Determinazione della cinetica di accensione in vitro e cellulare per aptameri di RNA fluorogenici

Summary

Il protocollo presenta due metodi per determinare la cinetica degli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci2 e Broccoli. Il primo metodo descrive come misurare la cinetica dell'aptamero fluorogenico in vitro con un lettore di piastre, mentre il secondo metodo descrive in dettaglio la misurazione della cinetica dell'aptamero fluorogenico nelle cellule mediante citometria a flusso.

Abstract

Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati applicati nelle cellule vive per etichettare e visualizzare gli RNA, riferire sull'espressione genica e attivare biosensori fluorescenti che rilevano i livelli di metaboliti e molecole di segnalazione. Per studiare i cambiamenti dinamici in ciascuno di questi sistemi, è auspicabile ottenere misurazioni in tempo reale, ma l'accuratezza delle misurazioni dipende dalla cinetica della reazione fluorogenica che è più veloce della frequenza di campionamento. Qui, descriviamo i metodi per determinare la cinetica di accensione in vitro e cellulare per gli aptameri di RNA fluorogenico utilizzando un lettore di piastre dotato rispettivamente di un iniettore di campioni e di un citometro a flusso. Mostriamo che la cinetica in vitro per l'attivazione della fluorescenza degli aptameri di Spinaci2 e Broccoli può essere modellata come reazioni di associazione a due fasi e avere diverse costanti di velocità di fase rapida di 0,56 s-1 e 0,35 ^s-1, rispettivamente. Inoltre, dimostriamo che la cinetica cellulare per l'attivazione della fluorescenza degli Spinaci2 in Escherichia coli, che è ulteriormente limitata dalla diffusione del colorante nei batteri Gram-negativi, è ancora sufficientemente rapida da consentire una frequenza di campionamento accurata sulla scala temporale minuto. Questi metodi per analizzare la cinetica di attivazione della fluorescenza sono applicabili ad altri aptameri di RNA fluorogenico che sono stati sviluppati.

Introduction

Le reazioni fluorogeniche sono reazioni chimiche che generano un segnale di fluorescenza. Gli aptameri di RNA fluorogenico svolgono tipicamente questa funzione legando un colorante a piccole molecole per migliorare la sua resa quantica di fluorescenza (Figura 1A)¹. Sono stati sviluppati diversi sistemi di aptameri di RNA fluorogenici costituiti da specifiche sequenze di aptameri di RNA e dai corrispondenti ligandi coloranti¹. Gli aptameri di RNA fluorogenico sono stati aggiunti ai trascritti dell'RNA come tag fluorescenti che consentono l'imaging di cellule vive di mRNA e RNA non codificanti ^2,3,4. Sono stati anche posizionati dopo sequenze promotrici come reporter fluorescenti di espressione genica, simile all'uso della proteina fluorescente verde (GFP) come reporter, tranne che la funzione di segnalazione è a livello di RNA ^5,6. Infine, gli aptameri fluorogenici dell'RNA sono stati incorporati nei biosensori fluorescenti basati sull'RNA, progettati per innescare la reazione fluorogenica in risposta a una specifica piccola molecola. Sono stati sviluppati biosensori fluorescenti basati su RNA per l'imaging di cellule vive di vari metaboliti non fluorescenti e molecole di segnalazione 7,8,9,10,11.

C'è un crescente interesse nello sviluppo di aptameri di RNA fluorogenici per visualizzare i cambiamenti dinamici nella localizzazione dell'RNA, nell'espressione genica e nei segnali di piccole molecole. Per ciascuna di queste applicazioni, è auspicabile ottenere misurazioni in tempo reale, ma l'accuratezza delle misurazioni dipende dalla cinetica della reazione fluorogenica che è più veloce della frequenza di campionamento. Qui, descriviamo i metodi per determinare la cinetica in vitro per gli aptameri fluorogenici dell'RNA Spinaci2¹² e Broccoli¹³ utilizzando un lettore di piastre dotato di un iniettore di campione e per determinare la cinetica di accensione cellulare per Spinaci2 espressa in Escherichia coli utilizzando un citometro a flusso. Questi due aptameri di RNA sono stati scelti perché sono stati applicati per studiare la localizzazione dell'RNA ^2,3,4, sono stati utilizzati nei reporter^5,6 e nei biosensori 7,8,9,10,11^, e i corrispondenti ligandi coloranti (DFHBI o DFHBI-1T) sono disponibili in commercio. Un riassunto delle loro proprietà in vitro determinate in letteratura è riportato nella Tabella 1 4,13,14, che ha informato lo sviluppo del protocollo (ad esempio^, le lunghezze d'onda e le concentrazioni di colorante utilizzate). Questi risultati dimostrano che le reazioni fluorogeniche influenzate dagli aptameri dell'RNA sono rapide e non dovrebbero impedire misurazioni accurate per le applicazioni biologiche cellulari desiderate.

