Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Abstract

Il sistema CRISPR / Cas9 ha reso possibile lo sviluppo di topi geneticamente modificati mediante editing diretto del genoma utilizzando zigoti fecondati. Tuttavia, sebbene l'efficienza nello sviluppo di topi knockout genici inducendo piccole mutazioni indel sarebbe sufficiente, l'efficienza dell'editing del genoma embrionale per effettuare knock-in del DNA (KI) di grandi dimensioni è ancora bassa. Pertanto, a differenza del metodo KI diretto negli embrioni, il targeting genico utilizzando cellule staminali embrionali (ESC) seguito da iniezione di embrioni per sviluppare topi chimera presenta ancora diversi vantaggi (ad esempio, il targeting ad alto rendimento in vitro, la manipolazione multi-allelica e la manipolazione genica Cre e flox possono essere eseguite in un breve periodo). Inoltre, ceppi con embrioni difficili da gestire in vitro, come BALB/c, possono essere utilizzati anche per il targeting ESC. Questo protocollo descrive il metodo ottimizzato per KI di DNA di grandi dimensioni (diversi kb) nelle ESC applicando l'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 seguito dalla produzione di topi chimera per sviluppare modelli murini manipolati dai geni.

Introduzione

La produzione di topi geneticamente modificati e l'analisi del loro fenotipo ci consente di comprendere in dettaglio specifiche funzioni geniche, in vivo. Numerosi risultati importanti sono stati scoperti utilizzando modelli animali geneticamente modificati nel campo delle scienze della vita. Inoltre, dopo il rapporto sulla tecnologia di modifica del genoma che utilizza CRISPR / Cas9¹, la ricerca che utilizza topi geneticamente modificati si è rapidamente diffusa in molti laboratori ^2,3. L'editing del genoma degli zigoti di topo mediante CRISPR / Cas9 ha raggiunto un'efficienza accettabile per lo sviluppo di brevi modificazioni del DNA, come il^knockout genico 4 orientato alla mutazione indel, la sostituzione di singoli nucleotidi o l'inserimento di brevi peptide-tag utilizzando oligonucleotidi a singolo filamento (ssODN) come donatori knock-in (KI)⁵. D'altra parte, il KI di grandi frammenti di DNA in zigoti mediante editing del genoma rimane a bassa efficienza rispetto alla modifica del DNA di piccole dimensioni ^6,7. Inoltre, è difficile utilizzare ceppi murini come BALB/c, che è un ceppo importante per specifiche aree di ricerca come l'immunologia, per l'editing del genoma basato sullo zigote perché i loro embrioni preimpianto sono suscettibili alla manipolazione in vitro.

Un altro modo per sviluppare modelli murini geneticamente modificati è quello di utilizzare la tecnica di targeting delle cellule staminali embrionali (ESC) seguita dall'iniezione di ESC nell'embrione preimpianto per produrre chimere 8,9,10^, che è ancora abitualmente utilizzata come metodo convenzionale. Sebbene il tasso di acquisizione per ottenere cloni accurati di KI-ESC non sia molto elevato nei metodi di targeting ESC convenzionali, il targeting ESC offre alcuni vantaggi rispetto all'editing del genoma dello zigote, specialmente per il KI del DNA lungo. Ad esempio, l'efficienza KI di lunghi frammenti di DNA (> diversi kb) nel genoma dello zigote è meno evidente^6,7, e molti zigoti sono necessari per sviluppare anche una sola linea di topo KI^, che è indesiderabile nell'attuale prospettiva degli esperimenti sugli animali. A differenza dell'editing del genoma dello zigote, il lungo targeting del DNA alle ESC seguito dalla produzione di chimere richiede un numero significativamente inferiore di embrioni rispetto all'editing del genoma dello zigote. Inoltre, anche se gli embrioni preimpianto di BALB/c sono suscettibili di manipolazione in vitro, le loro ESC possono essere mantenute e gestite in vitro 11 come altre ESC di fondo ^{129 o F1} competenti, quindi applicabili per le produzioni di chimera. Tuttavia, anche se un vettore di targeting contiene 5' e 3' bracci omologhi e cassette geniche di resistenza ai farmaci per la selezione positiva o negativa, l'efficienza KI convenzionale delle ESC è generalmente insufficiente, a causa dell'alta frequenza di integrazione genomica casuale ^8,10, Pertanto, è necessario un metodo migliorato con una precisa efficienza di targeting ESC. Recentemente, abbiamo riportato un metodo KI ESC ottimizzato utilizzando l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 per ottenere una maggiore efficienza KI rispetto ai metodi di targeting convenzionali¹¹. Il metodo che descriviamo qui si basa su questa procedura che consente di ridurre il DNA (>da diversi a 10 kb) KI a ESC con efficienza accettabile per lavori di routine senza selezione di farmaci; Pertanto, la procedura di costruzione del vettore sarebbe molto più semplice e richiederebbe un periodo più breve, o anche il periodo di coltura cellulare diventerebbe significativamente più breve.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Tokyo (numero di approvazione PA17-63) e dell'Università di Osaka (numero di approvazione Biken-AP-H30-01) ed eseguiti secondo le loro linee guida e le linee guida ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

