Una tecnica ad alto rendimento basata sulla citometria a flusso per lo screening di farmaci inibitori delle integrine

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 sui neutrofili umani.

Abstract

Questo protocollo mira a stabilire un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina β2, utilizzando anticorpi conformazionali che segnalano cambiamenti e citometria a flusso ad alto rendimento. Il metodo può anche fungere da guida per altri metodi di screening ad alto rendimento basati su anticorpi. Le integrine β2 sono molecole di adesione specifiche per i leucociti che sono cruciali nelle risposte immunitarie. I neutrofili si affidano all'attivazione delle integrine per uscire dal flusso sanguigno, non solo per combattere le infezioni, ma anche per essere coinvolti in molteplici malattie infiammatorie. Il controllo dell'attivazione dell'integrina β2 rappresenta un approccio praticabile per il trattamento delle malattie infiammatorie associate ai neutrofili. In questo protocollo, un anticorpo monoclonale, mAb24, che si lega specificamente al copricapo ad alta affinità delle integrine β2, viene utilizzato per quantificare l'attivazione dell'integrina β2 su neutrofili umani primari isolati. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) viene utilizzata come stimolo per attivare le integrine β2 dei neutrofili. In questo studio è stato utilizzato un citometro a flusso ad alto rendimento in grado di eseguire automaticamente campioni di piastre a 384 pozzetti. Gli effetti di 320 sostanze chimiche sull'inibizione dell'integrina β2 sono valutati entro 3 ore. Attraverso questo approccio è possibile identificare le molecole che prendono di mira direttamente le integrine β2 o le molecole bersaglio nella via di segnalazione di attivazione inside-out dell'integrina avviata dal recettore accoppiato alla proteina G.

Introduction

Molte malattie infiammatorie sono caratterizzate dall'infiltrazione di neutrofili nel sito di gonfiore o lesione¹. Per infiltrarsi in questi tessuti, i neutrofili devono completare la cascata di reclutamento dei neutrofili, che comporta l'arresto dell'endotelio, lo stravaso attraverso la parete del vaso e il reclutamento nel tessuto². I neutrofili circolanti hanno bisogno dell'attivazione dell'integrina β2 per completare questa cascata, specialmente per la fase di arresto. Pertanto, i farmaci inibitori dell'integrina che riducono l'adesione, lo stravaso e il reclutamento dei neutrofili possono trattare efficacemente le malattie infiammatorie ^3,4.

Le integrine β2 sono già state prese di mira per le malattie infiammatorie. Efalizumab, un anticorpo monoclonale che ha come bersaglio diretto l'integrina αLβ2, è stato sviluppato per il trattamento della psoriasi⁵. Tuttavia, efalizumab è stato sospeso a causa del suo effetto collaterale letale: leucoencefalopatia multifocale progressiva derivante dalla riattivazione del virus JC ^6,7. Le nuove terapie antinfiammatorie a base di integrine dovrebbero prendere in considerazione il mantenimento delle funzioni anti-infezione dei leucociti per ridurre al minimo gli effetti collaterali. Gli effetti collaterali di efalizumab potrebbero essere dovuti alla circolazione prolungata di anticorpi monoclonali nel flusso sanguigno, che potrebbero inibire le funzioni immunitarie a lungo termine⁸. Uno studio recente mostra che efalizumab media la reticolazione di αLβ2 e l'internalizzazione indesiderata delle integrine α4, fornendo una spiegazione alternativa per gli effetti collaterali⁹. Pertanto, gli antagonisti di piccole molecole di breve durata potrebbero evitare questo problema.

