Articolo metodologico

Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

DOI:

10.3791/64342

⸱

6 ottobre 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo dimostra l'uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli aptameri sono molecole di riconoscimento del bersaglio che si legano con alta affinità e specificità. Queste caratteristiche possono essere sfruttate per controllare altre molecole con capacità di generazione del segnale. Per il sistema qui descritto, il riconoscimento del bersaglio attraverso un dominio aptamerico, Stem II di un ribozima martello modificato, attiva il ribozima auto-scisso stabilizzando il costrutto inizialmente non strutturato. L'RNA cis-cscissione agisce alla giunzione di Stem III e Stem I, creando due prodotti di scissione. Il prodotto di scissione più lungo innesca una reazione di amplificazione esponenziale isotermica (EXPAR) dei due G-quadruplex cataliticamente attivi simili. I prodotti di amplificazione risultanti catalizzano la riduzione della perossidasi, che è accoppiata alla riduzione di un substrato colorimetrico con un output che l'occhio nudo può rilevare. Il sistema in 3 parti descritto nel presente studio migliora le modalità di rilevamento come i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) producendo un segnale visivamente rilevabile per indicare la presenza di una minima parte di 0,5 μM di teofillina in appena 15 minuti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli aptameri sono tipicamente DNA o RNA a singolo filamento selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati1. Oltre alla capacità di legame, gli aptameri possono essere collegati e controllare motivi con funzioni di uscita del segnale2,3, amplificando detto segnale e migliorando la sensibilità del sistema. Il sistema G-quadruplex isothermal exponential amplification reaction (GQ-EXPAR) è un sistema in tre parti (Figura 1) che sviluppa un segnale visivo quando componenti successivi vengono aggiunti a un singolo recipiente di reazione per produrre un output visivo4. Questo sistema consente di rilevare un bersaglio specifico, qui teofillina, in un dato campione entro 15 minuti utilizzando un flusso di lavoro semplificato per consentire un rilevamento rapido e specifico di un target di interesse. Questo metodo deve essere preso in considerazione per i campioni in cui la quantificazione specifica della concentrazione target è una preoccupazione inferiore rispetto all'elevata specificità della risposta in un breve lasso di tempo.

Un ribointerruttore allosterico, una molecola di RNA a commutazione di struttura (ribozima) che subisce l'auto-scissione, produce il segnale iniziale. Questo costrutto è basato sul ribozima martello, con un dominio aptamerico introdotto nello Stem II come regolatore dell'attività di scissione. La sua funzione di autoscissione si attiva quando il suo dominio aptamerico è stabilizzato legandosi al suo bersaglio5. In caso contrario, l'opzione è inattiva nello stato nativo.

La successiva reazione di amplificazione esponenziale (EXPAR) utilizza il rilascio del filamento di RNA auto-scisso dal primo stadio per innescare una reazione di amplificazione isoterma6. Il prodotto di amplificazione di EXPAR ha attività perossidasi7, che funge da base per l'ultimo stadio del sistema. Quando alcuni substrati vengono ossidati in concomitanza con la rottura del perossido, producono un'uscita fluorescente che può essere misurata su vari strumenti. Altri substrati comuni possono essere sostituiti per produrre un prodotto colorato per il rilevamento visivo. EXPAR e l'attività perossidasica dei suoi prodotti di amplificazione agiscono come un potenziatore del segnale a 2 stadi, aumentando la sensibilità a livelli maggiori rispetto alle strategie convenzionali 7,8.

La rilevazione della teofillina rispetto alla caffeina è usata come esempio della specificità di questa piattaforma di rilevazione, in quanto differiscono solo per un singolo gruppo metilico (Figura 2). Questa dimostrazione del sistema produce un output colorimetrico per il rilevamento visivo di almeno 500 nM di teofillina.

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Protocollo

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Vedere la tabella supplementare 1 (tabella di impostazione della reazione) per la preparazione del tubo, compresi i volumi e le concentrazioni specifici dei componenti della reazione. Il protocollo qui illustrato utilizza un kit di piattaforma di rilevamento preassemblato come descritto nella tabella dei materiali. Tutti i componenti devono essere tenuti sul ghiaccio se non diversamente indicato.

1. Preparazione del ribozima

NOTA: Il componente di rilevamento primario è un ribozima allosterico (regolato dall'aptamero) che riconosce la teofillina (vedere Tabella supplementare 2).