1. Targeting della costruzione vettoriale

1. Amplificare una cassetta KI (CreERT qui, il DNA modello per la PCR è originario di una società commerciale di sintesi genica) e un frammento approssimativo di 1 kb di bracci di omologia 5' o 3' mediante PCR. Per il clonaggio del DNA (fase 1.3), aggiungere sequenze di sovrapposizione 15-mer all'estremità 5' di ciascun primer PCR. Purificare i frammenti di DNA PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio, seguita dall'estrazione del frammento di DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA.
2. Linearizzare il plasmide della spina dorsale (ad esempio, pUC19 o pBS) utilizzando un enzima di restrizione appropriato che digerisce in modo univoco da qualche parte nel sito multi-clonazione per la clonazione. Quindi, purificare il plasmide digerito utilizzando un kit di purificazione del DNA.
3. Clonare ogni frammento di PCR (ad esempio, braccio di omologia 5', braccio di omologia 3') e sequenza KI simultaneamente nel plasmide digerito utilizzando un kit di clonazione del DNA secondo le istruzioni del produttore.
4. Trasformare le cellule competenti utilizzando il plasmide costruito (fase 1.3) riscaldando a 42 °C per 1 minuto a bagnomaria, quindi seminarle su una piastra LB contenente la concentrazione appropriata di antibiotici come ampicillina o kanamicina. Coltivali durante la notte per selezioni clone resistenti.
5. Prelevare diverse (da quattro a otto) singole colonie utilizzando punte per pipette da 200 μL e trasferire le punte in 3 ml di LB liquido contenente antibiotici appropriati (100 μg/mL di ampicillina o 20 μL/mL di kanamicina) e coltura per una notte a 37 °C agitando.
6. Purificare il plasmide il giorno seguente utilizzando un kit di purificazione del plasmide commerciale privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore. Confermare la sequenza clonata nel plasmide mediante sequenziamento Sanger. Regolare la concentrazione del plasmide a 1 μg di DNA/μL utilizzando acqua priva di nucleasi. Utilizzare il plasmide come vettore di targeting genico.

2. Preparazione del fibroblasto embrionale di topo (MEF) come cellule feeder per ESC

1. Sacrificare topi femmina ICR incinta di 8-10 settimane (14,5 giorni dopo il coito) mediante lussazione cervicale. Pulire bene l'addome utilizzando etanolo al 70% (v / v) per la sterilizzazione, tagliare l'addome con forbici orbitali e pinze e recuperare l'utero contenente il feto.
2. Introdurre l'utero in un piatto da 100 mm contenente 10 ml di siero bovino fosfato (PBS) contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Rimuovere la placenta e i tessuti extraembrionali dai feti usando forbici orbitali e pinze. Tritare i feti usando le forbici orbitali e trasferire la soluzione PBS contenente le cellule fetali tritate in un tubo conico da 50 ml.
3. Centrifugare a 280 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante mediante aspirazione. Aggiungere 10 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% (p/v), mescolare bene mediante pipettaggio e quindi incubare per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria per la digestione della tripsina.
4. Aggiungere 20 mL di terreno MEF (DMEM contenente il 10% (v/v) siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) per arrestare la reazione enzimatica, mescolare bene per inversione delicata e centrifugare a 280 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante mediante aspirazione, aggiungere 10 ml di terreno MEF e mescolare bene mediante pipettaggio.
5. Seminare la sospensione cellulare in diversi nuovi piatti da 100 mm (preparare lo stesso numero di piatti del numero di feti con 10 ml di terreno MEF per un piatto da 100 mm). Cambiare il terreno da 4 a 5 ore dopo la semina per rimuovere le cellule non attaccate e lasciare crescere il MEF attaccato. Passare le cellule quando raggiungono ~ 80% di confluenza usando tripsina.
6. Porre le piastre di coltura contenenti il MEF proliferante in mezzo MEF, circa 12-15 giorni dopo la semina, in un dispositivo irradiante a raggi X. Esporre il MEF con una radiografia da 50 Gy (totale) per arrestare il ciclo cellulare secondo le istruzioni del produttore.
7. Tripsinizzare il MEF irradiato aggiungendo 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% per un piatto da 100 mm per 5 minuti a 37 °C, quindi aggiungere 4 mL di terreno MEF per interrompere la digestione della tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in una nuova provetta da 50 ml.
8. Lavare il MEF con un mezzo MEF fresco mediante centrifugazione a 280 x g per 5 minuti a 4 °C, contare il numero di cellule utilizzando un contatore di celle con colorazione blu tripano e congelarle a 1,6 x 10⁶ celle/tubo in un mezzo di congelamento cellulare. Conservare fino all'uso; Le cellule possono essere immagazzinate stabilmente in azoto liquido per diversi anni.