Di seguito viene presentato un metodo ad alto rendimento per lo screening di antagonisti dell'integrina β2 a piccole molecole utilizzando neutrofili umani. L'attivazione dell'integrina β2 richiede cambiamenti conformazionali dell'ectodominio dell'integrina per ottenere l'accesso e aumentare la sua affinità di legame con il suo ligando. Nel modello canonico a serramanico, l'ectodominio integrinico piegato-chiuso si estende prima a una conformazione estesa-chiusa e poi apre il suo copricapo a una conformazione estesa-aperta completamente attivata^10,11,12,13. C'è anche un percorso alternativo che parte dal piegato-chiuso al piegato-aperto e all'esteso-aperto, infine 14,15,16,17,18,19. L'anticorpo conformazionale specifico mAb24 si lega a un epitopo nel dominio β2-I-like umano quando il copricapo dell'ectodominio è aperto^20,21,22,23.

In questo caso, mAb24-APC viene utilizzato per determinare se le integrine β2 sono attivate. Per attivare i neutrofili e l'integrina, la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un peptide chemiotattico corto di derivazione batterica in grado di attivare le integrine β2 dei neutrofili²⁴, viene utilizzato come stimolo in questo protocollo. Quando la fMLP si lega alla Fpr1 sui neutrofili, vengono attivate cascate di segnalazione a valle che coinvolgono le proteine G, la fosfolipasi Cβ e la fosfoinositide 3-chinasi γ. Questi eventi di segnalazione alla fine provocano l'attivazione dell'integrina attraverso la via di segnalazione inside-out^18,25. Oltre agli antagonisti di piccole molecole che si legano direttamente alle integrine β2 e prevengono i cambiamenti conformazionali dell'attivazione delle integrine²⁶, con questo metodo verrebbero rilevati anche composti che possono inibire i componenti nella via di segnalazione di attivazione dell'integrina β2 inside-out. I citometri a flusso automatizzati consentono uno screening ad alta produttività. L'identificazione di nuovi antagonisti può non solo approfondire la nostra comprensione della fisiologia delle integrine, ma anche fornire informazioni traslazionali sulla terapia antinfiammatoria a base di integrine.

Protocol

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani non identificati dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health, seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori. I criteri di inclusione/esclusione per questo studio sono stati accuratamente sviluppati per garantire l'idoneità dei partecipanti e per ridurre al minimo i rischi potenziali. I partecipanti idonei avevano un'età compresa tra i 18 e i 65 anni, di qualsiasi etnia, parlavano fluentemente l'inglese e erano in grado di fornire il consenso informato. I partecipanti esclusi includevano coloro che non erano in grado di fornire il consenso informato per se stessi, come quelli che richiedono un rappresentante legalmente autorizzato, individui di età inferiore ai 18 anni o superiore ai 65 anni, individui incarcerati e donne incinte. Inoltre, i partecipanti dovevano essere liberi dall'uso di farmaci antinfiammatori e dalle condizioni infiammatorie. Anche le infezioni in corso o le condizioni infiammatorie croniche o acute in corso erano criteri di esclusione. Infine, gli individui con una storia attuale o recente di infezione da COVID-19 non erano idonei per lo studio. Questi criteri sono stati progettati per garantire la sicurezza e l'idoneità dei partecipanti, riducendo al minimo i potenziali fattori confondenti che potrebbero influire sui risultati dello studio.

1. Preparazione dei reagenti

1. Terreno neutrofilo: Preparare il terreno neutrofilo aggiungendo il 2% di albumina sierica umana a RPMI-1640 senza rosso fenolo (vedere Tabella dei materiali).
2. Soluzione fMLP: Preparare la soluzione fMLP diluendola 100 volte dalla soluzione di conservazione a 10 mM di fMLP dimetilsolfossido (DMSO) (vedere Tabella dei materiali) con RPMI 1640 senza rosso fenolo, ottenendo una soluzione fMLP da 100 μM.
3. Soluzione anticorpale: diluire 120 μL di anticorpo monoclonale coniugato alloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (vedi tabella dei materiali), che riporta la conformazione ad alta affinità dell'integrina β2, in 10 mL di terreno neutrofilo, creando una soluzione di 1,2 μg/mL di mAb24-APC.
4. Libreria di composti: diluire la libreria di composti iniziale con una concentrazione compresa tra 10 mM e 1 mM aggiungendo 5 μL della libreria di 10 mM (vedere la tabella dei materiali) a 45 μL di DMSO in piastre da 384 pozzetti utilizzando il manipolatore di liquidi. Successivamente, trasferire 5 μL per pozzetto della libreria di composti da 1 mM su una piastra vuota da 384 pozzetti utilizzando il gestore di liquidi.
5. Come illustrato nella Figura 1, quattro colonne (1, 2, 23, 24) contenevano solo DMSO ma nessun composto, che fungeva da controlli positivi e negativi nello screening. Diluire ulteriormente ciascun pozzetto aggiungendo 45 μL di RPMI-1640 senza rosso fenolo, ottenendo una concentrazione finale di 100 μM per tutti i composti.