  1. Raccogliere 5 U di polinucleotide chinasi T4 (0,5 μL, vedere Tabella dei materiali) in un tubo PCR, che verrà utilizzato per attivare i prodotti di scissione del ribozima.
    NOTA: questo componente viene aggiunto per primo in modo che l'utente possa vedere la corretta erogazione dell'enzima.
  2. Aggiungere 1 μL di tampone ribozima 5x prepreparato (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta (provetta PCR).
  3. Al fine di dimostrare visivamente la specificità, aggiungere 1,5 μL di 2 mM di teofillina (bersaglio) o 2 mM di caffeina (controllo) (cfr. tabella dei materiali) a ciascuna provetta come campioni di prova.
    NOTA: Per stabilire una curva standard, si consiglia di iniziare con un analita di 3,125 mM e testare diluizioni di cinque volte fino a 0,001 mM.
  4. Mescolare accuratamente ogni provetta pipettando 5-10 volte.
  5. Aggiungere 2 μL di 600 nM di RNA contenente un dominio aptamerico specifico per il bersaglio (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 240 nM in 5 μL di soluzione di prova, quindi miscelare rapidamente mediante pipettaggio e posizionare su un blocco freddo per ridurre al minimo il segnale di fondo.
    NOTA: è importante preparare inizialmente tutte le reazioni senza ribozima, poiché la reazione di auto-scissione inizierà immediatamente quando il ribozima è combinato con tampone ribozima e può produrre uno sfondo significativo.
  6. Una volta preparate tutte le provette di reazione, incubare ogni campione (5 μL) a temperatura ambiente (23 °C) per esattamente 3 minuti utilizzando un timer. Riportare immediatamente le provette nel ghiaccio (4 °C) dopo l'incubazione.

2. GQ-EXPAR

  1. Aggiungere 3,5 μL di miscela enzimatica nickasi-polimerasi (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta del campione e mescolare bene.
    NOTA: Le concentrazioni enzimatiche richieste dipendono dalle sequenze di riconoscimento, dai tipi di enzimi e dalle temperature di reazione, la cui combinazione è stata determinata empiricamente.
  2. Aggiungere 31,5 μL di miscela di reazione EXPAR contenente dima, nucleotidi e tampone di reazione (vedere la tabella dei materiali) a ciascuna provetta e pipetta da miscelare.
    NOTA: Le concentrazioni dei componenti sono ottimizzate in base agli enzimi e alle sequenze dei prodotti della polimerasi.
  3. Una volta preparati tutti i campioni, incubare ogni campione preparato (40 μL) a 55 °C per esattamente 5 minuti utilizzando un timer. Se possibile, incubare su un termociclatore, anche se non è necessario un coperchio riscaldato.
  4. Riportare immediatamente le provette di campione sul ghiaccio (4 °C) dopo la fase di incubazione.