3. Preparazione della miscela Cas9-RNP-DNA

1. Sciogliere il tracrRNA e l'RNA crisprRNA nel tampone di diluizione (ogni concentrazione di RNA a 200 μM) mediante pipettaggio. Mescolare la soluzione di tracrRNA, la soluzione di crisprRNA e il tampone di diluizione (rapporto di volume a 2:2:5) picchiettando delicatamente e ricottura ogni RNA usando un termociclatore a 95 °C per 10 minuti seguito da cicli stepdown di 1 °C/min fino a quando la temperatura raggiunge i 4 °C.
   NOTA: La sequenza di gRNA è stata progettata utilizzando CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Incubare gli RNA ricotti, la nucleasi Cas9 da 10 μg/μL e il tampone di elettroporazione miscelati in un rapporto di volume di 5:3:2 a 37 °C per 20 minuti per formare il complesso Cas9-RNP. Nel lavoro di routine, mescolare e incubare 1,25 μL di RNA ricotto, 0,75 μL di nucleasi Cas9 e 0,5 μL del tampone di elettroporazione per l'editing del genoma di un locus.
3. Mescolare i seguenti materiali in una provetta da 1,5 ml: 10 μL di tampone per elettroporazione, 1 μL di complesso Cas9-RNP (fase 3.2) e 1 μL di vettore di targeting circolare (1 μg/μL, fase 1.6). La quantità totale di miscela Cas9-RNP-DNA è di 12 μL. Mantenere la miscela Cas9-RNP-DNA su ghiaccio fino all'elettroporazione.
   NOTA: Per prevenire la ri-scissione del gRNA dopo KI, progettare il gRNA in una posizione in cui la sequenza di riconoscimento del gRNA è divisa dall'integrazione del donatore KI. Se il gRNA non può essere progettato in tale posizione, diverse mutazioni nucleotidiche silenti, mediante le quali la sequenza amminoacidica non cambia, sono incluse nel plasmide del donatore KI.

