Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno in seguito a co-infezione virale ricapitola la malattia esacerbata dall'età

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) sono batteri Gram-positivi che risiedono asintomaticamente nel rinofaringe della maggior parte degli individui sani ^1,2. Promossi da fattori non completamente definiti, gli pneumococchi possono passare da colonizzatori benigni del rinofaringe a patogeni che si diffondono ad altri organi con conseguenti infezioni gravi, tra cui otite media, polmonite e batteriemia³. La presentazione della malattia pneumococcica dipende, in parte, dalle differenze specifiche del ceppo, incluso il sierotipo, che si basa sulla composizione dei polisaccaridi capsulari. Ci sono stati oltre 100 sierotipi caratterizzati finora, e alcuni sono associati a infezioni più invasive ^4,5. Diversi altri fattori aumentano il rischio di malattia da pneumococco. Uno di questi fattori è l'infezione virale, in cui il rischio di polmonite da pneumococco è aumentato di 100 volte da IAV ^6,7. Storicamente, S. pneumoniae è una delle cause più comuni di polmonite batterica secondaria dopo l'influenza ed è associata a esiti peggiori⁸. Un altro importante fattore di rischio è l'età avanzata. Infatti, S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica acquisita in comunità in individui anziani sopra i 65 anni ^9,10. Gli individui anziani rappresentano la maggioranza (>75%) dei decessi dovuti a polmonite e influenza, indicando che i due fattori di rischio - invecchiamento e infezione da IAV - peggiorano sinergicamente la suscettibilità alla malattia^11,12,13,14. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'infezione virale induce la transizione degli pneumococchi da colonizzatore asintomatico a patogeno invasivo e come questo è modellato dai fattori dell'ospite rimangono scarsamente definiti. Ciò è in gran parte dovuto all'assenza di un piccolo modello animale che ricapitola la transizione dalla colonizzazione pneumococcica asintomatica alla malattia clinica critica.

Studi di co-infezione sono stati classicamente modellati in topi inoculati con pneumococchi direttamente nei polmoni 7 giorni dopo l'infezione influenzale^15,16. Questo riproduce la suscettibilità alla polmonite batterica secondaria ed è ideale per studiare come le risposte immunitarie antivirali compromettono le difese antibatteriche¹⁷. Tuttavia, studi longitudinali sull'uomo hanno dimostrato che il trasporto pneumococcico nel rinofaringe, dove i batteri possono formare biofilm asintomatici¹⁸, è uniformemente associato a malattie invasive ^19,20. Gli isolati batterici da infezioni dell'orecchio medio, del polmone e del sangue sono geneticamente identici a quelli trovati nel rinofaringe²⁰. Pertanto, per studiare la transizione dal trasporto asintomatico alla malattia invasiva a seguito di infezione da IAV, è stato stabilito un modello in cui ai topi sono stati somministrati per via intranasale pneumococchi cresciuti con biofilm seguiti da infezione IAV del rinofaringe^21,22. L'infezione virale delle vie aeree superiori ha portato a cambiamenti nell'ambiente ospite che hanno portato alla dispersione di pneumococchi dai biofilm e alla loro diffusione alle vie aeree inferiori²¹. Questi batteri dispersi avevano sovraregolato l'espressione di fattori di virulenza importanti per l'infezione, convertendoli da colonizzatori a patogeni²¹. Queste osservazioni evidenziano la complessa interazione tra virus, ospite e batteri e dimostrano che i cambiamenti nell'ospite innescati dall'infezione virale hanno un impatto diretto sul comportamento pneumococcico, che, a sua volta, altera il decorso dell'infezione batterica. Tuttavia, questo modello non riesce a ricapitolare i gravi segni di malattia osservati negli esseri umani, probabilmente perché il virus è limitato alla cavità nasale e gli effetti sistemici dell'infezione virale sull'immunità dell'ospite e sul danno polmonare non sono ricapitolati.