Protocol

1. Esperimento di cinetica in vitro

1. Preparazione di modelli di DNA mediante PCR
   1. Impostare le reazioni PCR: Per preparare le reazioni PCR, combinare i seguenti reagenti in una provetta PCR a parete sottile:
      33 μL di acqua bidistillata (ddH₂O)
      10 μL di tampone 5x per DNA polimerasi ad alta fedeltà
      5 μL di 2 mM ciascuno desossiribonucleoside trifosfato (dNTP)
      0,5 μL di primer forward da 40 μM
      0,5 μL di primer inverso da 40 μM
      0,5 μL (10-100 ng) di modello di DNA (solo per Spinaci2 PCR; I primer per broccoli si sovrappongono)
      0,5 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà (aggiungere per ultimo)
      NOTA: Gli oligonucleotidi sintetici vengono spesso spediti a secco. Per preparare le soluzioni stock, aggiungere un volume noto (100 μL raccomandati) di ddH₂O e misurare l'A₂₆₀ di quella soluzione per determinare la concentrazione secondo la legge di Beer, dove il coefficiente di estinzione può essere calcolato dalle regole del vicino più vicino online. Questa soluzione madre può quindi essere utilizzata per rendere le diluizioni appropriate per l'uso nella PCR.
   2. Eseguire il protocollo del termociclatore.
      1. Utilizzare il seguente protocollo termociclatore per amplificare i modelli di DNA di spinaci2 e broccoli a lunghezza intera:
         Denaturazione iniziale:98 °C per 2 min
         35 cicli:
         Denaturazione:98 °C denaturazione per 15 s
         Ricottura:72 °C per 30 s
         Estensione:72 °C per 30 s
         Estensione finale: 72 °C per 5 min.
      2. Dopo la reazione, analizzare una piccola aliquota del prodotto con gel di agarosio al 2% insieme a una scala a basso peso molecolare (intervallo di dimensioni: 25-766 nucleotidi) per confermare la presenza del prodotto di DNA desiderato.
      3. Purificare il prodotto mediante kit di estrazione del gel o di pulizia PCR disponibili in commercio ed eluire con ddH₂O o il tampone fornito dal produttore.
         NOTA: Quando si sceglie un kit di pulizia PCR, assicurarsi che il limite di peso molecolare della colonna sia abbastanza basso da trattenere i broccoli T7 (81 nucleotidi), altrimenti il prodotto PCR andrà perso.
         NOTA: Punto di pausa opzionale: conservare il DNA a -20 °C.
2. Preparazione dell'RNA di spinaci2 e broccoli mediante trascrizione in vitro (IVT)
   1. Impostare le reazioni di trascrizione.
      1. Per preparare una reazione di trascrizione da 100 μL, combinare i seguenti reagenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml: 10 μL di tampone trascrizionale 10x + 20 μL di trifosfato ribonucleosidico 10 mM (rNTPs) + 1-64 μL di DNA template (totale di 1 μg) + 2 μL di pirofosfatasi inorganica + ddH 2 O a 98 μL +₂μL di T7 RNA polimerasi (aggiungere per ultimo).
      2. Incubare questa reazione per 4 ore a 37 °C. Estinguere la reazione aggiungendo 100 μL di 2x tampone di carico su gel ureico (2x ULB), composto da 20% di saccarosio, 0,1% di sodio dodecilsolfato (SDS), 1x tampone Tris-Borato-EDTA (1x TBE) e ~18 M urea.
         NOTA: Punto di pausa opzionale: conservare la reazione spenta a -20 °C.
3. Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) purificazione dell'RNA
   1. PAGE purificazione dell'RNA di Spinaci2 e Broccoli
      ATTENZIONE: L'acrilammide non polimerizzata (liquida o in polvere) è estremamente tossica. Se si pesa l'acrilammide in polvere, farlo in una cappa aspirante. Indossare sempre dispositivi di protezione adeguati e rimuovere immediatamente i guanti contaminati da polvere o soluzione di acrilammide, lavandosi accuratamente le mani. Se l'acrilammide viene a diretto contatto con la pelle, lavare l'area esposta per almeno 15 minuti con acqua e sapone. Se l'acrilammide viene a contatto diretto con gli occhi, sciacquarli con acqua per 15 minuti.
