Determinazione della cinetica di accensione in vitro e cellulare per aptameri di RNA fluorogenici

Madeline M. Mumbleau; Madeline R. Meyer; Ming C. Hammond

doi:10.3791/64367

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Articolo metodologico

Determinazione della cinetica di accensione in vitro e cellulare per aptameri di RNA fluorogenici

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DOI:

10.3791/64367

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9 agosto 2022

Madeline M. Mumbleau^*¹ , Madeline R. Meyer^*¹ , Ming C. Hammond¹

¹Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il protocollo presenta due metodi per determinare la cinetica degli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci2 e Broccoli. Il primo metodo descrive come misurare la cinetica dell'aptamero fluorogenico in vitro con un lettore di piastre, mentre il secondo metodo descrive in dettaglio la misurazione della cinetica dell'aptamero fluorogenico nelle cellule mediante citometria a flusso.

Abstract

Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati applicati nelle cellule vive per etichettare e visualizzare gli RNA, riferire sull'espressione genica e attivare biosensori fluorescenti che rilevano i livelli di metaboliti e molecole di segnalazione. Per studiare i cambiamenti dinamici in ciascuno di questi sistemi, è auspicabile ottenere misurazioni in tempo reale, ma l'accuratezza delle misurazioni dipende dalla cinetica della reazione fluorogenica che è più veloce della frequenza di campionamento. Qui, descriviamo i metodi per determinare la cinetica di accensione in vitro e cellulare per gli aptameri di RNA fluorogenico utilizzando un lettore di piastre dotato rispettivamente di un iniettore di campioni e di un citometro a flusso. Mostriamo che la cinetica in vitro per l'attivazione della fluorescenza degli aptameri di Spinaci2 e Broccoli può essere modellata come reazioni di associazione a due fasi e avere diverse costanti di velocità di fase rapida di 0,56 s-1 e 0,35 ^s-1, rispettivamente. Inoltre, dimostriamo che la cinetica cellulare per l'attivazione della fluorescenza degli Spinaci2 in Escherichia coli, che è ulteriormente limitata dalla diffusione del colorante nei batteri Gram-negativi, è ancora sufficientemente rapida da consentire una frequenza di campionamento accurata sulla scala temporale minuto. Questi metodi per analizzare la cinetica di attivazione della fluorescenza sono applicabili ad altri aptameri di RNA fluorogenico che sono stati sviluppati.

Introduzione

Le reazioni fluorogeniche sono reazioni chimiche che generano un segnale di fluorescenza. Gli aptameri di RNA fluorogenico svolgono tipicamente questa funzione legando un colorante a piccole molecole per migliorare la sua resa quantica di fluorescenza (Figura 1A)¹. Sono stati sviluppati diversi sistemi di aptameri di RNA fluorogenici costituiti da specifiche sequenze di aptameri di RNA e dai corrispondenti ligandi coloranti¹. Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati aggiunti ai trascritti dell'RNA come tag fluorescenti che consentono l'imaging di cellule vive di mRNA e RNA non codificanti....