Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.
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Articolo metodologico
Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo presenta un nuovo imager di durata della fotoluminescenza progettato per mappare la concentrazione di ossigeno molecolare (O 2) in diversi campioni fosforescenti che vanno dai rivestimenti sensibili allo stato solido, O 2 a campioni di tessuto animale vivo colorati con sonde solubili sensibili all'O2. In particolare, è stata utilizzata la sonda nel vicino infrarosso basata su nanoparticelle NanO2-IR, che è eccitabile con un diodo a emissione luminosa (LED) da 625 nm ed emette a 760 nm. Il sistema di imaging si basa sulla telecamera Timepix3 (Tpx3Cam) e sull'adattatore opto-meccanico, che ospita anche un intensificatore di immagine. La microscopia a vita di imaging con fosforescenza (PLIM) O2 è comunemente richiesta per vari studi, ma le piattaforme attuali hanno limitazioni nella loro accuratezza, flessibilità generale e usabilità.
Il sistema qui presentato è un imager veloce e altamente sensibile, costruito su un sensore ottico integrato e un modulo chip di lettura, Tpx3Cam. È dimostrato che produce segnali di fosforescenza ad alta intensità e valori stabili nel corso della vita da campioni di tessuto intestinale macchiati in superficie o frammenti di intestino crasso colorati per via intraluminale e consente la mappatura dettagliata dei livelli di O2 del tessuto in circa 20 s o meno. Vengono inoltre presentati esperimenti iniziali sull'imaging dell'ipossia nei tumori innestati in animali incoscienti. Descriviamo anche come l'imager può essere riconfigurato per l'uso con materiali sensibili all'O2 basati su coloranti Pt-porfirina utilizzando un LED da 390 nm per l'eccitazione e un filtro passa banda 650 nm per l'emissione. Nel complesso, l'imager PLIM è risultato in grado di produrre misurazioni quantitative accurate dei valori di vita per le sonde utilizzate e le rispettive mappe bidimensionali della concentrazione di O2 . È anche utile per l'imaging metabolico di modelli di tessuto ex vivo e animali vivi.
Introduzione
O 2 è uno dei parametri ambientali chiave per i sistemi viventi e la conoscenza della distribuzione di O 2 e della sua dinamica è importante per molti studi biologici 1,2,3. La valutazione dell'ossigenazione tissutale mediante sonde fosforescenti 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 sta guadagnando popolarità nella ricerca biologica e medica 3,9,14,15,16
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Protocollo
Tutte le procedure con gli animali sono state eseguite sotto autorizzazioni rilasciate dalla Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) in conformità con la Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico per la sperimentazione animale dell'University College Cork.
1. Preparazione del campione
- Colorazione con sonda di campioni di tessuto vivo ex vivo
- Per le applicazioni ex vivo , utilizzare campioni di tessuto appena isolati da topi Balb/c femmina di 4 settimane.
- Il giorno dell'esperimento, eutanasia di un topo pe....
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Risultati
Per le applicazioni di imaging ex vivo , frammenti di tessuti intestinali sono stati colorati dall'applicazione topica della sonda NanO2-IR sul lato sieroso del tessuto. Per una colorazione più profonda, 1 μL della sonda è stato iniettato nel lume. In quest'ultimo caso, la parete intestinale spessa 0,2-0,25 mm ha schermato la sonda dalla fotocamera. I due processi di colorazione sono illustrati nella Figura 2A.
L'intensità risultante e le immagini PLIM so.......
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Discussione
I protocolli di cui sopra forniscono una descrizione dettagliata dell'assemblaggio del nuovo imager e del suo funzionamento in modalità FLIM/PLIM al microsecondo. La telecamera Tpx3Cam di nuova generazione basata su TCSPC, accoppiata mediante l'adattatore optomeccanico Cricket con l'intensificatore di immagine, il filtro di emissione e il macroobiettivo, produce un modulo ottico stabile, compatto e flessibile facile da usare. L'imager ha dimostrato di funzionare bene con una serie di diversi campioni e compiti analitici,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario per questo lavoro da parte della Science Foundation Ireland, sovvenzioni SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 e 18 / SP / 3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) è riconosciuto con gratitudine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 627 nm | LED Parts Express | Può essere sostituito con LED diversi in base alla lunghezza d'onda di eccitazione del sensore. LED da 390 nm usato per coloranti Pt-porfirina. | |
| Filtro di emissione 760 & 50 nm | Edmund Optics | 84-788 | Può essere sostituito con un filtro diverso in base alla lunghezza d'onda di emissione del sensore. Usato 650 ± Filtro passa-banda da 50 nm per coloranti Pt-porfirina. |
| Balb/c topi | Envigo, Regno Unito | Balb/c | |
| Scatola nera | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cellule | ATCC | CT26. WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | possibile utilizzare anche altri supporti |
| Software ImageJ | Software gratuito per l'analisi delle immagini. Può essere scaricato da: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | ||
| Intensificatore d'immagine MCP-125 con schermo al fosforo P47 | Photonis | PP0360EF | |
| Mini parabole | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm di diametro |
| Pellicola in plastica Mylar, 75 micron | RS Irlanda | 785-0795 | Altri substrati plastici possono essere utilizzati anche |
| NanO2-IR | fatto in casa | n/a | La sonda può essere sintetizzata secondo il metodo pubblicato 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. Imaging in vivo dell'attività del metabolismo cerebrale utilizzando una sonda fosforescente sensibile all'ossigeno. J Metodi Neurosci. 15 giugno 2013; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 aprile. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' o fornito dal nostro laboratorio. |
| NMV-50M11" Obiettivo da 50 mm | Navitar | È possibile utilizzare altri obiettivi compatibili con gli adattatori C-mount | |
| Breadboard ottico | Thorlabs | MB1836 | |
| Piastre di Petri | Sarstedt | 82.1472.001 | Diametro 92 mm |
| Alimentatore Tenma | 72-10495 | ||
| Generatore di impulsi | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Fornito da ASI insieme al software Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 | University of Oxford | n/a | Software Free Time Resolved Imaging, può essere scaricato da: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
Riferimenti
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.
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Ristampe e permessi