      1. Preparare il gel PAGE: per rimuovere trascrizioni abortive indesiderate e rNTP non reagiti dal prodotto a lunghezza intera, preparare un gel urea-poliacrilammide al 6%. In generale, i gel da 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm possono essere utilizzati con un pettine a 8 pozzetti. Impostare l'apparecchiatura per gel ed elettroforesi, utilizzando 1x tampone TBE per riempire i serbatoi.
      2. Caricare campioni di RNA nel gel PAGE: caricare il gel con una reazione temprata di 200 μL per corsia. In una corsia separata, caricare 2x ULB con coloranti tracker xilene cianolo e blu di bromofenolo, che migrano nel gel a 106 nucleotidi e 26 nucleotidi, rispettivamente¹⁵. Lasciare una corsia vuota tra ogni campione per evitare potenziali contaminazioni nelle fasi successive.
      3. Eseguire il gel PAGE: Per separare 95-nt Spinaci2 e 49-nt Broccoli dai rispettivi prodotti troncati, eseguire il gel per 1,5-2 ore a 25 W, a quel punto il colorante blu di bromofenolo sarà migrato ~ 5/6 della lunghezza del gel.
      4. Visualizza i campioni di RNA nel gel PAGE: smontare le lastre di vetro attorno al gel e coprire il gel con un involucro di plastica su entrambi i lati, etichettando le corsie sull'involucro. Visualizza le bande di RNA in una stanza buia mediante ombreggiatura UV posizionando il gel avvolto su una piastra TLC fluorescente sotto la luce UV. Delinea rapidamente il bordo delle bande di RNA corrispondenti al prodotto con un pennarello e spegni la lampada UV per ridurre al minimo i danni causati dall'esposizione ai raggi UV.
      5. Eliminare ed estrarre il/i campione/i di RNA dal gel PAGE: con una lama di rasoio fresca per ogni campione, asportare le fasce di prodotto desiderate, tagliare a dadini ~ 1 mm e aggiungere i pezzi di gel in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con 500 μL di tampone di ammollo per estrarre l'RNA su un rotatore per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte a 4 °C.
         NOTA: Punto di pausa opzionale: il campione può essere conservato a -20 °C.
      6. Precipitare l'RNA
         1. Per separare i pezzi di gel dall'RNA estratto in tampone, centrifugare il campione a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C, quindi utilizzare una pipetta a punta stretta per estrarre il surnatante e caricarlo in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 ml.
         2. Per precipitare l'RNA, aggiungere 1,5 ml di etanolo ghiacciato e 1 μL di 20 mg/ml di glicogeno, vortice e conservare per almeno 1 ora a -20 °C o -80 °C.
            NOTA: Punto di pausa opzionale: l'RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
      7. Raccolta del precipitato di RNA: pellettare l'RNA precipitato mediante centrifugazione a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e lasciare che l'etanolo rimanente evapori all'aria aperta (~1 h) prima di risospendere il pellet in 30 μL di tampone ddH₂O o 1x TE.
         NOTA: Questo processo si traduce tipicamente in una concentrazione finale di RNA di ~10 μM.
         NOTA: Punto di pausa opzionale: il campione di RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
   2. Determinare le concentrazioni di stock di RNA.
      1. Preparare un'aliquota di RNA per la reazione di idrolisi.
         1. Per eseguire questo test, in primo luogo, utilizzare un nano spettrofotometro UV / Vis per determinare l'A₂₆₀ del campione di RNA stock e fare un'aliquota diluita del campione a ~ 10 unità di assorbanza (AU) in ddH₂O.
         2. Preparare la seguente reazione in una provetta PCR da 0,5 ml: 16 μL di ddH 2 O + 2 μL di tampone 10x Na 2 CO₃ +₂μLdi aliquota di RNA diluita a ~10 UA. Incubare la reazione per 90 minuti a 95 °C, quindi lasciarla raffreddare a RT.
      2. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando assorbanze nucleotidiche: misurare l'A₂₆₀ di questo campione con un nanospettrofotometro UV/Vis e calcolare la concentrazione di RNA utilizzando la seguente formula:
         