Abbiamo recentemente stabilito un modello che incorpora la complessa interazione tra l'ospite e i patogeni, ma imita anche più da vicino la gravità della malattia osservata negli esseri umani²³. In questo modello, i topi vengono prima infettati per via intranasale con pneumococchi cresciuti in biofilm per stabilire un trasporto asintomatico, seguito da infezione IAV sia del rinofaringe che dei polmoni. Ciò ha provocato la disseminazione batterica ai polmoni, l'infiammazione polmonare e la malattia che è progredita fino alla letalità in una frazione di topi giovani²³. Questo studio precedente ha dimostrato che sia l'infezione virale che quella batterica alteravano la difesa dell'ospite: l'infezione virale promuoveva la disseminazione batterica e la precedente colonizzazione batterica comprometteva la capacità dell'ospite di controllare i livelli di IAV polmonare²³. L'esame della risposta immunitaria ha rivelato che l'infezione da IAV ha diminuito l'attività antibatterica dei neutrofili, mentre la colonizzazione batterica ha attenuato la risposta all'interferone di tipo I critica per la difesa antivirale²³. È importante sottolineare che questo modello ha riprodotto la suscettibilità all'invecchiamento. Rispetto ai topi giovani, i topi anziani mostravano segni di malattia prima, mostravano malattie cliniche più gravi e soccombevano all'infezione più frequentemente²³. Il lavoro presentato in questo manoscritto mostra che il grado di malattia dipende anche dal ceppo batterico, perché i ceppi pneumococcici invasivi mostrano una diffusione più efficiente dopo l'infezione da IAV, mostrano segni più evidenti di infiammazione polmonare e provocano tassi accelerati di malattia rispetto ai ceppi non invasivi. Pertanto, questo modello di co-infezione S. pneumoniae/IAV consente l'esame dettagliato sia dei fattori patogeni che di quelli dell'ospite ed è adatto per lo studio delle risposte immunitarie alle infezioni polimicrobiche nelle diverse fasi della progressione della malattia.

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dall'Università di Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di mezzi chimicamente definiti (CDM)

1. Preparare le scorte come segue:
   1. Sciogliere i composti della miscela I elencati nella Tabella 1 in 100 ml di acqua ultrapura mentre si agita. Conservare in aliquote da 200 μL a -20 °C.
   2. Sciogliere i composti della miscela II elencati nella tabella 1 in 20 mL di 0,1 M NaOH agitando. Conservare in aliquote da 100 μL a -20 °C.
   3. Sciogliere i composti della miscela III elencati nella Tabella 1 in 1 mL di acqua ultrapura agitando. Conservare in aliquote da 10 μL a 4 °C.
   4. Sciogliere il composto della miscela IV elencato nella Tabella 1 in 1 mL di acqua ultrapura mentre si agita. Conservare in aliquote da 10 μL a -20 °C.
   5. Sciogliere i composti elencati nella Tabella 2 inizialmente in 15 ml di acqua ultrapura agitando. Regolare il pH a 7,0 con alcune gocce di 0,1 M NaOH e regolare il volume finale a 20 ml utilizzando acqua ultrapura. Conservare in 1 mL di aliquote a -20 °C.
   6. Sciogliere i composti elencati nella Tabella 3 in 90 ml di acqua ultrapura su una piastra calda a 50 °C agitando. Regolare il pH a 7,0 con 0,1 M NaOH, quindi regolare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua ultrapura. Conservare in 5 ml di aliquote a −20 °C.
2. Preparare il brodo iniziale fresco ogni volta sciogliendo i composti nella Tabella 4 in 70 ml di acqua ultrapura mentre si mescola.
3. Al brodo iniziale fresco, aggiungere le seguenti scorte di miscela nell'ordine: 200 μL di stock di miscela I (tabella 1), 80 μL di stock di miscela II (tabella 1), 10 μL di stock di miscela III (tabella 1), 10 μL di madre di miscela IV (tabella 2), 1 ml di stock di vitamine (tabella 3) e 5 ml di madre di amminoacidi (tabella 4).
4. Una volta aggiunte le scorte, regolare il volume finale a 100 ml aggiungendo 30 ml di acqua ultrapura al becher.
5. Integrare il CDM con composti della Tabella 4. Una volta miscelato accuratamente, filtrare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Coltivare il biofilm di S. pneumoniae