2. Isolamento dei neutrofili dal sangue umano

1. Utilizzando una pipetta sierologica, stratificare accuratamente 4 mL di sangue su 8 mL di un terreno a gradiente di densità disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 15 mL (Figura 2A).
2. Centrifugare il sangue a 550 × g per 30-50 minuti a 20 °C. Decelerare gradualmente il rotore (fattore di decelerazione pari a 1).
   NOTA: L'esito positivo della separazione dei neutrofili (banda 2 nella Figura 2B) dai globuli rossi può variare da un donatore all'altro. Per la maggior parte dei donatori, è sufficiente una centrifugazione di 30 minuti. Tuttavia, per alcuni donatori, possono essere necessari altri 10-30 minuti di centrifugazione se la separazione non ha successo (Figura 2C).
3. Rimuovere con cautela il plasma (il liquido giallo in alto) e le cellule mononucleate (la fascia torbida superiore; PBMC nella Figura 2B) utilizzando una pipetta da 1 mL.
4. Raccogliere i neutrofili dalla banda torbida inferiore (banda dei neutrofili nella Figura 2B) e circa 3-4 mL sotto il liquido limpido in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolare delicatamente la sospensione di neutrofili capovolgendola 2-3 volte.
5. Centrifugare la sospensione a 400 × g per 10 minuti a 20 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante mediante travaso.
6. Risospendere delicatamente il pellet con 5 mL di PBS e centrifugarlo a 300 × g per 5 min a 20 °C.
7. Rimuovere il surnatante mediante decantazione ed eliminare con cautela eventuali residui di surnatante intorno all'imboccatura del tubo e sulla parete del tubo utilizzando l'aspirazione a vuoto. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno neutrofilo.
8. Contare i numeri delle cellule usando un emocitometro. Tipicamente, da 1 a 4 × 10⁷ neutrofili sono stati ottenuti da 8 mL di sangue umano.
   NOTA: Potrebbe esserci una contaminazione dei globuli rossi nella sospensione di neutrofili. I globuli rossi non influenzano in modo significativo la maggior parte dei test e possono prevenire l'attivazione/priming dei neutrofili²⁷. I globuli rossi devono essere lisati prima di contare per ottenere una concentrazione accurata di neutrofili. Aggiungere 10 μL di sospensione cellulare a 891 μL di acqua deionizzata per 10-30 s per lisare i globuli rossi, quindi aggiungere 99 μL di PBS al 10× per bilanciare la pressione osmotica, prevenendo la lisi dei neutrofili.
9. Regolare la densità cellulare a 6,25 × 10⁵ cellule/mL aggiungendo terreno neutrofilo.

3. Preparazione della piastra a 384 pozzetti

1. In una provetta da centrifuga da 1,5 mL, combinare 1 mL della soluzione anticorpale (1,2 μg/mL di mAb24-APC) con 0,2 mL di terreno neutrofilo per creare una soluzione di mAb24-APC da 1 μg/mL. Quindi, aggiungere 25 μL di questa miscela ai pozzetti di controllo negativo in una piastra da 384 pozzetti (i pozzetti blu nella Figura 1).
2. In una provetta da centrifuga da 15 mL, miscelare 9 mL della soluzione anticorpale con 21,6 μL della soluzione fMLP (100 μM) e 1,7784 mL di terreno neutrofilo per creare una soluzione contenente 1 μg/mL di mAb24-APC e 200 nM di fMLP. Successivamente, aggiungere 25 μL di questa miscela ai pozzetti di controllo positivo e di prova in una piastra da 384 pozzetti (i pozzetti rosso e blu nella Figura 1).
3. Trasferire 5 μL delle soluzioni composte da 100 μM dalla piastra della libreria composta alla piastra da 384 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
4. Centrifugare il liquido per 1 min a 500 × g, a temperatura ambiente.
   NOTA: Per centrifugare le piastre, sono necessari un rotore a secchiello oscillante e secchi a piastre.