3. Sviluppo del colore

  1. Aggiungere 2 μL di soluzione di emina (25 uM; vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta e mescolare bene.
  2. Aggiungere 58 μL della soluzione TMB disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta e miscelare bene.
  3. Incubare la reazione di sviluppo del colore (100 μL) a temperatura ambiente per almeno 3 minuti e fino a 30 minuti.
    NOTA: (Opzionale) Lo sviluppo del colore può essere interrotto aggiungendo 20 μL di acido solforico 2 M.
  4. Leggere i campioni qualitativamente ad occhio o quantificare i risultati utilizzando un lettore di piastre assorbenti a 450 nm se le reazioni di sviluppo del colore vengono interrotte usando acido solforico.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La piattaforma di rilevamento illustrata nella Figura 1 converte il riconoscimento del bersaglio aptamerico in differenze visivamente distinte tra i preparati del campione (bersaglio o non bersaglio, Figura 2) in un breve periodo di tempo. Un ribozima allosterico identificato da Soukup et al.5 è servito come punto di partenza per creare una sequenza meno rumorosa con risposta al bersaglio rispetto ai campioni di controllo e negativi. Il c...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo qui presentato sfrutta la transizione tra una struttura secondaria inizialmente disordinata in un ribozima allosterico e la stabilità aggiuntiva conferita attraverso il legame del bersaglio al dominio aptamerico per attivare il ribozima martello cis-scissione. La stabilità del ribozima è stata regolata per ridurre al minimo l'attività catalitica in assenza del bersaglio, consentendo al contempo il legame del bersaglio per ripristinare la struttura attiva. Inoltre, è necessario prestare attenzione a bilanciare i...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC produce e commercializza un kit dimostrativo GQ-EXPAR per coloro che desiderano un'esperienza diretta con un sistema di rilevamento basato su aptamero.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina dicloridrato (TMB) con H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"PerkinElmerFOOD-1806-1000Reagente per lo sviluppo del colore. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce e all'atmosfera. Precedentemente BIOO Scientific numero di catalogo 1806.
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3'Integrated DNA Technologies (IDT)DNA QtQ47 ottimizzato su misura per EXPAR per la produzione di G-quadruplex, innescato da G-quadruplex. Questo viene utilizzato per la parte "esponenziale" di EXPAR, per aumentare rapidamente la quantità di DNAzima utilizzata per lo sviluppo del colore della Fase 3. Il modello include una 3'-biotina per prevenire l'estensione involontaria da parte della DNA polimerasi Bst 2.0 durante EXPAR.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Sequenzediribozima allosterico che riconoscono la teofillina (ribozima auto-scisso regolato dal dominio dell'aptamero dell'RNA per la teofillina) modificata da Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Alterazione del riconoscimento molecolare degli aptameri dell'RNA mediante selezione allosterica, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Modellodi DNA P3tQ49 ottimizzato su misura per EXPAR per la produzione di G-quadruplex, innescato dal prodotto di scissione P3. Questo viene utilizzato nella fase 2 per tradurre il prodotto di scissione in DNAzima utilizzato per lo sviluppo del colore della fase 3. Il modello include una 3'-biotina per prevenire l'estensione involontaria da parte della DNA polimerasi Bst 2.0 durante EXPAR.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
5x tampone RibozymeAptagen, LLCN/A 5xcomposizione: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Utilizzato nel passaggio 1.
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 1-4.
Kit dimostrativo Aptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBIl kit dimostrativo mostra la specificità del test colorimetrico rilevando bersagli difficili di piccole molecole, teofillina rispetto alla caffeina, che differiscono solo per un singolo gruppo metilico.
Bst 2.0 DNA polimerasiNew England BiolabsM0537SPolimerasi di amplificazione isotermica con attività di spostamento del filamento. Parte della miscela Nickase-Polimerasi, preparata a 9,375 U/uL.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-1.
Buffer 3.1New England BiolabsB6003SVIALcombinato con 2 uL di tampone di amplificazione isotermica 10X e 27,5 uL di acqua priva di nucleasi per produrre un tampone EXPAR 1.11X in EXPAR Mix. Questo prodotto sostituisce il B7203SVIAL utilizzato in precedenza che faceva parte dello sviluppo iniziale del sistema (stessa composizione tranne BSA non ricombinante).
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
CaffeinaSigma-AldrichC0750-100GContro-bersaglio Aptamero (controllo), preparato con acqua priva di nucleasi.
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 1-1.
dNTPNew England BiolabsN0447SParte della miscela di reazione EXPAR.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
Miscela di reazione EXPARAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTP, 0,38 μ M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 μ g/ml BSA, 0,0635 % Tween 20,
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039risospeso in DMF ad una concentrazione finale di 25 uM.
Fornito in kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 3-1.
Tampone di amplificazione isotermicoNew England BiolabsB0537SVIALcombinato con 2 uL di 10x Buffer 3.1 e 27.5 µ L di acqua priva di nucleasi per produrre 1,11x tampone EXPAR in EXPAR Mix.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLCofattore ribozima a testa di martello, necessario per l'autoscissione.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tubo 1-3.
Termociclatore MJ PTC-100MJ Research, Inc.PTC-100Termociclatore per il controllo delle temperature di incubazione. È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore o blocco caldo.
N, N-dimetilformammide (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLUtilizzato per risospendere l'emina e massimizzare la durata di conservazione in freezer.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 3-1.
Miscela di Nickasi-polimerasiAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 unità/μ L) e Bst 2.0 DNA polimerasi (0,5 unità/μ L).
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SEnzima di nicking per consentire l'amplificazione isotermica continua. Parte della miscela Nickase-Polimerasi, preparata a 0,5 U/uL.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tube 2-1.
Tampone chinasi T4New England BiolabsB0201SVIALTampone per l'enzima necessario per rimuovere il fosfato ciclico.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tubo 1-4.
Polinucleotide chinasi T4New England BiolabsM0201SRimuove il fosfato ciclico post-scissione per consentire al prodotto di scissione di innescare la reazione di amplificazione isotermica.
Fornito in kit dimostrativo Apta-beacon come provette per PCR.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTLettore di piastre per misurare il segnale di assorbanza dai risultati della fase 3.
TheophyllineSigma-AldrichT1633-50G, preparato con acqua priva di nucleasi.
Fornito nel kit dimostrativo Apta-beacon come tubo 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Tampone legante Aptamero.
Parte del kit dimostrativo Apta-beacon Tubo 1-4.
Modello di Bersaglio aptamero

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
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  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
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  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

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