4. Targeting genico delle ESC

1. Per preparare le piastre di coltura cellulare rivestite di gelatina, aggiungere una soluzione di gelatina allo 0,1% (p/v) a 2 ml per un piatto da 60 mm, 500 μL per una piastra da 24 pozzetti, 100 μL per una piastra da 96 pozzetti e incubare per 2 ore in un incubatore umido. Rimuovere la soluzione di gelatina, lavare due volte con la stessa quantità di PBS e conservare a temperatura ambiente fino all'uso.
2. Scongelare il materiale MEF congelato mitoticamente inattivato (fase 2.2) utilizzando un bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e posizionare il MEF su un piatto da 60 mm rivestito di gelatina (un tubo congelato di MEF contenente 1,6 x 10⁶ celle per due piatti da 60 mm, fase 2.2) 1 giorno prima della semina ESC.
3. Scongelare una provetta ESC congelata (conservata a 2 x 10 5 ESC/tubo; il conteggio delle cellule è stato effettuato utilizzando un contatore di celle) utilizzando un bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e posizionare 1 x 10⁵ ESC su un piatto da 60 mm contenente MEF preseminato (fase 4.1).
4. Coltura in terreno di coltura ESC da 4 mL (ESCM, terreno modificato a base di DMEM con siero fetale bovino al 15% (v/v), substrato di L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/mL, streptomicina da 100 μg/ml, 0,1 mM di 2-mercaptoetanolo, fattore inibitorio della leucemia e t2i (0,2 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021) che mantiene la pluripotenza dell'ESC¹¹) a 37 °C con CO₂ al 5% fino a quando l'ESC raggiunge il 50-70% di confluenza.
   NOTA: Utilizziamo tre diverse linee di ESC: JM8. A3 da B6N, V6.5 da B6-129 F1 e BALB/c ESC sviluppato internamente. Gli stessi protocolli KI in questo manoscritto sono usati per tutte le linee ESC.
5. Lavare l'ESC colturale con 4 ml di PBS, quindi trattare con 800 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C per la digestione. Aggiungere 1 mL di ESCM per inattivare la tripsina e dissociare le ESC in singole cellule mediante pipettaggio.
6. Centrifugare la soluzione contenente ESC per 5 minuti a 280 x g, eliminare il surnatante, risospendere le ESC in 1 mL fresco di ESCM e contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule con colorazione blu tripano. Trasferire 1 x 10 5 ESC in una nuova provetta da^1,5 mL e lavarle tre volte con PBS mediante centrifugazione a 500 x g, 4 °C.
7. Risospendere il pellet ESC in 12 μL di miscela Cas9-RNP-DNA (fase 3.3) e mescolare bene mediante pipettaggio delicato per evitare il gorgogliamento. Servire l'ESC risospeso per l'elettroporazione. Il sistema di elettroporazione utilizza un singolo impulso a 1.400 V e 30 ms per la trasduzione Cas9-RNP-DNA (Figura 1).
8. Coltura delle ESC elettroporate in un piatto da 60 mm contenente 4 ml di ESCM con MEF inattivato mitoticamente (paragrafo 4.2). Cambia il mezzo ogni giorno.
9. Lavare le ESC con 4 mL di PBS da 3 a 5 giorni dopo l'elettroporazione, quindi trattare con 800 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% e coltivare a 37 °C per 5 minuti in un incubatore umido per la digestione. Aggiungere 2 ml di ESCM per interrompere la digestione della tripsina e centrifugare la miscela cellulare a 280 x g per 5 minuti.
10. Scartare il surnatante, risospendere le ESC in 1 mL di ESCM fresco e contare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare con colorazione blu tripano. Far passare gli ESC a 1 x 10³ ESC per piatto da 60 mm contenente ESCM e MEF alimentatore. Cambia il mezzo ogni giorno fino a quando la colonia non riprende.
    NOTA: Il motivo per cui l'ESC viene superato una volta prima del prelievo è che l'editing del genoma può continuare a verificarsi dopo la divisione ESC, quindi la prima colonia non è sempre il clone in molti casi. Pertanto, il primo passaggio dell'ESC prima del prelievo della colonia è un passo essenziale per raccogliere singoli cloni.