4. Trattamento delle cellule

1. Aggiungere 20 μL della sospensione di neutrofili a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a 16 canali (intervallo 5-50 μL, per ciascuna colonna della piastra a 384 pozzetti). Miscelare delicatamente 5-10 volte utilizzando la pipetta, mantenendo un intervallo di tempo costante tra un pipettaggio e l'altro.
   NOTA: Le concentrazioni finali nei pozzetti sono le seguenti: neutrofili 2,5 × 10⁵ cellule/mL (tutti i pozzetti); mAb24-APC 0,5 μg/mL (tutti i pozzetti); fMLP 100 nM (pozzetti di controllo positivo e di prova); composti 10 μM (pozzetti di prova).
2. Incubare la piastra su uno shaker a 300 giri/min, a temperatura ambiente (RT), per 10 min.
3. Fissare le cellule aggiungendo 3 μL di paraformaldeide (PFA) al 16% a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta a 16 canali (concentrazione finale di PFA ~0,91%). Quindi, incubare su ghiaccio per 10 minuti.
   NOTA: Si raccomanda di mantenere un intervallo di tempo costante tra le diverse colonne quando si aggiungono neutrofili e PFA. Ciò garantisce che i neutrofili in ciascun pozzetto abbiano lo stesso tempo di incubazione con fMLP e mAb24-APC.

5. Citometria a flusso

1. Accendere il citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali) e assicurarsi che anche il computer collegato allo strumento sia acceso.
2. Assicurarsi che il contenitore del fluido della guaina sia pieno e che il contenitore dei rifiuti sia vuoto e collegato correttamente allo strumento.
3. Caricare la piastra a 384 pozzetti sul caricatore di campioni del citometro a flusso. Assicurarsi che il pozzetto A1 della piastra sia allineato con il segno A1 sul caricatore.
4. Apri il software e crea un nuovo esperimento. Selezionare 384 pozzetti e scegliere i fluorofori desiderati. Quindi, fare clic su Impostazione piastra, trascinare per selezionare tutti i pozzetti, quindi fare clic su Campione. Attiva l'interruttore "Throughput elevato" e seleziona Alto nel pannello della velocità.
   1. Nella casella del volume, immettere 50. Selezionare i campioni nelle colonne dispari, quindi attivare l'interruttore "Agitazione". Infine, assegna un nome agli esempi nel pannello di destra.
5. Fare clic su Trama e cancello. Quindi, fai clic sul pulsante Applica (due frecce su un cerchio pieno di verde) e, successivamente, fai clic sul pulsante di riproduzione (forma triangolare). Attendi qualche secondo per osservare alcune cellule dal primo pozzetto, quindi fai clic sul pulsante di pausa .
   1. Regolare le tensioni FSC e SSC per garantire una corretta visualizzazione delle celle sul grafico. Fare clic su Acquisizione, quindi fare clic sul pulsante di riproduzione (forma triangolare) per avviare il saggio.
6. Il citometro a flusso campiona sequenzialmente ~50 μL di 1000-3000 neutrofili da ciascun pozzetto. Ci vorranno circa 3 ore per completare l'intera piastra da 384 pozzetti.
7. Dopo aver completato tutti gli esempi, esportare i file con estensione fcs per il passaggio successivo.