         dove c è la concentrazione di RNA, b è la lunghezza del percorso, i è il nucleotide specifico (A, C, G o U), n i è la frequenza del nucleotide i nella sequenza di RNA e ε i è il coefficiente di estinzione molare del nucleotide _i. Per determinare la concentrazione originale di RNA stock, moltiplicare c per il fattore di diluizione.
         NOTA: Punto di pausa opzionale: l'RNA può essere conservato a -20 °C per alcuni mesi.
4. Esecuzione di un in vitro Saggio cinetico del lettore di piastre
   1. Impostare il programma di rinaturazione dell'RNA: creare il seguente protocollo di termociclatore selezionando Crea nuovo programma > Aggiungi nuova fase > Aggiungi nuovo passaggio più volte per aggiungere ciascuno dei seguenti passaggi prima di premere Salva:
      70 °C per 3 min
      65 °C per 45 s
      60 °C per 45 s
      55 °C per 45 s
      50 °C per 45 s
      45 °C per 45 s
      40 °C per 45 s
      35 °C per 45 s
      30 °C per 45 s
   2. Rinaturare l'RNA: Per rinaturare gli RNA di spinaci2 e broccoli, preparare 2 μM di ciascun RNA in ddH 2O in una provetta PCR a parete sottile da 0,5 ml, quindi aggiungere un volume uguale di tampone di rinaturazione 2x (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl₂) per produrre soluzioni di RNA 1 μM. Aggiungere i tubi al termociclatore, aprire il programma di rinaturazione salvato e premere Esegui.
      NOTA: Se un termociclatore non è disponibile, gli RNA possono invece essere incubati su un blocco di calore a 70 °C per 3 minuti e quindi lasciati raffreddare lentamente a RT sul banco.
   3. Preparare il tampone di reazione di legame: Per preparare il tampone per una reazione di legame aptamero-colorante, creare una miscela master contenente componenti tampone (69,5 μL di ddH 2 O + 4 μL di HEPES 1 M, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL di 2 M KCl + 0,3 μL di 1 M MgCl₂). A seconda del numero di campioni e repliche necessari, moltiplicare questi valori per il numero di campioni più uno. In generale, tre repliche per campione di RNA sono soddisfacenti.
   4. Preparare il lettore di piatti.
      1. Impostare il programma dell'iniettore del lettore di piastre: sul lettore di piastre a fluorescenza, selezionare Temp e impostare la temperatura desiderata su 37 °C, assicurandosi che la temperatura si sia equilibrata a questo valore ben prima di iniziare gli esperimenti di cinetica. Aprire il software del lettore di piastre, selezionare Impostazioni > Vista acquisizione e immettere il seguente programma per le misurazioni cinetiche:
         Loop: Per ogni pozzo
         Impostazione di base: 60 letture della linea di base
         Impostazioni SmartInject: iniezione da 10 μL (che avverrà dopo la lettura della linea di base)
         La fluorescenza (o FL) recita:
         Eccitazione: 448 nm (larghezza di banda: 9 nm)
         Emissioni: 506 nm (larghezza di banda: 15 nm)
         Cartuccia: MONO (n/s 3297)
         Calcolo del tempo:
         Tempo di lettura totale: 10 min
         Intervallo di lettura: 0,5 s
         PMT e ottica: 6 lampeggi per lettura
         Loop: Prossimo pozzo
      2. Preparare l'iniettore
         1. Lavare e aspirare l'iniettore: Per preparare l'iniettore del lettore di piastre, selezionare prima Inietta sul lettore di piastre, fornire una piastra di raccolta dei rifiuti al lettore di piastre quando indicato, quindi selezionare Lava e pulire il tubo di iniezione seguendo le istruzioni sul lettore di piastre con 1 mL di volumi di ddH 2 O, 75% etanolo in ddH₂O, e poi ddH₂O. Quindi, selezionare Aspira, consentendo all'iniettore di espellere il liquido in eccesso.
         2. Innescare l'iniettore: dopo essere usciti dalla schermata precedente, selezionare Prime per innescare l'iniettore con due volumi da 260 μL di ligando da iniettare per garantire che il ligando puro e concentrato venga aggiunto ai campioni durante gli esperimenti, in questo caso, primo con DFHBI 100 μM in ddH₂O.
   5. Eseguire esperimenti di cinetica in vitro : per eseguire un esperimento di cinetica, aggiungere prima 80 μL di master mix tampone di legame precedentemente preparato a un pozzetto di una piastra a fondo chiaro a 96 pozzetti, seguita da 10 μL di RNA rinaturato. Lasciare che questa piastra e la soluzione di DFHBI nell'iniettore si equilibrino a 37 °C per 15 minuti nel lettore di piastre.
   6. Nelle impostazioni del software del lettore di piastre in Area di lettura, selezionare il pozzo da analizzare, quindi nella scheda Home , selezionare Esegui per eseguire il programma cinetico descritto in precedenza. Ripetere questo processo fino al completamento di tutti gli esperimenti.
      NOTA: Criticamente, gli esperimenti di cinetica dovrebbero essere eseguiti un pozzetto alla volta per garantire che la cinetica dell'RNA sia misurata in condizioni identiche tra repliche e campioni.
   7. Lavare l'iniettore: Per rimuovere la soluzione rimanente di DFHBI dal tubo di iniezione, lavare il tubo di iniezione come descritto al punto 1.4.4.2.1 con 1 mL di volumi di ddH 2 O, etanolo al 75% in ddH 2 O e quindiddH₂O.
      NOTA: punto di pausa opzionale.
5. Analisi della cinetica in vitro di aptameri di RNA fluorogenici.
   1. Inserimento dei dati nel software di analisi: esporta i dati sperimentali come foglio di calcolo per copiare facilmente i dati per l'elaborazione. Nel software di analisi, creare una nuova tabella di dati in formato XY. Nella colonna X, immettere ogni timepoint di lettura, dove t = 0 è l'ora dell'iniezione di DFHBI. Nella colonna Y, immettere i valori medi di fluorescenza tra le repliche in quel rispettivo punto temporale a partire da t = 0.
   2. Normalizzare e rappresentare graficamente i dati: per normalizzare i valori di fluorescenza, fare clic su Analizza > elaborazione dati > Normalizza, quindi fare clic su OK. Scegliere di utilizzare i valori più piccoli e più grandi del set di dati per la normalizzazione, per presentare i risultati come frazioni e per rappresentare graficamente i risultati, quindi fare clic su OK. Per creare un grafico della fluorescenza media normalizzata nel tempo, fare clic sull'icona Normalizza di [Nome set di dati] e selezionare Famiglia grafico: XY con solo punti.
      NOTA: le barre di errore possono essere utili da vedere nei casi in cui viene rappresentato un piccolo numero di punti temporali. Se lo si desidera, quando si sceglie una tabella di dati in formato XY, selezionare l'opzione sotto "Y" per immettere i valori di replica in colonne affiancate. Rappresentando graficamente la tabella risultante con le opzioni predefinite selezionate, verrà prodotto un grafico con barre di errore.
   3. Eseguire il raccordo della curva per ottenere i parametri cinetici: per adattare una curva ai dati cinetici, fare clic su Analizza > Analizza dati e selezionare Regressione non lineare (adattamento curva) nella scheda Analisi XY . Nella scheda Modello , fare clic su Associazione esponenziale > bifase per adattare i dati cinetici con la seguente equazione di associazione a due fasi:
      
