Articolo metodologico

Un approccio di imaging intravitale fluorescente per studiare le dinamiche di segnalazione del calcio indotte dal carico negli osteociti di topo

DOI:

10.3791/64366

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24 febbraio 2023

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1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Il presente articolo descrive l'esecuzione di un approccio di imaging intravitale per osservare la segnalazione del calcio indotta meccanicamente di osteociti incorporati in vivo in tempo reale in risposta al carico meccanico a livello tissutale del terzo metatarso del topo.

Abstract

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Il tessuto osseo è squisitamente sensibile alle differenze nell'entità del carico meccanico. Gli osteociti, cellule dendritiche che formano un sincizio in tutto l'osso, sono responsabili della funzione meccanosensoriale del tessuto osseo. Gli studi che impiegano l'istologia, la modellazione matematica, la coltura cellulare e le colture di organi ossei ex vivo hanno notevolmente migliorato la comprensione della meccanobiologia degli osteociti. Tuttavia, la questione fondamentale di come gli osteociti rispondano e codifichino le informazioni meccaniche a livello molecolare in vivo non è ben compresa. Le fluttuazioni intracellulari della concentrazione di calcio negli osteociti offrono un obiettivo utile per saperne di più sui meccanismi di meccanotrasduzione ossea acuta. Qui, riportiamo un metodo per studiare la meccanobiologia degli osteociti in vivo, combinando un ceppo di topo con un indicatore di calcio codificato geneticamente in fluorescenza espresso negli osteociti con un sistema di carico e imaging in vivo per rilevare direttamente i livelli di calcio degli osteociti durante il carico. Ciò si ottiene con un dispositivo di flessione a tre punti in grado di erogare carichi meccanici ben definiti al terzo metatarso di topi viventi, monitorando contemporaneamente le risposte calcistiche indicate in fluorescenza degli osteociti utilizzando la microscopia a due fotoni. Questa tecnica consente l'osservazione diretta in vivo degli eventi di segnalazione del calcio degli osteociti in risposta al carico dell'intero osso ed è utile nel tentativo di rivelare meccanismi nella meccanobiologia degli osteociti.

Introduzione

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La matrice ossea è organizzata in base alla richiesta meccanica 1,2 e può cambiare dinamicamente per tenere conto dei requisiti meccanici mutevoli 3,4,5. Il lavoro seminale riguardante il meccanismo meccanosensoriale nell'osso è stato pubblicato come documento di modellazione circa 30 anni fa 6,7,8, dove è stato proposto che gli osteociti incorporati all'interno dell'osso percepiscono la deformazione meccanica a livello tissutale attraverso il movimento del fluido nel loro ambiente locale. Questo modello è stato validato sperimentalmente con esperimenti in vitro ed ex vivo, dove è stato chiaramente dimostrato che gli osteociti sono abbastanza meccanosensibili 1,2,3,4,5,6 ed esprimono anche citochine, che dirigono il comportamento degli osteoblasti7 e degli osteoclasti 8,9,10 che costruiscono l'osso. 11,12.

La segnalazione del calcio è un secondo messaggero ubiquitario che si è affermato come figura centrale e bersaglio sperimentale affidabile nella meccanobiologia degli osteociti 13,14,15,16. La segnalazione del calcio ha il vantaggio di essere ampiamente studiata in biologia cellulare17, il che significa che si sa molto sui suoi effetti a valle e sui corrispondenti strumenti fluorescenti disponibili per l'osservazione sperimentale. Le analisi in vitro hanno utilizzato la segnalazione del calcio come mezzo per identificare l'attivazione meccanica degli osteociti e caratterizzare il comportamento dinamico di segnalazione 5,18,19. Da notare che l'osservazione della segnalazione del calcio in una linea cellulare di osteociti ha fornito la prova definitiva che l'attivazione del fluido agli attacchi delle integrine lungo il processo cellulare è probabilmente la principale forma di attivazione del flusso di fluido20. Questo studio è uno dei tanti che mostrano l'utilità della segnalazione del calcio. È indotta in modo affidabile con l'attivazione meccanica degli osteociti e quindi funge da potente bersaglio per l'interrogazione della meccanobiologia degli osteociti.