6. Analisi dei dati

1. Aprire il software di analisi dei dati di citometria a flusso (vedere Tabella dei materiali). Selezionare e trascinare la cartella contenente tutti i file .fcs nella finestra del software, quindi rilasciare per importare i dati nel software.
2. Fare doppio clic su un campione, gate singoli neutrofili basati su FSC e SSC^28,29,30 nella finestra che si apre^, come mostrato nella Figura 3. Selezionare le righe controllate e trascinarle nella cartella, quindi rilasciare per applicare il controllo a tutti gli esempi in tale cartella.
3. Calcola ed esporta l'intensità di fluorescenza mediana (MFI) APC dei neutrofili da ciascun pozzetto utilizzando la funzione di editor di tabelle del software. Fare clic su Aggiungi colonna nella scheda Modifica . Selezionare Mediana nella scheda Statistica , scegliere i neutrofili della popolazione gated e selezionare APC come parametro. Fare clic sul pulsante OK .
4. Torna alla scheda "Editor di tabelle", seleziona Tutti i campioni nella scheda "Gruppo" e premi il pulsante Crea tabella . Apparirà una nuova finestra che mostra la tabella creata. Salvalo come file di testo, CSV o Excel.
5. Aprire la tabella esportata, calcolare il valore medio e la deviazione standard dell'MFI APC per i campioni di controllo positivi e negativi (Figura 4).
6. Calcola il fattore Z' (Z') della piastra usando l'equazione:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   dove σ p e σ n sono rispettivamente le deviazioni standard dei controlli positivi e negativi e μ_p e μ_n sono le medie dei controlli positivi e negativi³¹.
   NOTA: Il fattore Z' indica la separazione delle distribuzioni di controllo positive e negative. Una Z' di 0 significa nessuna separazione, mentre una Z' di 0,5 indica una separazione uguale. Come accennato in un precedente studio³¹, Z' > 0,5 indica un test eccellente per lo screening dei composti. Una Z' nell'intervallo da 0,5 a 0 è accettabile, ma può identificare solo forti riscontri positivi nel saggio, che richiederanno un'ulteriore convalida nei saggi secondari.
7. Considerare i composti come "hit" per lo screening quando l'MFI APC dei neutrofili trattati con il composto è inferiore a tre volte la deviazione standard dell'MFI di controllo positivo sottratta dall'MFI di controllo positivo (P = 0,0013, rappresentato dalla linea tratteggiata nella Figura 4).

Results

I dati di uno screening rappresentativo su piastra a 384 pozzetti (Figura 4) hanno rivelato che i controlli negativi avevano un MFI di mAb24-APC di 3236 ± 110, mentre i controlli positivi avevano un MFI di mAb24-APC di 7588 ± 858. Il fattore Z' per questa piastra è di circa 0,33, che rientra in un intervallo accettabile³¹. Tuttavia, Z' richiede un'ulteriore convalida nei saggi secondari.

Per normalizzare i dati, tutti i valori sono stati scalati per assegnare un valore massimo di 1 alla media positiva e un valore minimo di 0 alla media negativa. Il fattore Z' sarà sottoposto a una validazione più rigorosa nei saggi secondari. Il cutoff per questa piastra è fissato a 0,41, il che significa che i campioni con un MFI relativo inferiore a 0,41 saranno considerati come hit che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 indotta da fMLP nei neutrofili umani. Da questa targa non sono stati identificati colpi.

Per confermare l'efficacia del protocollo, sono stati utilizzati Nexinhib20, che inibisce l'attivazione dell'integrina β2 antagonizzando la funzione di Rac-1, e lifitegrast, che antagonizza direttamente l'integrina αLβ2^32,33. Tuttavia, i tempi di incubazione sono stati regolati a un'ora per Nexinhib20 e a mezz'ora per lifitegrast. I dati risultanti da questi esperimenti sono stati normalizzati utilizzando lo stesso metodo di ridimensionamento descritto sopra. Questi dati sono stati poi combinati con i risultati delle lastre e analizzati collettivamente (Figura 4).