      dove Y è la fluorescenza al tempo X, Y 0 è la fluorescenza a t = ₀, K _Fast e K Slow sono rispettivamente costanti veloci e lente, e SpanFast e _SpanSlow sono gli intervalli di accensione della fluorescenza rappresentati rispettivamente dalla velocità veloce e lenta (vedi risultati rappresentativi, Figura 1). Fare clic sulla scheda Adattamento Nonlin per visualizzare le costanti di velocità, i valori t_1/2 e i valori PercentFast.
      NOTA: per ottenere una deviazione standard per tutti questi valori, le singole repliche dell'esperimento del lettore di piastre possono essere elaborate nello stesso modo descritto sopra.

2. Esperimento di cinetica cellulare

1. Preparazione di ceppi di E. coli
   1. Trasformare le cellule di E. coli BL21 Star (DE3) con ~100 ng di costrutto pET31b tRNA-Spinaci2 seguendo il protocollo del produttore.
      NOTA: Il costrutto plasmidico è disponibile in commercio (Plasmid #79783).
   2. Placcare le cellule su piastre di agar LB contenenti carbenicillina (Carb: 50 mg/ml) e incubare a 37 °C per 12-16 ore. Le cellule contenenti plasmidi cresceranno come colonie sulla piastra.
      NOTA: Punto di pausa opzionale: le celle BL21 Star trasformate su piastre possono essere conservate a 4 °C avvolte in parafilm per 1 settimana.
2. Cellule in crescita e induzione dell'espressione di aptameri di RNA fluorogenico
   1. Inoculare una coltura di 2 mL di mezzi non inducenti (NI) contenenti carbenicillina (Carb: 50 mg/ml) con una singola colonia delle cellule BL21 Star trasformate. Ripeti questa operazione per almeno tre repliche biologiche. Incubare le colture a 37 °C in un incubatore/agitatore a 250 rpm per 22-24 h.
      NOTA: Punto di pausa opzionale: Le cellule coltivate nei supporti NI mantengono il plasmide e possono essere conservate a 4 °C per 1 settimana.
   2. Dopo la crescita nei terreni NI, diluire la coltura 100x in un nuovo 3 mL di terreno di autoinduzione (AI) ZYP-5052 contenente carbenicillina (Carb: 50 mg/mL). Far crescere le cellule a 37 °C in un incubatore/agitatore a 250 rpm per 16-18 h per indurre l'espressione.
      NOTA: Il tipico OD₆₀₀ per le colture varia da 2,0-3,3 dopo 18 ore di crescita. L'intervallo di densità cellulare ottimale è compreso tra 2,5-3,0.
3. Esecuzione dell'esperimento di cinetica cellulare
   1. Impostare il citometro a flusso.
      1. Accendere il citometro a flusso e il computer collegati allo strumento. Una volta effettuato l'accesso al software per il citometro a flusso, nella scheda Strumento , fare clic sull'icona Avvio . Seguire i passaggi indicati nella schermata del software per garantire la corretta inizializzazione della strumentazione.
         NOTA: Alcuni citometri a flusso chiamano la sequenza di avvio dello strumento Priming. Assicurati di seguire il protocollo del produttore per il citometro a flusso che verrà utilizzato per l'esperimento.
      2. Eseguire un test delle prestazioni (se applicabile). Nella scheda Menu principale , fare clic su Test delle prestazioni. In un tubo di coltura, aggiungere tre gocce delle perle di monitoraggio delle prestazioni del produttore in 3 ml di fluido di messa a fuoco.
      3. Posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione e sollevare il sollevatore. Prima di fare clic su Esegui test prestazioni, assicurarsi che il lotto # del tubo delle perline di tracciamento corrisponda a quello indicato nella schermata di configurazione del test delle prestazioni . Fare clic su Test delle prestazioni per eseguire il test.
      4. Impostare il software del citometro a flusso per questo esperimento con i seguenti parametri di acquisizione per la fluorescenza a singola cellula:
         Eccitazione laser: 488 nm
         Canale di emissione: GFP (chiamato anche FITC)
         Volume di acquisizione: 40 μL (con un volume di assorbimento totale di 90 μL)
         Portata: 200 μL/ min
         Conteggio delle cellule per ogni misurazione: 30.000
         Impostazioni dello strumento:
         Voltaggio:
         FSC: 480 V
         SSC: 400 V
         BL1: 540 V
         BL2: 392 V
         BL3: 422 V
   2. Impostare i file sperimentali.
      1. Creare un nuovo file dell'esperimento nella scheda Esplora esperimenti facendo clic con il pulsante destro del mouse sul nome utente del citometro a flusso. Seleziona Nuovo esperimento nella finestra a discesa. Quando viene visualizzata una nuova finestra sullo schermo del computer, selezionare OK.
      2. Nel nuovo file dell'esperimento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella "Gruppo" e selezionare Aggiungi nuova provetta di esempio. Etichettare le provette campione per ogni punto temporale specifico e replicarle facendo clic con il pulsante destro del mouse su Campione e selezionando Rinomina nel menu a discesa. Ripetere questo passaggio per il numero totale di repliche e punti temporali per il corso di tempo previsto dello studio.
   3. Preparare una soluzione cellulare diluita: in una nuova provetta di coltura, aggiungere 1,5 ml di 1x soluzione PBS. Quindi, aggiungere 3 μL di cellule indotte nei supporti AI nella soluzione 1x PBS per creare una soluzione cellulare diluita. Ripetere questo passaggio per ogni replica biologica in diverse provette di coltura.