5. Genotipizzazione PCR di ESC mirate

1. Aspirare ESCM dal piatto di coltura ESC da 5 a 7 giorni dopo il primo passaggio (fase 4.9) e aggiungere 4 ml di PBS. Prelevare singole colonie ESC con 5 μL di PBS utilizzando una pipetta da 20 μL sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento da 30x a 40x). Porre le singole colonie in un pozzetto di una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti contenente 15 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%.
2. Tenere la piastra da 96 pozzetti sul ghiaccio fino a quando non vengono raccolte 48 singole colonie. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti in un incubatore umido al 5% di CO₂ a 37 °C, quindi aggiungere 80 μL di ESCM per interrompere la digestione della tripsina e dissociare le colonie di ESC in singole cellule mediante pipettaggio.
   NOTA: Poiché l'efficienza KI di questo metodo è di solito del 10% -50%, raccogliamo regolarmente 48 cloni e prima eseguiamo la genotipizzazione utilizzandone 24. Se non è possibile ottenere più cloni KI a questo punto, esaminiamo ulteriormente KI utilizzando i restanti 24 cloni.
3. Trasferire 40 μL di sospensione ESC (fase 5) in una piastra a 96 pozzetti priva di gelatina contenente 50 μL di ESCM per pozzetto per genotipizzazione PCR. Trasferire i restanti 60 μL di sospensione ESC in un pozzetto in una piastra da 24 pozzetti rivestita di gelatina, che contiene 500 μL di ESCM e MEF di alimentazione, per ottenere lo stock ESC congelato.
4. Immagazzinare i singoli cloni ESC coltivati nella piastra a 24 pozzetti (fase 5.3) fino a raggiungere il 60-80% di confluenza. Recuperare singoli cloni ESC mediante tripsinizzazione come menzionato sopra, raccogliere le cellule in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 280 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 500 μL di mezzo di congelamento cellulare e congelarle utilizzando un congelatore profondo a -80 °C.
5. Per la genotipizzazione PCR, l'ESC in coltura clona nella piastra priva di alimentatore a 96 pozzetti (fase 5.3) fino a quando l'ESC raggiunge una confluenza superiore al 90%. Rimuovere l'ESCM da ciascun pozzetto mediante aspirazione e lavare due volte con 100 μL di PBS.
6. Aspirare il PBS e aggiungere 100 μL di tampone di lisi contenente proteinasi K, mescolare bene e trasferire il lisato ESC in un nuovo tubo da 1,5 ml. Riscaldare il lisato ESC a 65 °C per almeno 1 ora utilizzando una camera termica. Estrarre e purificare il DNA genomico utilizzando un metodo convenzionale di purificazione del DNA fenolo-cloroformio seguito dalla precipitazione dell'etanolo.
7. Sciogliere il DNA precipitato in 20 μL di acqua priva di DNasi e determinare la purezza e la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Eseguire la PCR genomica utilizzando set di primer specifici per il locus per amplificare la regione target. Quindi, controlla la sequenza e scegli i cloni ESC con le sequenze KI desiderate.

6. Preparazione dell'embrione allo stadio di otto cellule e microiniezione di ESC

1. Iniettare 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) per via intraperitoneale in femmine adulte di ICR. Dopo 48 ore, iniettare 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) nelle stesse femmine, quindi accoppiare le femmine trattate con ormoni con i maschi ICR. Controllare il tappo copulatore nella vagina il giorno seguente (giorno embrionale 0,5, ED0,5).
   NOTA: Per valutare il chimerismo in base ai rapporti di colore del mantello, utilizzare la blastocisti del ceppo ICR come destinatario per un ESC che ha uno sfondo nero o agouti del colore del mantello, o la blastocisti del ceppo C57BL / 6 come destinatario per un ESC che ha lo sfondo albino.
2. Raccogliere l'ovidotto a ED1.5 e posizionarlo in gocce di mezzo tamponato HEPES (FHM). Recuperare gli embrioni a due o quattro cellule lavando l'ovidotto con FHM usando un ago di lavaggio inserito nell'infundibulum.
3. Lavare gli embrioni raccolti spostandoli in diverse gocce fresche di FHM usando una pipetta orale. Coltura gli embrioni in 50 μL di KSOM cadono su una capsula di coltura cellulare di 35 mm coperta con olio minerale a 37 °C, incubatore al 5% di CO₂ per 1 giorno fino al raggiungimento dello stadio di otto cellule o morula (ED2.5).
4. Se gli embrioni non vengono utilizzati il giorno successivo della raccolta, congelarli mediante vitrificazione secondo il protocollo CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) e conservarli in azoto liquido fino all'uso.
5. Preparare pipette di vetro per contenere gli embrioni (diametro esterno 80-100 μm) e iniezione ESC (diametro circa 13 μm) utilizzando un estrattore e una microforgiatura.
6. Integrare una pipetta di contenimento contenente FHM in un supporto capillare collegato a un microiniettore e posizionato sul lato sinistro del micromanipolatore. Collegare una pipetta di iniezione a un altro microiniettore e posizionarla sul lato destro. Allineare le due pipette dritte nel campo visivo del microscopio.
7. Erogare 5 μL di gocce di polivinilpirrolidone (PVP) al 12% (p/v) in mezzo FHM e 5 μL di gocce di FHM sullo stesso coperchio di una capsula da 60 mm affiancate e coprire le gocce con olio minerale. Trasferire gli embrioni nella goccia di 5 μL di FHM e aggiungere 1-5 μL della sospensione ESC alla goccia di FHM che contiene embrioni.
   NOTA: Lasciare la sospensione ESC e MEF per 30 minuti nel piatto di coltura da 4 mL ESM su un piatto di coltura da 60 mm prima della preparazione della goccia. Poiché i MEF si attaccano al fondo più velocemente degli ESC, questa incubazione di 30 minuti consente la concentrazione di cellule ES non attaccate nel surnatante.
8. Lavare all'interno della pipetta di iniezione con PVP, quindi passare alla goccia contenente gli embrioni e le ESC.
9. Prelevare tre doppiette ECS individuali che hanno appena terminato la loro divisione cellulare (sei celle) nella pipetta di iniezione. Tenere un embrione a otto cellule o allo stadio di morula, che ha completato la compattazione, con la pipetta di mantenimento per aspirazione. Fare un buco nella zona pellucida con un impulso piezoelettrico (intensità: 3; velocità: 3). Espellere l'ESC a sei cellule all'interno della zona pellucida ed estrarre la pipetta dagli embrioni.
10. Lavare delicatamente gli embrioni iniettati con ESC con diverse gocce di KSOM utilizzando una pipetta orale e incubarli in una nuova goccia di KSOM da 50 μL coperta di olio minerale a 37 °C, 5% di CO₂ fino a quando gli embrioni non si sviluppano fino allo stadio di blastocisti.
11. Trasferire le 10 blastocisti iniettate ESC in ciascun corno uterino di topi femmina pseudogravidi (2,5 giorni dopo il coito, 20 blastocisti per capo).
12. Dopo che la madre surrogata ha partorito, selezionare almeno due chimere maschili con il più alto rapporto di chimerismo (70% o superiore come confermato dal colore del mantello), e quindi accoppiarli con femmine di ceppo appropriato per ottenere KI eterozigote F1.
13. Allevare singoli topi KI con partner appropriati per ottenere topi con genotipi desiderabili o background genetici adatti alla ricerca.