Figura 1: Layout della piastra per la vagliatura dei composti. Un diagramma schematico che illustra la disposizione dei composti di screening e dei controlli in una piastra a 384 pozzetti. I pozzetti di controllo negativo sono rappresentati in blu (colonne 1 e 23) e i pozzetti di controllo positivo sono mostrati in rosso (colonne 2 e 24). I pozzetti di prova sono rappresentati in beige (colonne da 3 a 22). Le frecce indicano la sequenza di lettura della targa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Separazione dei neutrofili utilizzando un mezzo a gradiente di densità. Foto rappresentative che dimostrano la separazione riuscita e non riuscita dei neutrofili utilizzando un mezzo a gradiente di densità. (A) Inizialmente, 4 mL di sangue vengono stratificati su 8 mL di terreno a gradiente di densità. (B) Dopo la centrifugazione, dovrebbero essere visibili due bande torbide: la banda superiore contenente principalmente cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e la banda inferiore contenente principalmente neutrofili con alcuni globuli rossi (RBC). La maggior parte dei globuli rossi sono pellettati nella parte inferiore. (C) Una separazione infruttuosa in cui i globuli rossi non vengono pellettati e la banda dei neutrofili non viene osservata. Sarebbe necessaria un'ulteriore centrifugazione (10-30 min) per separare la banda dei neutrofili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gating dei neutrofili utilizzando diagrammi FSC/SSC. Grafici rappresentativi di dispersione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) che illustrano la strategia di gating per l'identificazione dei neutrofili. (A) I neutrofili sono controllati in base all'area di diffusione diretta (FSC-A) e di dispersione laterale (SSC-A) registrate dal citometro a flusso. (B) Le singole celle sono ulteriormente controllate in base alla larghezza (FSC-W) e all'altezza (FSC-H) della dispersione diretta e (C) alla larghezza (SSC-W) e all'altezza (SSC-H) della dispersione laterale. La scala dei colori rappresenta la densità delle celle, passando dal rosso al giallo, al verde e al blu man mano che la densità diminuisce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati dello screening in una piastra rappresentativa a 384 pozzetti. I risultati dello screening da una piastra rappresentativa a 384 pozzetti, che dimostrano un fattore Z' di 0,3. I controlli negativi e positivi sono indicati rispettivamente da punti blu e rossi. I campioni di prova trattati con vari composti sono rappresentati da punti beige. La linea tratteggiata rappresenta il cut-off dell'intensità media di fluorescenza (MFI) per l'identificazione dei risultati. Nessuno dei composti testati è stato identificato come antagonista dell'integrina β2, poiché tutti i composti testati mostravano valori di MFI al di sopra della linea di cut-off. I risultati di esperimenti indipendenti che testano antagonisti noti dell'integrina β2 con tempi di incubazione variabili (Nexinhib20 per 1 ora, lifitegrast per mezz'ora) sono raggruppati per la presentazione in questa figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'inizio e la fine della stimolazione e della colorazione dei neutrofili sono determinati dall'aggiunta di neutrofili e del fissativo PFA. Pertanto, è fondamentale garantire lo stesso intervallo di tempo tra il pipettaggio dei neutrofili o del PFA in ciascuna colonna. Ciò garantisce che il tempo di stimolazione e colorazione dei neutrofili da ciascun pozzetto rimanga costante. A causa della breve durata di vita dei neutrofili, l'intero esperimento, dalla raccolta del sangue dai donatori al completamento della citometria a flusso, deve essere eseguito lo stesso giorno. I neutrofili sono altamente sensibili alle variazioni di temperatura e possono attivarsi se esposti a rapidi aumenti di temperatura, come la transizione da 4 °C a temperatura ambiente o da temperatura ambiente a 37 °C. Inoltre, sulla base della nostra precedente esperienza, l'attivazione dell'integrina β2 dei neutrofili β2 indotta da fMLP non si verifica quando le cellule sono conservate su ghiaccio o a 4 °C (dati non mostrati). Pertanto, prima della fissazione, il sangue intero e i neutrofili devono essere mantenuti a temperatura ambiente o a 20 °C (durante la fase di centrifugazione dell'isolamento). Non mettere sangue intero e neutrofili sul ghiaccio.