La meccanotrasduzione degli osteociti in vivo dipende fortemente dal loro microambiente immediato. Le proteine leganti la matrice (ad esempio, proteoglicani, integrine) forniscono attacchi funzionali tra le membrane cellulari degli osteociti in una disposizione che è fondamentale per l'attivazione dei fluidi della cellula21,22. Sebbene le analisi in vitro bidimensionali (2D) siano utili, sono limitate in quanto non incorporano queste caratteristiche tridimensionali critiche (3D). Preparazioni ex vivo di segnalazione del calcio degli osteociti utilizzando la microscopia confocale hanno fatto luce su come gli osteociti rispondono mantenendo intatta la matrice circostante13,16. Tuttavia, si ritiene che la rimozione dell'afflusso di sangue dall'osso modifichi i nutrienti e la dinamica dei fluidi del sistema lacunocanalicolare. L'interrogazione della meccanobiologia degli osteociti richiede lo studio in vivo della segnalazione degli osteociti indotta dal carico.

Lo studio in vivo delle cellule incorporate nell'osso è stato in gran parte ostacolato dai limiti delle tecniche di imaging tradizionali, come la microscopia a campo chiaro e confocale. Gli osteociti sono posizionati in una matrice mineralizzata23 composta da idrossiapatite, collagene di tipo 1 e altre proteine non collagene che limitano l'accessibilità ottica24 e rendono l'indagine in vivo tecnicamente impegnativa. Tuttavia, i recenti progressi nell'imaging fluorescente non lineare e nei reporter di calcio geneticamente codificati presentano l'opportunità di superare queste sfide.

Qui, riportiamo un nuovo approccio con la capacità di visualizzare gli osteociti in vivo per misurare la segnalazione del calcio con risoluzione a livello cellulare25. Ciò si ottiene utilizzando per la prima volta negli osteociti di topo un marcatore fluorescente dinamico che utilizza un indicatore di calcio geneticamente codificato. I topi con espressione mirata agli osteociti guidata da DMP1-Cre di GCaMP6f mostrano fluorescenza visibile negli osteociti in tutta la corteccia diafisaria dei metatarsi dei topi 17,26. Utilizziamo un sistema di flessione a tre punti per applicare livelli fisiologici di entità della deformazione compresi tra 250 e 2.000 με27. Questa tecnica consente la visualizzazione in vivo delle dinamiche di segnalazione del calcio degli osteociti durante il carico meccanico dell'intero osso e potrebbe essere utile a chiunque cerchi di comprendere la meccanobiologia degli osteociti. Questo metodo sarebbe appropriato per i ricercatori che cercano di espandere il loro lavoro dalle analisi in vitro alle applicazioni in vivo, in particolare mantenendo le analisi molecolari basate sulla funzionalità (cioè lo studio dell'attività cellulare tramite la segnalazione del calcio) rispetto agli studi di fenotipizzazione su larga scala.

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Protocollo

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Tutti i metodi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Cornell University.

1. Preparazione dei materiali e delle attrezzature

  1. Progettare e costruire il dispositivo di caricamento metatarsale per l'uso con un microscopio multifotone a soffitto.
    NOTA: I dettagli relativi alle specifiche dei componenti e al funzionamento del dispositivo sono descritti nella documentazione supplementare di uno studio precedente25. In sintesi, i componenti principali sono costituiti da un attuatore in serie con una cella di carico e una staffa di carico, un bagno d'acqua e un perno di fulcro. L'attuatore e la cella di carico possono essere acquistati in commercio e devono essere in grado di sopportare carichi fino a 300 g. Il bagno d'acqua, il perno di fulcro e la staffa di carico devono essere costruiti in titanio o acciaio inossidabile. Possono essere fabbricati internamente o commercialmente tramite la stampa 3D in metallo.
  2. Calibrare in anticipo i valori dell'entità della deformazione in base allo spostamento dell'attuatore per i singoli gruppi di topi (ad esempio, sesso, trattamento, genotipo). Questo viene fatto utilizzando la mappatura della deformazione superficiale in una procedura descritta in uno studio precedente25.
  3. Utilizzare topi con background C57BL/6, di età compresa tra 16 e 18 settimane, che esprimono costrutti di indicatori di calcio fluorescenti negli osteociti. L'espressione mirata degli osteociti si ottiene incrociando topi GCaMP6f e Dmp1-Cre attivati da flox. I dettagli delle strategie di allevamento e dei fornitori per i topi fondatori sono descritti in uno studio pubblicato in precedenza25.
  4. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, la staffa di carico, il bagno d'acqua e il perno del fulcro utilizzando un'autoclave (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Disinfettare gli obiettivi del microscopio con etanolo al 100%.
  5. Accendi i componenti elettronici, tra cui sorgente laser, microscopio, cella di carico e attuatore. Attendere 15-20 minuti affinché ciascun componente si riscaldi prima dell'imaging intravitale.
    1. Assicurarsi che i componenti dell'attuatore e della cella di carico siano collegati e attivati nel dispositivo di controllo. Genera il software di controllo con una varietà di piattaforme, tra cui Matlab, LabView e Python, in base alle preferenze dell'utente. Il codice Matlab principale utilizzato in questo studio è chiamato Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (all'interno della cartella MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1).
      NOTA: La maggior parte dei sistemi di microscopio a due fotoni disponibili in commercio è dotata di un robusto software di imaging. Le caratteristiche principali richieste per questo metodo sono la capacità di sintonizzare un laser sull'eccitazione appropriata per GCaMP6f (920 nm), la capacità di regolare l'intensità della potenza del laser e una raccolta di serie temporali con una frequenza di almeno 6 Hz. Prima della sperimentazione, è necessario confermare la connessione del laser al software di imaging e la disposizione appropriata del percorso della luce per l'imaging a due fotoni. Ciò viene confermato in modi diversi a seconda della configurazione dell'imaging. Di solito, c'è un indicatore luminoso.