Risultati

Abbiamo preso di mira specifici geni nell'ESC seguiti dalla produzione di chimere per sviluppare la produzione di topi manipolati geneticamente secondo il nostro precedente manoscritto¹¹. La genotipizzazione delle ESC (descritta nel paragrafo 4) viene eseguita di routine mediante PCR utilizzando primer. I primer sono progettati su sequenze genomiche al di fuori dei bracci di omologia e le sequenze specifiche nel frammento di DNA KI (Figura 2A). In tal caso, nessun allele wild-type viene amplificato, mentre un amplicone PCR di una dimensione specifica viene rilevato solo quando il DNA esogeno bersaglio è KI nel locus bersaglio. I risultati rappresentativi della PCR genotipizzata sono mostrati nella Figura 2B. Nove cloni su 22 (40,9%) hanno mostrato una banda specifica per KI in questo caso. Tre risultati di targeting rappresentativi, incluso il risultato mostrato nella Figura 2, sono mostrati nella Tabella 1. Questi risultati indicano che il metodo mostrato qui è efficiente e riproducibile per il gene KI senza alcuna selezione di farmaci.

L'ESC viene prelevato in una pipetta per iniezione, quindi viene praticato un foro nella zona pellucida utilizzando un plus piezoelettrico e l'ESC viene rilasciato tra le cellule embrionali (Figura 3). Tecnicamente, questo protocollo per iniettare un ESC in un embrione a otto cellule o allo stadio di morula è simile al protocollo per l'iniezione di ESC in una blastocisti comunemente usato in molte strutture per topi. I topi chimerici rappresentativi sono mostrati nella Figura 4. Per la valutazione del colore del mantello del chimerismo, l'embrione del ceppo ICR (albino, capelli bianchi) è stato utilizzato come ricevente di ESC B6 o B6-129 F1 e gli embrioni B6 sono stati utilizzati come riceventi di ESC BALB / c (Figura 4).