La colorazione di mAb24 nei controlli negativi dovrebbe dare risultati molto bassi. Se in un esperimento si osserva un alto livello di colorazione mAb24, controllare quanto segue: (1) se c'è stato un cambiamento significativo di temperatura durante l'esperimento prima della fissazione; (2) se c'era contaminazione da fMLP o da endotossine nel mezzo neutrofilo; (3) se la manipolazione del campione è stata troppo aggressiva, ad esempio generando bolle durante il pipettaggio e la miscelazione.

L'attuale protocollo utilizza mAb24 per segnalare l'apertura del copricapo dell'integrina β2. In teoria, KIM127, un anticorpo monoclonale che riporta l'estensione delle integrine β2 34,35^, può essere utilizzato in combinazione con mAb24 per valutare in modo completo la conformazione delle integrine β2. Tuttavia, il rapporto segnale/rumore della colorazione KIM127 (da 1,5 a 2 volte) non è così favorevole come quello di mAb24 (da 5 a 10 volte), che in genere non fornisce un fattore Z' soddisfacente nel saggio su piastra a 384 pozzetti. Nel saggio su piastra a 96 pozzetti, i campioni possono essere lavati prima di eseguire la citometria a flusso, riducendo i segnali di fondo derivati dagli anticorpi solubili. Pertanto, il test basato su KIM127 può essere condotto nel saggio su piastra a 96 pozzetti, che ha una produttività inferiore rispetto al saggio su piastra a 384 pozzetti.

Poiché questo metodo utilizza l'intensità della fluorescenza come lettura per valutare l'effetto inibitorio dell'integrina dei farmaci, alcuni farmaci fluorescenti possono interferire con i risultati. Inoltre, i farmaci tossici che inducono la morte dei neutrofili entro il periodo di stimolazione di 10 minuti sembreranno anche segnalare l'inibizione dell'integrina. I farmaci che inibiscono la degranulazione dei neutrofili sopprimono l'espressione complessiva dell'integrina β2. Questi inibitori della degranulazione saranno identificati anche nel nostro screening. Pertanto, è necessario uno screening secondario con altri controlli per confermare gli effetti inibitori dei risultati. Le schermate secondarie sono utilizzate come mezzo per convalidare e determinare il meccanismo d'azione dei risultati. Oltre a ripetere i test mAb24, l'espressione totale di CD18 sulla superficie cellulare sarà valutata utilizzando un anticorpo pan anti-umano CD18. Il livello di integrina β2 attivata, misurato da mAb24, sarà normalizzato dall'espressione totale di CD18. Questo ci permetterà di determinare se il meccanismo d'azione dell'agente coinvolge l'antagonizzazione dell'attivazione dell'integrina e/o l'inibizione dell'espressione di CD18 sulla superficie cellulare. Un test di vitalità deve essere eseguito anche nello screening secondario per escludere eventuali effetti tossici dei risultati.

Questo protocollo ha delle limitazioni. In primo luogo, mAb24 è in grado di rilevare il dominio β2 I-like solo nei casi in cui l'integrina è in uno stato ad alta affinità. Pertanto, non è in grado di identificare antagonisti allosterici α/β I-like come lifitegrast attraverso la diminuzione del legame con mAb24. Lifitegrast induce un maggiore legame di mAb24³² e mostra un valore di MFI anormalmente aumentato con mAb24 (Figura 4). Per tali valori anomali, possono essere necessari altri saggi per verificare se questi risultati sono antagonisti allosterici α/β I-like come lifitegrast. In secondo luogo, il fattore Z' per questo test non è ottimale e potrebbe potenzialmente essere migliorato attraverso l'uso del pipettaggio e dell'agitazione automatici. Purtroppo il nostro laboratorio non dispone delle attrezzature necessarie per verificare questa ipotesi. La duplicazione o la triplicazione dei saggi sarà utile per identificare falsi positivi e negativi nel caso in cui il fattore Z' non possa essere ulteriormente migliorato con i metodi di cui sopra. Inoltre, può essere utile prolungare il tempo di incubazione per identificare più hit, come osservato con il noto inibitore dell'attivazione dell'integrina β2 Nexinhib20, che richiede un'ora di incubazione per produrre effetti inibitori. Questo studio si è concentrato sull'identificazione di agenti ad azione rapida. I ricercatori dovrebbero notare che possono modificare il tempo di incubazione in base alle loro esigenze specifiche.