   4. Misurare la fluorescenza di fondo delle cellule: prima di aggiungere il colorante, prendere le letture di ogni tubo di coltura biologico replicato contenente cellule in 1x soluzione PBS. In questo modo viene misurato lo sfondo fluorescente delle cellule per osservare la piega accendersi nel tempo una volta aggiunto il colorante.
      1. Per effettuare una lettura, posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione e sollevare il sollevatore a mano fino all'ago per iniezione del campione. Selezionate il file di esempio appropriato nella scheda Pannello raccolta e fate clic su Registra.
      2. Al termine della corsa, abbassare il sollevatore del tubo campione con il tubo di coltura a mano. Questo avvierà una fase di risciacquo che laverà il sistema fluidico e ridurrà al minimo il trascinamento tra ciascun campione biologico replicato. I dati verranno salvati automaticamente sul computer al termine dell'esecuzione.
      3. Ripetere i passaggi all'interno del punto 2.3.4 per misurare il fondo fluorescente cellulare per almeno tre repliche biologiche. Per passare al file di esempio successivo, selezionare il file di esempio successivo facendo clic sull'icona della freccia destra accanto al nome del tubo di esempio sotto l'icona Record .
   5. Misurare la fluorescenza nei punti temporali per le cellule con colorante.
      1. Aggiungere 1,4 μL di uno stock di colorante concentrato (50 mM DFHBI-1T in DMSO) in 1x soluzione PBS con celle per ottenere una concentrazione finale di 50 μM DFBHI-1T. Quindi, fissare il coperchio del tubo di coltura, quindi invertire i tubi di coltura 3x-5x per miscelare uniformemente la soluzione prima di eseguire la prima lettura del punto di tempo.
         NOTA: La percentuale totale di DMSO all'interno delle provette di coltura per E. coli non deve superare il 10%, poiché ciò può influire sulla vitalità cellulare¹⁶.
      2. Rimuovere il coperchio e inserire il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione. Sollevare manualmente il supporto fino all'ago per iniezione del campione e, sotto il file di campione appropriato, fare clic sull'icona Registra . Inoltre, avviare un timer premendo Start per l'esperimento.
      3. Abbassare manualmente il sollevatore di tubi dopo aver completato la corsa e ripetere i passaggi 2.3.5.1-2.3.5.2. (con il timer in funzione) aggiungendo 1,4 μL di DFHBI-1T concentrato, invertendo le provette di coltura e prendendo letture per tutte le repliche biologiche rimanenti. Queste prime registrazioni saranno le letture ottenute a 0 min per tutte le repliche biologiche. Fallo uno alla volta per ogni replica biologica.
         NOTA: prendere nota del momento in cui viene premuta l'acquisizione della citometria a flusso record. Aderisci a questo tempo sfalsando per i punti temporali nel corso dell'esperimento.
      4. Continuare a prendere le letture sollevando le provette di coltura nel sollevatore del tubo del campione fino all'ago per iniezione del campione, selezionando il file di campione appropriato, facendo clic su Registra e abbassando manualmente il sollevatore al termine di ogni corsa. Fallo per tutti i punti temporali aggiuntivi e le repliche biologiche testate. Ripetere i passaggi fino al completamento dell'esperimento.
         NOTA: Tenere i campioni fuori dalla luce per evitare il fotosbiancamento di DFHBI-1T in soluzione coprendo i campioni con un foglio di alluminio.
   6. Misurare la fluorescenza nei punti temporali per le cellule senza colorante (Control).
      1. Eseguire i protocolli di pulizia appropriati per il citometro a flusso prima di ripetere nuovamente l'esperimento con controlli negativi seguendo il protocollo del produttore. Questa operazione viene eseguita per ridurre al minimo qualsiasi riporto dall'esperimento precedente all'esperimento di analisi del punto temporale di controllo. Di seguito sono riportati i passaggi seguiti per il citometro a flusso tra gli esperimenti:
         1. Posizionare manualmente un tubo di coltura vuoto nel sollevatore di tubi, sollevare il supporto del tubo e fare clic sull'icona Unclog nella scheda Strumento . Questo eseguirà un backflush nel sistema fluidico per pulire eventuali campioni appiccicosi. Abbassare il supporto del tubo a mano e rimuovere il tubo una volta terminata la sequenza Unclog .
         2. Con una nuova provetta di coltura, aggiungere 3 ml di una soluzione di candeggina al 10%, inserire la provetta di coltura nel supporto del tubo e sollevare manualmente il supporto fino all'ago per iniezione del campione. Inoltre, posizionare una piastra pulita a 96 pozzetti nell'autocampionatore, se applicabile al citometro a flusso.
         3. Fare clic sull'icona Sanitize SIP /Sanitize Autosampler SIP per eseguire una sequenza di pulizia con candeggina al 10% in tutto il sistema fluidico. Abbassare il supporto del tubo per completare la sequenza di pulizia.
      2. Impostare i file di esempio per l'analisi del punto temporale di controllo eseguita seguendo le istruzioni riportate nel punto 2.3.3.
