La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.
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Articolo metodologico
Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'introduzione di DNA estraneo nella spirocheta Borrelia burgdorferi è stata ottenuta quasi esclusivamente mediante trasformazione mediante elettroporazione. Questo processo ha efficienze notevolmente inferiori nella spirocheta della malattia di Lyme rispetto ad altri batteri Gram-negativi meglio caratterizzati. Il tasso di successo della trasformazione dipende fortemente dall'avere quantità concentrate di DNA di alta qualità da background specifici ed è soggetto a una significativa variabilità da ceppo a ceppo. Mezzi alternativi per introdurre DNA estraneo (cioè vettori navetta, reporter fluorescenti e marcatori di resistenza agli antibiotici) in B. burgdorferi potrebbero essere un'importante aggiunta all'armamentario di strumenti utili per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. I batteriofagi sono stati ben riconosciuti come meccanismi naturali per il movimento del DNA tra i batteri in un processo chiamato trasduzione. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per utilizzare l'onnipresente fago borreliale φBB-1 per trasdurre il DNA tra cellule di B. burgdorferi dello stesso background genetico e di diversi background genetici. Il DNA trasdotto include sia DNA borreliale che DNA eterologo sotto forma di piccoli vettori navetta. Questa dimostrazione suggerisce un potenziale uso della trasduzione mediata dai fagi come complemento all'elettroporazione per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. Questo rapporto descrive i metodi per l'induzione e la purificazione del fago φBB-1 da B. burgdorferi, l'uso di questo fago nei saggi di trasduzione e la selezione e lo screening di potenziali trasduttori.
Introduzione
Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari 5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all'altro all'interno dello st....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che utilizzano DNA ricombinante e organismi BSL-2 sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università di Quinnipiac.
1. Preparazione della coltura di B. burgdorferi per la produzione di φBB-1
- Preparare Barbour-Stoenner-Kelly medium integrato con siero di coniglio normale inattivato dal calore (BSK)15 al 6,6%. Per 1 L di 1x BSK, unire i componenti elencati nella Tabella 1 in 900 mL di acqua, regolare il pH a 7,6 utilizzando idrossido di sodio 1 N e mescolare lentamente a 4 °C per 2-4 ore. Al termine d....
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Risultati
L'uso del batteriofago per spostare il DNA tra ceppi di B. burgdorferi più facilmente trasformabili o cloni che sono recalcitranti all'elettrotrasformazione rappresenta un altro strumento per la continua indagine molecolare dei determinanti della malattia di Lyme. Il saggio di trasduzione qui descritto può essere modificato secondo necessità per facilitare il movimento del DNA tra eventuali cloni di interesse utilizzando uno o due antibiotici per la selezione di potenziali trasduttori. La trasduzione sia del DNA.......
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Discussione
L'uso della trasduzione potrebbe rappresentare un metodo per superare almeno alcune delle barriere biologiche e tecniche associate all'elettrotrasformazione di B. burgdorferi 1,4,13,37. In molti sistemi, il batteriofago può spostare il DNA dell'ospite (non profago) tra le cellule batteriche mediante trasduzione generalizzata o specializzata 22,23,24,49,50.<.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'autore desidera ringraziare Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor per la loro utile discussione e Vareeon (Pam) Chonweerawong per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Biomediche e dalle borse di ricerca della facoltà a Christian H. Eggers della School of Health Sciences della Quinnipiac University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Unità filtranti da 1 L (PES, 0,22 & micro; | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| provetta da 12 mm x 75 mm (tappo a doppia posizione) (polipropilene) | USA Scientific | 1450-0810 | contiene 4 mL con basso volume vuoto (per induzione) |
| Provette da centrifuga coniche da 15 mL (polipropilene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | Millipore Sigma | ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; non più prontamente disponibile, non ho testato offerto un sostituto | |
| Pipette Pasteur da 5,75" (con tappo di cotone/vetro borosilicato/non sterile) | Autoclave Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | prima dell'uso |
| Provette da centrifuga coniche da 50 ml (polipropilene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Etanolo | |||
| Agarosio LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Albumina sierica bovina (grado di sostituzione del siero) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Cloroformio (per biologia molecolare) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | ATTENZIONE: sostanze organiche volatili; utilizzare solo in una cappa chimica |
| CMRL-1066 senza L-Glutammina (polvere) | US Biological | C5900-01 | grado di coltura cellulare |
| Eritromicina | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Soluzione di reagente gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Glucosio (destrosio anidro) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Kanamicina solfato | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0,22 µ | Millipore Sigma | SLGSM33SS | per filtrare, sterilizzare antibiotici e altre soluzioni di piccolo volume |
| Mitomicina C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; utilizzare solo in una cappa chimica |
| N-acetil-D-glucosamina | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotidi (primer per PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (kit di estrazione genomica totale) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 mm & 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser camera di conteggio | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser coperchio camera di conteggio | vetro Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polietilenglicole 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Siero di coniglio non sterile in tracce emolizzato giovane (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | inattivato a caldo secondo le istruzioni del produttore |
| Cuvette semi-micro trasparenti UV | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Bicarbonato di sodio | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Cloruro di | sodioThermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Piruvato di sodio | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific Soluzione | ||
| di solfato di streptomicina | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Citrato trisodico diidrato | Millipore Sigma | S1804-500G | Citrato di sodio per BSK |
Riferimenti
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
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Ristampe e permessi