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo metodo di screening ad alto rendimento per gli antagonisti delle integrine β2. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per identificare composti di piccole molecole che si legano direttamente alle integrine β2 e prevengono i cambiamenti conformazionali che portano a stati integrinici intermedi/ad alta affinità, simili agli antagonisti senza proprietà "agonistiche" recentemente descritte per le integrine αIIbβ3 e α4β1²⁶. I neutrofili sono fondamentali in molte malattie infiammatorie, come il danno da ischemia-riperfusione miocardica 36, la sepsi³⁷ e le malattie autoimmuni^38,39. I farmaci a piccole molecole possono offrire una maggiore flessibilità nel trattamento di queste malattie rispetto ai farmaci a base di anticorpi. I colpi del nostro schermo potrebbero fornire potenziali trattamenti per le malattie infiammatorie.

Il metodo attuale è uno screening ad alto rendimento basato su anticorpi fluorescenti. Poiché gli anticorpi reporter di attivazione sono disponibili anche per β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 e αL integrine^47,48,49,50, questo metodo può essere esteso all'identificazione di antagonisti per altre integrine. Un anticorpo conformazionalmente sensibile come HUTS-21, che si lega al dominio ibrido β1 51,52,53, è stato utilizzato in uno screening ad alto rendimento per identificare antagonisti allosterici molto tardivi dell'antigene-4 (VLA-4^, integrina α4β1) ⁵⁴. L'attuale metodo di screening può anche essere modificato ed esteso per trovare farmaci che inibiscono o promuovono l'espressione di altri recettori di superficie, come i composti che aumentano l'espressione di superficie del regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) della fibrosi cistica sulle cellule di fibrosi cistica (FC). Nella fibrosi cistica, mutazioni multiple portano al misfolding di CFTR, con conseguente assenza di espressione di CFTR sulla membrana cellulare⁵⁵. È stato dimostrato che i farmaci a piccole molecole ripristinano l'espressione di CFTR⁵⁶. Per le modifiche del protocollo, è necessario aumentare il tempo di incubazione dei farmaci a diverse ore per consentire il verificarsi di cambiamenti nell'espressione proteica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pipette a 16 canali	Thermo	4661090N	Strumento
Piastra a 384 pozzetti	Greiner	784201	Materiali
APC Anti-umano CD11a/CD18 (LFA-1) Clone di anticorpi: m24	BioLegend	363410	Reagenti
Bravo  Piattaforma automatizzata per la movimentazione dei liquidi	Agilent	16050-102	384 manipolatore di liquidi multicanale
Centrifuga	Eppendorf	Modello 5810R	Strumento
FlowJo	Becton, Dickinson & Azienda	NA	Software
Soluzione di albumina sierica umana (25%)	GeminiBio	800-120	Reagenti
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagenti
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagenti
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagenti
Soluzione di paraformaldeide al 16%	Microscopia elettronica	Scienze 15710	Reagenti
Secchi per piastre	Eppendorf	UL155	Accessorio
Agitatore per piastre	Fisher	88-861-023	Strumento
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (1114683 precedente)	Reagenti
Libreria chimica Prestwick Piastre composte (10 mM)	Librerie chimiche Prestwick	Ver19_384	1520 piccole molecole, 98% dei farmaci approvati commercializzati (approvati da FDA, EMA, JAN e altre agenzie)
RPMI 1640 Medium, senza rosso fenolo	Gibco	11-835-030	Reagenti
Rotore a benna oscillante	Analizzatore cellulare Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5		Strumento modello ZE5