Figura 1: Uno schema dell'integrazione plasmidica circolare mediata dalla ribonucleoproteina (RNP) CRISPR/Cas9 nel locus specifico di un genoma ESC. L'elettroporazione introduce un plasmide circolare come vettore di targeting nelle ESC con Cas9-RNP. Abbreviazioni: GOI = gene di interesse, HA = braccio di omologia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Analisi della PCR genomica per lo screening KI di cloni ESC mirati. (A) I primer PCR specifici per KI sono progettati su sequenze genomiche al di fuori dei bracci di omologia (avanti) e nelle sequenze specifiche nel frammento di DNA KI (retro). (B) Risultati rappresentativi della PCR genotipica. Un genoma wild-type è stato usato come controllo negativo. Abbreviazioni: GOI = gene di interesse, HA = braccio di omologia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative dell'iniezione embrionale in stadio a otto cellule. (A) Per la microiniezione, vengono prelevati tre doppietti di ESC (sei cellule, punte di freccia). (B) Un foro nella zona pellucida è fatto con un impulso piezoelettrico, e le ESC vengono espulse tra ogni blastomerio. La barra della scala mostrata è 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative di topi chimera . (A,B) L'ESC derivato da C57BL/6N (JM8. A3, Agouti capelli; A) o B6-129 F1 (capelli Agouti; B) vengono iniettati in embrioni ICR (albini, capelli bianchi), seguiti dal trasferimento degli embrioni ai surrogati della madre. (C) L'ESC derivato da BALB/c (albino, capelli bianchi) viene iniettato in embrioni C57BL/6J (capelli neri), seguito dal trasferimento degli embrioni a surrogati della madre. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

ID progetto	Coromosoma	Lunghezza 5'HA (bp)	Lunghezza 3'HA (bp)	Dimensioni inserto (bp)	Numero di cloni analizzati	Numero di cloni di KI	Efficienza (%)	Osservazioni
R26-CC*	Chr6	965	1006	5321	23	2	8.7%	-
R4-03*	Chr8	1000	997	3070	22	6	27.3%	-
P4-01*	Chr15	1000	1000	2569	22	9	40.9%	Mostrato nella Figura 2

Tabella 1: Efficienze KI in tre loci genomici indipendenti nell'ESC. *Questi progetti non sono stati pubblicati finora. Il nome di questi geni sarà divulgato in manoscritti indipendenti in futuro.

Discussione

Il targeting genico delle ESC seguito dalla produzione di chimere è stato convenzionalmente utilizzato per lo sviluppo di topi manipolati geneticamente. Tuttavia, l'efficienza del gene knock-in rimane bassa anche se il vettore bersaglio contiene lunghi (> diversi kb nel solito) bracci di omologia con cassette geniche di selezione dei farmaci positive o negative. Il nostro protocollo ha introdotto un metodo ESC KI sintonizzato di DNA esogeno lungo utilizzando un plasmide circolare senza cassette di selezione dei farmaci come vettore di targeting accompagnato da editing del genoma mediato da Cas9-RNP con un'efficienza accettabile per i lavori di routine. Pertanto, questo protocollo potrebbe aiutare a ridurre sostanzialmente la quantità di tempo necessaria per produrre topi chimerici geneticamente modificati rispetto al targeting ESC convenzionale.

In questo protocollo, abbiamo usato CRISPR / Cas9-RNP per indurre rotture a doppio filamento sito-specifiche nel genoma, e un plasmide circolare è stato usato come vettore di targeting invece di uno linearizzato. I plasmidi linearizzati sono convenzionalmente usati come vettore bersaglio per il gene KI a causa della loro maggiore efficienza di integrazione genomica ^8,9,10. Tuttavia, molte integrazioni genomiche non sono specifiche anche se il vettore contiene bracci omologhi⁹. D'altra parte, i plasmidi circolari sono raramente usati come vettori bersaglio a causa della loro caratteristica difficile da integrare nel genoma delle ESC¹² o dei fibroblasti¹³. Pertanto, sarebbe possibile che l'applicazione di un plasmide circolare come vettore di targeting accompagnato dall'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 minimizzi l'integrazione casuale non specifica ma massimizzi l'integrazione sito-specifica nel genoma ESC. Sarebbe da notare che l'efficienza di induzione della rottura del doppio filamento da parte di CRISPR / Cas9 è abbastanza importante¹⁴, quindi sarebbe essenziale usare gRNA che induce una rottura del doppio filamento ad alta efficienza. Dovrebbe essere considerato di riprogettare il gRNA quando l'efficienza KI è troppo bassa. Nel caso mostrato nella figura 2, il 40,9% dei cloni ESC mostrava una banda specifica per KI. Infatti, come laboratorio principale dell'istituto, eseguiamo abitualmente il targeting genico utilizzando ESC con il metodo qui descritto e abbiamo raggiunto efficienze KI del 10% -50% per sequenze di 1-2 kb come Cre, CreERT o reporter fluorescenti, sebbene ci siano alcune variazioni a seconda del locus genico. Le sequenze di DNA più lunghe che abbiamo eseguito con successo con questo metodo sono circa 11,2 kb nel locus Rosa26 e l'efficienza è stata del 12,2% (cinque colonie KI su 41 colonie analizzate).