2. Chirurgia

  1. Preparare una fase chirurgica e sterilizzare la superficie con etanolo al 70%. Assicurarsi che le tecniche asettiche siano impiegate durante le procedure chirurgiche. Mantenere il livello di pulizia richiesto per questo protocollo, poiché si tratta di una procedura terminale.
  2. Anestetizzare il topo con isoflurano vaporizzato miscelato con aria o ossigeno per uso medico a una portata di 1 L/min. Eseguire l'anestesia iniziale in una camera di induzione per roditori con isoflurano al 3%-5%. Mantenere l'anestesia all'1%-2,5% di isoflurano in un cono nasale per le procedure di imaging chirurgico e intravitale.
  3. Posizionare un dispositivo di riscaldamento sotto o accanto al mouse per aiutare a mantenere la temperatura corporea interna omeostatica. Monitorare la temperatura corporea del topo, la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno durante l'intervento chirurgico. Mantieni la frequenza respiratoria tra 60-80 respiri al minuto e mantienila regolando il dosaggio dell'isoflurano.
  4. Posiziona il mouse in posizione supina. Confermare la profondità dell'anestesia prima dell'incisione con un pizzico per le dita dei piedi. Identificare la posizione tra il secondo e il terzo metatarso. Praticare un'incisione con bisturi attraverso il derma tra il secondo e il terzo metatarso, partendo dall'estremità distale e progredendo prossimalmente lungo la lunghezza delle ossa (~5 mm).
    NOTA: I metatarsi sono distali alle ossa della caviglia sulla zampa e seguono direttamente prossimalmente le falangi distali. Sono costituiti da metatarsi (da mediali a laterali) I, II, III, IV e V. Il terzo metatarso è centrato al centro dell'aspetto volare della zampa posteriore.
  5. Usando una pinza, aprire il sito chirurgico tirando la pelle verso i bordi mediali/laterali. Resecare i tendini estensori usando le forbici Vannas dritte per esporre il terzo metatarso.
  6. Inserire il perno del fulcro centrale del dispositivo di carico metatarsale sotto il terzo metatarso.
    1. Inizialmente, inserire il perno nel piccolo spazio all'estremità distale dove il terzo metatarso incontra la falange prossimale e quindi spostare il perno prossimalmente fino a quando non si trova a metà dell'asta del terzo metatarso.
    2. Prestare particolare attenzione a garantire un'interfaccia diretta tra l'osso e il perno, escludendo qualsiasi muscolo e plancia. Questo è fondamentale per ottenere immagini stabili durante i protocolli di caricamento.
  7. Tenere la caviglia con una pinza e posizionare il piede nel bagno d'acqua riempito con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (8-10 ml). Fissare la zampa in posizione con la staffa di carico e collegare la staffa alla disposizione attuatore/cella di carico. La Figura 1 mostra una preparazione chirurgica completata e la disposizione all'interno del dispositivo.