      3. In una nuova provetta di coltura, preparare una soluzione cellulare diluita in 1,5 ml di soluzione 1x PBS. Aggiungere 3 μL delle cellule indotte nei mezzi AI nella soluzione 1x PBS per creare una soluzione cellulare diluita. Ripetere questo passaggio per ogni replica biologica.
      4. Aggiungere 1,4 μL di DMSO nella provetta di coltura uno alla volta alla soluzione 1x PBS con cellule e testare gli stessi punti temporali. Fissare il coperchio del tubo di coltura, quindi invertire i tubi di coltura 3x-5x per miscelare uniformemente la soluzione prima di eseguire la prima lettura del punto temporale. Fallo uno alla volta per ogni replica biologica.
      5. Seguire lo stesso protocollo per l'analisi delle celle di controllo come per le cellule con colorante, utilizzando i passaggi 2.3.5.2-2.3.5.4.
   7. Spegnimento del citometro a flusso: seguire il protocollo del produttore per il corretto spegnimento della strumentazione. Per il citometro a flusso, lo strumento è preparato per lo spegnimento nel modo seguente:
      1. Eseguire il protocollo di pulizia iniziale per il citometro a flusso seguendo i passaggi 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
      2. Sostituire il tubo di coltura con una soluzione di candeggina al 10% con un tubo di coltura con 3 ml di fluido di messa a fuoco. Sollevare manualmente il supporto del tubo e, sotto l'icona Shutdown , fare clic sul menu a discesa e selezionare Completo.
         NOTA: punto di pausa opzionale.
4. Analisi dei dati di citometria a flusso
   1. Esportare tutti i file FCS per l'analisi. Aprire i file FCS con un software di analisi della citometria a flusso.
   2. Utilizzando uno dei file FCS solo cella, generare un gate dal dot plot FSC (Forward Scatter) e SSC (Side Scatter) (FSC-Area/SSC-Area), utilizzando entrambi gli assi di log per escludere eventuali segnali dai detriti. Per creare questo cancello, fare clic sull'icona AutoGate sul software di analisi della citometria a flusso e chiamarlo Gate 1. Applicare questa stessa porta a tutti gli esempi testati nella scheda Tutti i campioni nell'area di lavoro di elaborazione dati. Ciò comporterà l'elaborazione del Gate 1 sotto tutti i file FCS.
   3. Creare un nuovo file di sottoinsieme con il file FCS solo cella utilizzato nel passaggio 2.4.2 facendo doppio clic su di esso. Modificate le impostazioni degli assi in FSC-Area/FSC-Height, con entrambi gli assi logaritmici. Fare clic sull'icona AutoGate sul software di analisi della citometria a flusso per generare un cancello ovale, chiamandolo Gate 2. Applicare questo gate come sottoinsieme sotto il gate impostato al punto 2.4.2 a tutti i campioni testati. In questo modo tutti gli esempi avranno Gate 1 > Gate 2 associati a ciascun file FCS.
   4. Creare un altro file di sottoinsieme con entrambi i gate impostati nel passaggio 2.4.2 e nel passaggio 2.4.3 applicati facendo doppio clic su Gate 2. Modificare le impostazioni dell'asse in FSC-Area/Istogramma. Applicare questo gate dell'istogramma come sottoinsieme a tutti i campioni testati, ottenendo che tutti i campioni abbiano Gate 1 > Gate 2 > Gate 2 associati a ciascun file FCS.
      NOTA: gli istogrammi possono essere rinominati da Gate 2 a Histogram per facilitare lo spostamento degli istogrammi nella finestra di layout, nonché per creare più organizzazione con l'elaborazione dei dati.
   5. Per analizzare i valori di intensità media di fluorescenza (MFI), aprire la finestra del layout. Fare clic e trascinare le porte dell'istogramma per ogni punto temporale nella finestra del layout.
   6. Eseguire un'analisi statistica per "∑ Mean: BL1-A" (GFP) per ogni campione testato per visualizzare i risultati MFI nella finestra di layout.
   7. Calcolare la deviazione standard per i valori MFI per analisi del punto temporale per almeno tre repliche biologiche indipendenti.
   8. Salvare gli istogrammi e i valori MFI per ogni punto temporale esportando la finestra di layout come file PDF.
      NOTA: punto di pausa opzionale.
5. Dati di citometria a flusso grafico
   1. Aprire il file PDF contenente gli istogrammi e i valori MFI per ogni punto temporale. I valori MFI verranno copiati in un software di analisi dei dati. Nel software di rappresentazione grafica dei dati, creare una nuova tabella dati nel formato XY.
      1. Selezionare questa opzione per creare una tabella XY con la seguente selezione:
         Tabella dati: immettere o importare dati in una nuova tabella
         Opzioni:
         X: Tempi trascorsi
         Y: Immettere (da tre a quattro) valori di replica in sottocolonne affiancate
      2. Etichettare sull'asse X tutti i punti temporali per l'esperimento e le esecuzioni di controllo.
      3. Nel gruppo A, inserire i valori MFI per tutte le repliche biologiche in ogni punto temporale per l'analisi di fluorescenza delle cellule con il colorante aggiunto.
      4. Nel gruppo B, inserire i valori MFI per tutte le repliche biologiche in ogni punto temporale per l'analisi delle cellule senza colorante (DMSO) aggiunto.
      5. Per osservare i risultati, fare clic su [Inserisci nome set di dati] nella scheda Grafici . Questo mostrerà i punti dati come mezzi, con barre di errore che rappresentano la deviazione standard (s.d.) in ogni punto temporale. L'asse X rappresenta il tempo trascorso e l'asse Y rappresenta i valori MFI.