1. Preparare il terreno RP-10 mescolando 445 ml di RPMI 1640 con 50 ml di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore e 5 ml di penicillina/streptomicina rispettivamente a 10.000 U/ml e 10.000 μg/ml.
2. Coltivare la linea cellulare di carcinoma mucoepidermoide NCI-H292 (H292). Aggiungere le cellule di un flaconcino acquistato a 5 ml di terreno RP-10 in un matraccio trattato con coltura tissutale T-25. Incubare a 37 °C/5% CO₂ per 3-5 giorni fino a raggiungere il 100% di confluenza.
3. Controllare le cellule al microscopio ottico utilizzando un ingrandimento 10x per valutare la confluenza.
   NOTA: Quando tutte le celle sono in contatto con altre cellule e non ci sono spazi vuoti in mezzo, viene raggiunta la confluenza desiderata del 100%.
4. Lavare le celle 2x in 5 ml di PBS a temperatura ambiente. Assicurarsi che il tampone sia privo di calcio per evitare chelare l'EDTA nella fase successiva.
5. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA al matraccio e incubare a 37 °C/5% CO₂ per 5-10 minuti fino al distacco delle cellule. Neutralizzare con 4 mL di terreno RP-10. Mescolare delicatamente pipettando su e giù e trasferire in un tubo conico da 50 ml.
6. Aggiungere 500 μL di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale. Da un pallone T-25 confluente, aspettarsi 2 × 10 6-4 × 10⁶ cellule / ml.
7. Il giorno seguente, controllare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che siano confluenti, come nel passaggio 2.3. Se non lo sono, allora incubare più a lungo.
8. Una volta che le cellule H292 sono confluenti al 100% nella piastra a 24 pozzetti, lavare delicatamente le cellule 3 volte con 1 ml di PBS a temperatura ambiente per assicurarsi che non rimanga alcun mezzo contenente antibiotici o detriti.
9. Dopo aver lavato le cellule, aggiungere 250 μL/pozzetto di paraformaldeide al 4% per fissare le cellule. Incubare per 1 ora su ghiaccio o per una notte a 4 °C.
10. La notte prima della fissazione cellulare, striare il ceppo di interesse di S. pneumoniae su piastre di agar sangue e incubare per una notte a 37 °C/5% CO₂.
    NOTA: I dati qui presentati sono con i seguenti ceppi di S. pneumoniae ottenuti tramite scambio collaborativo: sierotipo 19F otite media isolato EF3030 24, sierotipo classico 2 Avery ceppo D39²⁵ e sierotipo 4 batteriemia isolato^{TIGR4 26}. I ceppi sono disponibili anche da collezioni pubbliche a cui si fa riferimento nella tabella dei materiali.
11. Preparare CDM più ossidasi (0,15 U/mL) aggiungendo 100 μL di ossirasi (30 U/mL) a 20 mL di CDM.
    NOTA: L'ossirasi viene utilizzata per eliminare l'ossigeno per consentire la crescita efficiente di S. pneumoniae in coltura liquida²⁷.
12. Inoculare i batteri dalla piastra in CDM fresco + ossirasi lavando i batteri dalla piastra aggiungendo 1 mL di CDM + ossirasi e sollevando delicatamente le colonie batteriche usando il lato di una punta di pipetta da 1 ml, facendo attenzione a non raschiare l'agar. In alternativa, utilizzare un circuito di inoculazione per sollevare i batteri e inocularli in una provetta contenente 1 mL di CDM + ossirasi.
13. Diluire i batteri in CDM + ossirasi a un OD₆₀₀ iniziale di 0,05.
14. Coltivare i batteri in un tubo conico da 50 mL con tappo libero in piedi a 37 ° C / 5% CO 2 fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,2 (questo richiederà ovunque tra_2-5 h). Controllare l'OD₆₀₀ ogni ora per assicurarsi che l'OD non superi 0,2.
15. Una volta che l'OD ha raggiunto 0,2, vortice il tubo di coltura batterica. Seminare 0,5 ml di batteri sulle cellule H292 fisse e aggiungere altri 0,5 ml di CDM + mezzo di ossirasi per pozzetto. Aggiungere 1 mL di CDM + ossirasi ai pozzetti di controllo senza batteri. Incubare la piastra per 48 ore a 34 °C/5% CO₂.
    NOTA: La crescita a 34 °C viene utilizzata per imitare più da vicino la temperatura più bassa nel rinofaringe²¹.
16. Ogni 12 ore successive alla semina iniziale, rimuovere delicatamente 0,5 ml di terreno e reintegrare con 0,5 ml di CDM fresco + ossirasi. Fare attenzione a non interrompere il biofilm in formazione. Controlla la parte inferiore della piastra per il biofilm e cerca l'aumento della nuvolosità con il passare del tempo a causa della crescita del biofilm. Per controllare la contaminazione, controllare i pozzetti senza batteri per assicurarsi che i pozzetti di controllo rimangano liberi.
17. A 48 ore dopo l'inoculazione, rimuovere il surnatante e lavare 2 volte molto delicatamente con 1 mL di PBS. Risospendere in 1 mL di CDM fresco e pipettare su e giù vigorosamente per sollevare il biofilm. Per ogni ceppo batterico, raggruppare i batteri da tutti i pozzetti in un tubo conico da 50 ml. Mescolare bene inclinando delicatamente il tubo strettamente tappato su e giù più volte.
18. Al tubo conico da 50 ml, aggiungere il 40% di glicerolo in CDM a volumi uguali per ottenere una sospensione batterica con una concentrazione finale del 20% di glicerolo. Aliquote 1 mL in provette da microcentrifuga, congelamento flash su ghiaccio secco e risparmio a -80 °C.
19. Prima dell'uso, enumerare i batteri scongelando un'aliquota sul ghiaccio, ruotando il tubo a 1.700 × g per 5 minuti, rimuovendo il surnatante, risospendendo il pellet in 1 mL di PBS e placcando le diluizioni seriali su piastre di agar sanguigno²⁸.
20. Far crescere le piastre di agar per una notte a 37 °C/5% di CO₂ e contare le colonie alle diluizioni pertinenti per ottenere la concentrazione batterica nelle unità formanti colonie (CFU)/ml.
    NOTA: Si raccomanda di enumerare i batteri presenti nelle scorte almeno un giorno dopo il congelamento o più tardi, poiché vi è un calo della vitalità batterica entro le prime 24 ore. Le aliquote congelate conservate possono essere utilizzate per la successiva infezione dei topi per un massimo di 2 mesi.