3. Imaging

NOTA: La configurazione completa di microscopia a due fotoni utilizzata in questo protocollo dispone di due pacchetti software: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 per il laser (Figura 2) e ThorImageLS4.0 per il microscopio (Figura 3). Per scattare un'immagine sui due fotoni, premere Live (Figura 3, pulsante di riproduzione blu). Quando si esegue un esperimento per creare un'immagine e salvare i dati, premere Acquisisci (Figura 3, la scheda nella parte superiore, accanto a Impostazione acquisizione). Questi sono specifici per l'apparecchiatura e i fornitori utilizzati in questo esperimento, ma funzionerebbero anche molte alternative con le specifiche necessarie presenti in questo protocollo (lunghezze d'onda di eccitazione, dimensioni della finestra visualizzabile, velocità di acquisizione dell'immagine, ecc.).

  1. Raccogliere con molta attenzione la configurazione del dispositivo di caricamento con il mouse e posizionarla sulla piattaforma del microscopio.
  2. Inizia con un obiettivo a basso ingrandimento in modalità epifluorescenza (Figura 3, menu a discesa in alto con le selezioni Multifotone o Impostazione fluorescenza) per individuare e centrare la diafisi media dell'osso.
  3. Dopo aver individuato una regione di interesse, passare a un ingrandimento dell'obiettivo a immersione in acqua più elevato (20x-40x) e passare all'ottica a due fotoni (Figura 3, menu a discesa in alto con le selezioni Multifotone o Impostazione fluorescenza).
    NOTA: La dimensione del campo visivo consigliata è di almeno 250 μm x 250 μm per l'attività cellulare e può essere ottenuta con lo zoom ottico o digitale a seconda del sistema di imaging.
    1. La densità di pixel minima adatta è di 512 pixel x 512 pixel. Per impostare la densità dei pixel, utilizzare le impostazioni di controllo dell'area Galvo/Risonanza (Figura 3).
    2. Quando si individua il ROI, evitare il fotobleaching riducendo la potenza utilizzando l'opzione Power Control (Figura 3) e aumentando l'amplificazione PMT nelle impostazioni di controllo Galvo/Resonance Scanner (Figura 3).
    3. Identificare la superficie dell'osso in modalità a due fotoni cercando l'autofluorescenza fibrosa del periostio nel canale verde che utilizza un filtro passa-banda centrato a 525 nm.
      NOTA: L'autofluorescenza è più visibile con la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nm, ma è disponibile anche con eccitazione a 920 nm (Figura 3, Controllo laser multifotone). Questo punto di riferimento è importante per determinare la profondità relativa del ROI nella corteccia metatarsale quando si osservano gli osteociti. Va notato che durante gli esperimenti di serie storiche, l'esatta profondità del piano ripreso non viene registrata, sebbene tenda a variare tra 15-30 μm. Se si desidera effettuare misurazioni esatte della profondità, è necessario eseguire uno z-stack.
  4. Eseguire un test di carico per assicurarsi che la preparazione chirurgica e il posizionamento all'interno del dispositivo di carico siano stati efficaci nel raggiungere un campo ROI stabile (cioè nessuno spostamento del piano z). In breve, eseguire un ciclo di carico per valutare la stabilità della preparazione chirurgica. Esegui il caricamento eseguendo la sezione Switch on Servo and Move nel codice Matlab.
    1. Applicare una piccola tara. Assicurarsi che i protocolli di caricamento delle onde haversine appropriati siano preparati in anticipo. Inserire i parametri di carico appropriati ottenuti durante la taratura nella sezione 1.2. Esegui il caricamento eseguendo la sezione Switch on Servo and Move nel codice Matlab.
    2. Se sullo schermo c'è un movimento visibile delle cellule, che deriva dal micromovimento dell'osso in risposta al carico o alla respirazione, selezionare un ROI diverso lungo le direzioni y o z per assicurarsi che sia direttamente sopra il perno del fulcro centrale. Se il movimento persiste, regolare manualmente la posizione chirurgica del perno sotto il terzo metatarso.
      NOTA: Una buona regione di interesse (ROI) è quella in cui le celle non si muovono dentro e fuori dal piano/fuoco. Il movimento nelle direzioni x e y può essere regolato per la post-elaborazione utilizzando il plug-in di corrispondenza dei modelli su ImageJ.
  5. Condurre l'imaging z-stack o t-series con carico secondo il disegno sperimentale per registrare rispettivamente eventi di segnalazione indotti dal carico morfometrico o dinamico.
    1. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione per l'indicatore fluorescente (ad esempio, 920 nm per GCaMP6f). Per lo z-stack, utilizzare una risoluzione sufficientemente bassa per catturare le caratteristiche degli osteociti, come incrementi di 0,25-1 μm. Per la serie t, utilizzare le impostazioni per campionare almeno 6 volte la velocità di caricamento. Per una velocità di caricamento di 1 Hz, l'imaging a 6 fotogrammi al secondo (FPS) rappresenta la velocità di acquisizione minimamente appropriata (Figura 3, Controllo dello scanner Galvo/Risonanza).
    2. Per il caricamento e l'imaging dal vivo, raccogliere i dati di base non caricati ad ogni attacco. In questo studio, sono preferiti 60 s di imaging senza carico seguiti da 60 s di carico e imaging. Progettare i protocolli di caricamento e imaging di conseguenza. Per raccogliere i dati, premere Acquisisci (Figura 3, scheda in alto, accanto a Impostazione acquisizione).
      1. Il periodo refrattario per una risposta completa di segnalazione del calcio nelle cellule ossee è stimato in circa 15 minuti28. Attendere almeno il tempo tra i periodi di caricamento sequenziale quando si raccolgono i dati di segnalazione dinamica.
      2. Durante l'intero esperimento, non lasciare l'animale incustodito per assicurarsi che non si svegli inaspettatamente dall'anestesia o provi angoscia senza l'opportunità di intervenire.
        NOTA: L'eutanasia al termine della procedura deve essere eseguita tramite lussazione cervicale o altre misure appropriate in conformità con i metodi approvati dall'IACUC. Si tratta di un protocollo di non sopravvivenza, il che significa che tutti gli animali vengono soppressi dopo l'imaging.

