Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Aishwarya Swaminathan; Yung Hwang; Ashley Winward; Merav Socolovsky

doi:10.3791/64373

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Articolo metodologico

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

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DOI:

10.3791/64373

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4 novembre 2022

Aishwarya Swaminathan¹ , Yung Hwang¹ , Ashley Winward¹ , Merav Socolovsky¹

¹Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Abstract

I primi progenitori eritroidi sono stati originariamente definiti dal loro potenziale di formazione di colonie in vitro e classificati in "unità" che formano scoppi e colonie note come BFU-e e CFU-e. Fino a poco tempo fa, non erano disponibili metodi per l'isolamento diretto prospettico e completo di progenitori puri di BFU-e e CFU-e da midollo osseo di topo adulto appena isolato. Per colmare questa lacuna, è stato analizzato un set di dati RNA-seq (scRNAseq) a singola cellula del midollo osseo di topo per l'espressione di geni che codificano per i marcatori di superficie cellulare. Questa analisi è stata combinata con saggi sul destino cellulare, consentendo lo sviluppo di un nuovo approccio citometrico a flusso che identifica e consente l'isolamento di sottogruppi completi e puri di progenitori BFU-e e CFU-e nel midollo osseo o nella milza di topo. Questo approccio identifica anche altri sottoinsiemi progenitori, inclusi sottoinsiemi arricchiti per potenziali basofili/mastociti e megacariociti. Il metodo consiste nell'etichettare le cellule fresche del midollo osseo o della milza con anticorpi diretti a Kit e CD55. I progenitori che esprimono entrambi questi marcatori sono quindi suddivisi in cinque popolazioni principali. La popolazione 1 (P1 o CFU-e, Kit+ CD55⁺ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) contiene tutti i progenitori CFU-e e può essere ulteriormente suddivisa in P1-low (CD71^med CD150^high) e P1-hi (CD71 ^highCD150^low), corrispondenti rispettivamente a CFU-e precoce e tardiva; La popolazione 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55⁺ CD49f med/low CD105 ^med/high CD71^lowCD150^high) contiene tutti i progenitori della BFU-e; La popolazione P3 (P3, Kit+ CD55⁺ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41^low) è arricchita per i progenitori basofili^/mastociti; La popolazione 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105^med/lowCD150^highCD41⁺) è arricchita per i progenitori megacariociti; e la popolazione 5 (P5, Kit+ CD55⁺ CD49f med/high CD105 med/^lowCD150^highCD41^-) contiene progenitori con potenziale eritroide, basofilo/mastocitario e megacariocitico (EBMP) e progenitori multipotenziali (MPP) eritroidi/megacariocitici^/basofili. Questo nuovo approccio consente una maggiore precisione nell'analisi dell'eritroide e di altri progenitori ematopoietici e consente anche di fare riferimento alle informazioni sul trascrittoma per ogni popolazione a flusso definita citometricamente.

Introduzione

L'eritropoiesi può essere suddivisa in due fasi principali: eritropoiesi precoce e differenziazione eritroide terminale (Figura 1)^1,2,3. Nell'eritropoiesi precoce, le cellule staminali ematopoietiche si impegnano nella linea eritroide e danno origine ai primi progenitori eritroidi, che sono stati identificati per la prima volta nel 1970 sulla base del loro potenziale di formazione di colonie in mezzo semi-solido 4,5,6,7,8,9 ^<....