Quantificare l'attività antifungina dei peptidi contro la Candida albicans

Wright K. Makambi; Svetlana P. Ikonomova; Amy  J. Karlsson

doi:10.3791/64416

Articolo metodologico

Quantificare l'attività antifungina dei peptidi contro la Candida albicans

DOI:

10.3791/64416

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13 gennaio 2023

Wright K. Makambi¹ , Svetlana P. Ikonomova¹ , Amy J. Karlsson¹

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati quantitativi sull'attività antifungina di peptidi e altri composti, come agenti antifungini a piccole molecole, contro la Candida albicans. Il suo uso della densità ottica piuttosto che contare le unità formanti colonie per quantificare l'inibizione della crescita consente di risparmiare tempo e risorse.

Abstract

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I metodi tradizionali per eseguire test di sensibilità antifungina per Candida albicans richiedono molto tempo e mancano di risultati quantitativi. Ad esempio, un approccio comune si basa sulla placcatura delle cellule trattate con diverse concentrazioni di molecole antifungine su piastre di agar e quindi sul conteggio delle colonie per determinare la relazione tra concentrazione molecolare e inibizione della crescita. Questo metodo richiede molte piastre e un tempo considerevole per contare le colonie. Un altro approccio comune elimina le piastre e il conteggio delle colonie ispezionando visivamente le colture trattate con agenti antifungini per identificare la concentrazione minima richiesta per inibire la crescita; Tuttavia, l'ispezione visiva produce solo risultati qualitativi e le informazioni sulla crescita a concentrazioni subinibitorie vengono perse. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la suscettibilità di C. albicans ai peptidi antifungini. Basandosi su misurazioni della densità ottica delle colture, il metodo riduce il tempo e i materiali necessari per ottenere risultati quantitativi sulla crescita delle colture a diverse concentrazioni peptidiche. L'incubazione del fungo con peptidi viene eseguita in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un tampone appropriato, con controlli che rappresentano nessuna inibizione della crescita e completa inibizione della crescita. Dopo l'incubazione con il peptide, le sospensioni cellulari risultanti vengono diluite per ridurre l'attività del peptide e quindi coltivate durante la notte. Dopo la crescita durante la notte, la densità ottica di ciascun pozzetto viene misurata e confrontata con i controlli positivi e negativi per calcolare l'inibizione della crescita risultante a ciascuna concentrazione di peptidi. I risultati che utilizzano questo test sono paragonabili ai risultati che utilizzano il metodo tradizionale di placcatura delle colture su piastre di agar, ma questo protocollo riduce i rifiuti di plastica e il tempo speso per contare le colonie. Sebbene le applicazioni di questo protocollo si siano concentrate sui peptidi antifungini, il metodo sarà applicabile anche alla sperimentazione di altre molecole con attività antifungina nota o sospetta.

Introduzione

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Candida albicans è un membro del microbiota umano che colonizza numerose località, tra cui la cavità orale, la pelle, il tratto gastrointestinale e la vagina¹. Per i pazienti immunocompromessi a causa di malattie come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e trattamenti immunosoppressivi, la colonizzazione di C. albicans può portare a candidosi locale o sistemica ^2,3. L'uso di terapie antifungine a piccole molecole attualmente disponibili, come amfotericina B, azoli o echinocandine, può essere complicato da problemi di solubilità e tossicità e dalla resistenza dell....

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Protocollo

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L'approvazione è stata ottenuta dall'Università del Maryland, College Park, Institutional Biosafety Committee (IBC) per il lavoro con C. albicans in questo protocollo (PN 274). Il ceppo SC5314 di C. albicans (vedi tabella dei materiali) è stato utilizzato nel presente studio; tuttavia, può essere utilizzato anche qualsiasi altro ceppo.

1. Preparazione del tampone, dell'acqua sterile e del terreno di coltura

Preparare un tampone sterile di fosfato di sodio 0,1 M (NaPB)²⁶ a pH 7,4 e diluire a 2 mM e 1 mM con acqua sterile. La preparazione di 100 mL ciascuno ....

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Risultati

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L'utilizzo delle misurazioni OD₆₀₀ per quantificare la riduzione della crescita dovuta ai peptidi antifungini consente di risparmiare tempo rispetto ai campioni di placcatura e al conteggio dei CFU. Il metodo descritto in questo protocollo richiede il completamento dei passaggi in tre giorni diversi. Il primo giorno, è necessaria circa 1 ora per preparare i tamponi e i mezzi (escluso il tempo di sterilizzazione) e inoculare la coltura iniziale di C. albicans per l'incubazione notturna. Il secondo gior.......

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Discussione

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Questo protocollo descrive un approccio efficiente per ottenere dati quantitativi sull'attività antifungina degli AMP contro il patogeno fungino C. albicans. Un approccio alternativo comune per testare peptidi e altri agenti antifungini è la microdiluizione del brodo descritta nello standard M27¹⁸ del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), ma questo standard si concentra sull'ottenimento di risultati visivi qualitativi anziché quantitativi. Un altro approccio alternativo è quello.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), dalla National Science Foundation (CBET 1511718), dal Dipartimento dell'Istruzione (GAANN-P200A180093) e da un Cross Campus Seed Grant dell'Università del Maryland.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 96 pozzetti (fondo tondo)	VWR	10062-902
Lettore di micropiastre ad assorbanza	N/A	N/A	Qualsiasi lettore di micropiastre disponibile è sufficiente
C. albicans ceppo SC5314	ATCC	MYA-2876	Possono essere utilizzati anche altri C. albicans
Emocitometro	N/A	N/A	Può essere utilizzato per creare una curva standard che mette in relazione il numero di cellule con OD₆₀₀
Agitatore per micropiastre	VWR	2620-926
Peptide(i)	N/A	N/A	I peptidi possono essere sintetizzati commercialmente da qualsiasi fornitore affidabile; una purezza di ≥ Si consiglia il 95% e la rimozione del sale dell'acido trifluoroacetico in sale cloridrato
Serbatoi di reagenti per pipettatori multicanale	VWR	18900-320	Semplifica il pipettaggio in piastre multipozzetto con pipettatore multicanale
Fosfato di sodio, bibasico	Fisher Scientific	BP332-500	Per la produzione di NaPB
Fosfato di sodio, monobasico	Fisher Scientific	BP329-500	Per la produzione di NaPB
Spettrofotometro UV	N/A	N/A	Qualsiasi spettrofotometro UV disponibile è sufficiente
YPD in polvere media	BD Life Sciences	242820	Può anche essere prodotto con estratto di lievito, peptone e destrosio

Riferimenti

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Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
de Oliveira Santos, G. C., et al.....

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