Sarebbe anche da notare che questo protocollo utilizza embrioni a otto cellule o allo stadio di morula come destinatari per la microiniezione di ESC, ma non embrioni allo stadio di blastocisti. Sebbene non abbiamo condotto esperimenti comparativi in questo articolo, diversi rapporti hanno dimostrato che l'iniezione di ESC in embrioni a otto cellule o allo stadio di morula migliora significativamente l'efficienza del contributo ESC alla prole chimerica rispetto all'iniezione di ESC nelle blastocisti^15,16,17,18 . In effetti, le iniezioni di ESC di varie linee ESC, tra cui C57BL / 6, B6-129 F1 e BALB / c, hanno comunemente portato allo sviluppo di chimere di colore ad alto strato in alcune, ma non tutte, prole (vedi Figura 4). Il limite del metodo è che le ESC iniettate nell'embrione preimpianto non potevano sempre contribuire alle cellule germinali in una chimera^19,20. La trasmissione germinale delle ESC dipenderebbe dalla qualità di ciascun clone di ESC¹⁹. Pertanto, sarebbe vantaggioso sviluppare più linee di cloni ESC come backup per la produzione stabile di topi chimerici. In conclusione, i protocolli qui presentati utilizzano semplici vettori di targeting che includono solo ogni braccio omologico e gene di interesse per KI senza alcuna cassetta resistente ai farmaci. Pertanto, la costruzione del vettore sarebbe molto più semplice e il periodo di coltura potrebbe essere abbreviato rispetto alla tecnica di targeting ESC convenzionale. Ciò aiuterebbe a produrre rapidamente e facilitando vari tipi di topi geneticamente modificati per future analisi nelle scienze della vita.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BALB/c ESC	-		ESC sviluppato dal ceppo BALB/c
Bambanker	Nippon Genetics	CS-02-001	Terreno di congelamento cellulare. Sezione 2.6 e altrove
Cas9 Nucleasi V3	IDT	1081059	Sezione 3.2 e altrove.
CHIR99021	FUJIFILM Wako	038-23101	Sezione 4.3
Frammento genico CreERT	GeneWiz		Sezione 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA	IDT		crisprRNA. Sezione 3.1 e altrove.
CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072534	tracrRNA. Sezione 3.1 e altrove.
DMEM	Nacalai	08458-45	MEF medio. Sezione 2.3 e altrove
Tampone duplex	IDT	1072534	tampone di diluizione dell'RNA. Sezione 3.1 e altrove.
Kit di estrazione FastGene Gel/PCR	Nippon Genetics	FG-91302	Sezione 1.1 e 1.2.
GlutaMax	Thermo Fisher	35-050-061	Substrato L-glutatime
hCG	ASKA Salute		Sezione 6.1.
Kit di clonazione In-Fusion HD	Clontech	639648	kit di clonazione del DNA. Sezione 1.3 e altrove
JM8. A3 ESC	EuMMCR-ESC		sviluppato dal ceppo C57BL/6N
Knock-out DMEM	Thermo Fisher	10829018	Sezione 4.3 e altrove, terreno commerciale modificato basato su DMEM.
KSOM	Merck	MR-121-D	Sezione 6.3 e 6.9.
Fattore inibitorio della leucemia	FUJIFILM Wako	125-05603	Sezione 4.3. Il fornitore non fornisce dati sulla concentrazione unitaria. Utilizzata una diluizione di 1.000 volte in questo protocollo.
Sistema di elettroporazione al neon	Thermo Fisher MPK5000		Sezione 3.2, 4.5 e altrove. Il sistema contiene un tampone di elettroporazione utilizzato anche nella sezione 3.2.
Takara	U0490B	di trasfezione del plasmide NucleoSpin	Sezione 1.6.
PD0325901	FUJIFILM Wako	162-25291	Sezione 4.3
PMSG	ASKA Salute		Sezione 6.1.
Tampone di lisi di coda	Nacalai	06169-95	Sezione 5.5.
Tripsina-EDTA	Nacalai	32777-15	Sezione 2.2 e altrove
V6.5 ESC	-		Ceppo B6J-129 F1
	Hitachi	MBR-1618R-BE	Sezione 2.6.