Results

Cinetica in vitro
Le sequenze dei modelli di DNA e dei primer, che vengono acquistati come oligonucleotidi sintetici, sono mostrate nella Tabella 2 e le ricette dei reagenti sono mostrate nel file supplementare 1. L'amplificazione PCR viene utilizzata per aumentare la quantità di modello di DNA con il promotore T7, che è necessaria per la successiva reazione di trascrizione in vitro (IVT). Inoltre, l'amplificazione PCR può essere ut...

Discussion

Per l'esperimento di cinetica in vitro , lo stesso protocollo generale può essere modificato per misurare la cinetica in vitro di un biosensore fluorescente basato su RNA contenente sia un dominio legante il ligando che un dominio legante il fluoroforo⁸. In questo caso, l'RNA deve essere incubato con il fluoroforo prima delle misurazioni dopo l'iniezione del ligando al fine di ottenere la cinetica di risposta del ligando. Se si osserva un'elevata variabilità tra le repliche, è po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio	Thermo Fischer Scientific	BP160500
Apparecchiature per elettroforesi su gel di agarosio	Thermo Fischer Scientific	B1A-BP
Alpha D-(+)-lattosio monoidrato	Thermo Fischer Scientific	18-600-440
Provette per microcentrifuga ambrate da 1,5 mL	Thermo Fischer Scientific	22431021
Persolfato di ammonio (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Solfato di ammonio ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Attune NxT Citometro a flusso	Thermo Fischer Scientific	A24861
Attune 1x Fluido di focalizzazione	Thermo Fischer Scientific	A24904
Attune Soluzione di spegnimento	Thermo Fischer Scientific	A24975
Perline di monitoraggio delle prestazioni Attune	Thermo Fischer Scientific	4449754
Attune Soluzione di lavaggio	Thermo Fischer Scientific	J24974
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126
Carbenicillina sale disodico	Sigma-Aldrich	C3416
Cloro candeggina	Amazon	B07J6FJR8D
Corning Costar Piastra a 96 pozzetti	Daigger Scientific	EF86610A
Provette per coltura, 12 mm x 75 mm, 5 mL con tappo a doppia posizione Globe	Scientific	05-402-31
DFHBI	Sigma-Aldrich	SML1627
DFHBI-1T	Sigma-Aldrich	SML2697
D-Glucosio (anidro)	Acros Organics	AC410955000
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Colorante caricatore DNA	New England Biolabs	B7025S
DNA LoBind Tubes (2,0 mL)	Eppendorf	22431048
dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S
EDTA, pH 8,0	Gibco, Life Technologies	AM9260G
Etanolo (EtOH)	Sigma-Aldrich	E7023
Puntali per micropipettor con puntale filtrante	Thermo Fischer Scientific	AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
Software FlowJo	Biosciences	N/A	Software FlowJo v10
Lettore di piastre fluorescenti con controllo del riscaldamento	VWR	10014-924
Alimentatore per elettroforesi su gel	Thermo Fischer Scientific	EC3000XL2
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516
Glicogeno AM95010	Thermo Fischer Scientific	AM95010
GraphPad Prism	Dotmatics Software di	N/A	da Academic Group License
Blocco termico	Thomas Scientific	1159Z11
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Pirofosfatasi inorganica	Sigma-Aldrich	I1643-500UN
Scala del DNA a basso peso molecolare	New England Biolabs	N3233L	Fornito con fiala gratuita di colorante per il caricamento del gel, viola (6x), senza SDS (NEB #B7025).
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Solfato di magnesio (MgSO4)	Fisher Scientific	MFCD00011110
Provette per microcentrifuga (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Microcentrifuga con controllo della temperatura	Marshall Scientific	EP-5415R
Puntali per micropipettatori	Gilson	FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Puntali per micropipettor	Sigma-Aldrich	Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Filtro per l'acqua Millipore con unità BioPak	Sigma-Aldrich	CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Puntali per pipette per micropipettor stretti	DOT Scientific	RN005R-LRS
PBS, 10x	Thermo Fischer Kit di pulizia per	Scientific BP39920
Primer e modelli per PCR
per provette PCR a parete sottile	Bio-Rad	1851148
Termociclatore per PCR per provette da 0,5 mL	Techne	5PRIME/C
		Plasmide #79783
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	M0530L	New England Biolabs	viene fornito con 5 tamponi Phusion HF, 5 tamponi Phusion GC e soluzioni MgCl2 e DMSO.
Pettine per elettroforesi su gel di poliacrilammide, C.B.S. Scientific	C.B.S. Scientific	VGC-1508
Apparecchiature per elettroforesi su gel di poliacrilammide	C.B.S. Scientific	ASG-250
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5655
Lamette da barba	Genesee Scientific	38-101
rNTP: ATP, CTP, GTP, UTP	New England Biolabs	N0450L
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Sorgente di luce UV a onde corte	Thermo Fischer Scientific	11758221
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795
Sodio cloruro (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Sodio fosfato bibasico, anidro	Thermo Fischer Scientific	S375-500
SoftMax Pro	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.5.1 (software per la lettura di piastre) ottenuto tramite Academic Group
License Unità filtranti sterili	Thermo Fischer Scientific	09-741-88
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
SYBR Colorazione sicura per gel DNA	Thermo Fischer Scientific	S33102
TAE tampone per elettroforesi su gel di agarosio	Thermo Fischer Scientific	AM9869
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Triptone (granulato)	Thermo Fischer Scientific	M0251S
T7 RNA polimerasi	New England Biolabs	M0251S
Urea-PAGE Sistema di gel	National Diagnostics	EC-833
Piastra TLC fluorescente UV	Sigma-Aldrich	1.05789.0001
Spettrofotometro UV/Vis	Thermo Fischer Scientific	ND-8000-GL
Miscelatore a vortice	Thermo Fischer Scientific	2215415
Xilene cianolo	Sigma-Aldrich	X4126
Estratto di lievito (granulato)	Thermo Fischer Scientific	BP9727-2