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Risultati

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Qui riportiamo una metodologia per lo studio della segnalazione del calcio negli osteociti incorporati in vivo utilizzando la preparazione chirurgica acuta e l'imaging a fluorescenza multifotone. Il segnale fluorescente verde può essere osservato da indicatori di calcio geneticamente codificati negli osteociti tramite l'espressione di DMP1-Cre. La Figura 4 è un'immagine su un singolo piano di osteociti incorporati. Si noti che tutte le cellule sono marcate ed esprimono una ...

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Discussione

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È difficile studiare sperimentalmente gli osteociti a causa della loro posizione incorporata nella matrice dei tessuti duri, in cui si deteriorano o si dedifferenziano rapidamente dopo la rimozione di questa nicchia. La ricerca sugli osteociti ha richiesto un'immensa ingegnosità negli ultimi 3 decenni, come la creazione di linee simili agli osteociti29,30,31, l'istituzione di protocolli per isol...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#3 Maneggiare il bisturiMicroscopia elettronica Scienze72040-03Forniture chirurgiche
20x Obiettivo ad immersione in acquaOlympusXLUMPLFLN20XWQuesto è un obiettivo 20x, ma 40x può essere utilizzato anche per questo protocollo. Si consiglia l'immersione in acqua perché deve essere immersa nella vasca durante l'imaging, quindi l'obiettivo all'aperto può causare aberrazioni
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120Una risposta sensata ai problemi di gas di anestesia in sala operatoria, il filtro per gas di anestesia F/AIR è stato specificamente progettato per rimuovere i gas di anestesia di scarto come l'isoflurano, Alotano, Enflurano, ecc. dall'ambiente della sala operatoria.
Kit A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80000Un intero kit con tubo e adattatori per collegare F/AIR al setup
B6J. Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Topi per incroci con topi Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Topi per incrocio con topi GCaMP6f 
Cella di carico a compressioneFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Cella di carico subminiaturizzata a trazione e compressione (miniaturizzata/filettata in linea) , Senza piombo RoHS, Materiale - 17-4 PH SS , Filettatura M3x0,5 , 34 Awg Cavo in poliestere intrecciato a 4 conduttori , 5 piedi di lunghezza
Corning 500 mL DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco), 1x [+] calcio, magnesioVWR International21-030-CVIl bagno ionicamente bilanciato che contiene calcio immerge il metatarso durante l'imaging
Strumento di prelievo dentaleMicroscopia elettronica ScienzeForniture chirurgiche
Alcool etilico puro 200 proof Reagente ACS >99,5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLScopi di sterilizzazione
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