serie di diversi campioni e compiti analitici,...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sostegno finanziario per questo lavoro da parte della Science Foundation Ireland, sovvenzioni SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 e 18 / SP / 3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) è riconosciuto con gratitudine.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
627 nmLED Parts ExpressPuò essere sostituito con LED diversi in base alla lunghezza d'onda di eccitazione del sensore. LED da 390 nm usato per coloranti Pt-porfirina.
Filtro di emissione 760 & 50 nmEdmund Optics84-788Può essere sostituito con un filtro diverso in base alla lunghezza d'onda di emissione del sensore. Usato 650 ± Filtro passa-banda da 50 nm per coloranti Pt-porfirina.
Balb/c topiEnvigo, Regno UnitoBalb/c
Scatola neraThorlabsXE25C9/M
Cricket AdapterPhotonisCricket-2
CT26 cellule ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697possibile utilizzare anche altri supporti
Software ImageJSoftware gratuito per l'analisi delle immagini. Può essere scaricato da: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Intensificatore d'immagine MCP-125 con schermo al fosforo P47PhotonisPP0360EF
Mini paraboleSarstedt83.3900.30035 mm di diametro 
Pellicola in plastica Mylar, 75 micronRS Irlanda785-0795Altri substrati plastici possono essere utilizzati anche
NanO2-IRfatto in casan/aLa sonda può essere sintetizzata secondo il metodo pubblicato 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. Imaging in vivo dell'attività del metabolismo cerebrale utilizzando una sonda fosforescente sensibile all'ossigeno. J Metodi Neurosci. 15 giugno 2013; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 aprile. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' o fornito dal nostro laboratorio.
NMV-50M11" Obiettivo da 50 mmNavitarÈ possibile utilizzare altri obiettivi compatibili con gli adattatori C-mount
Breadboard otticoThorlabsMB1836
Piastre di PetriSarstedt82.1472.001Diametro 92 mm
Alimentatore Tenma72-10495
Generatore di impulsiTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zFornito da ASI insieme al software Tpx3Cam
Tpx3CamScientific InstrumentsTPXCAM
Tri2University of Oxfordn/aSoftware Free Time Resolved Imaging, può essere scaricato da: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3
È :

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150(2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800(2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003(2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602(2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707(2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591(2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013(2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017(2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104(2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028(2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006(2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Imaging a tempo di vita della fluorescenzaImaging a tempo di vita della fosforescenzaMappatura dell ossigenoCamera Timepix3Modalit TCSPCImaging di tessuti animaliSonda per l ossigeno a nanoparticelleIntensificatore di immagineImaging dell ipossiaColorante a porfirina di platino

Articoli correlati