3. Inoculazione intranasale di topi con S. pneumoniae cresciuti in biofilm

1. Acquista topi e usa all'età desiderata.
   NOTA: I topi di età compresa tra 3 e 4 mesi sono preferiti ai giovani ospiti modello e i topi di età compresa tra 21 e 24 mesi possono essere utilizzati per modellare individui anziani >65 anni di età²⁹. I dati presentati qui sono con topi maschi C57BL / 6.
2. Scongelare le aliquote batteriche cresciute con biofilm sul ghiaccio e centrifugare a 1.700 × g per 5 minuti. Rimuovere con cura e scartare il surnatante senza interrompere il pellet, lavare i batteri risospendendo il pellet in 1 ml di PBS e ruotare di nuovo a 1.700 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet nel volume necessario per raggiungere la concentrazione desiderata (obiettivo 5 × 10⁶ CFU/10 μL per l'inoculazione intranasale). Confermare la quantità di batteri somministrati placcando l'inoculo preparato su piastre di agar sangue come al punto 2.19.
3. Inoculare i topi per via intranasale con 5 × 10⁶ CFU pipettando 5 μL dell'inoculo diluito in ciascun naride. Assicurati di tenere saldamente i topi, stabilizzando la testa, fino a quando il volume non viene inalato (in genere entro pochi secondi dal pipettaggio del volume nelle narici). Eseguire questo passaggio in assenza di anestesia per prevenire l'aspirazione polmonare dell'inoculo.

4. Infezione virale da virus dell'influenza A (IAV)

1. A 48 ore dopo l'inoculazione intranasale con S. pneumoniae, scongelare il ceppo IAV di interesse sul ghiaccio.
   NOTA: I dati qui presentati si riferiscono a un ceppo di virus dell'influenza A A/PR/8/34 H1N1 adattato al topo che è stato ottenuto tramite scambio collaborativo³⁰.
2. Una volta che il virus si è scongelato, diluire il virus in PBS alla concentrazione desiderata; obiettivo per 20 unità formanti placca (PFU)/50 μL per l'infezione intratracheale e 200 PFU/10 μL per l'infezione intranasale. Per i gruppi finti infetti e solo batteri, utilizzare PBS per inoculare i topi.
3. Posizionare il lubrificante oftalmico sugli occhi dei topi prima dell'anestesia. Anestetizzare i topi usando isoflurano al 5% e confermare l'anestesia con un pizzico fermo.
4. Una volta che l'animale è anestetizzato, rimuoverlo dalla camera di isoflurano e infettare immediatamente i topi anestetizzati con 50 μL (20 PFU) di IAV per via intratracheale usando pinzette smussate per estrarre la lingua dalla bocca e pipettare il volume di liquido lungo la trachea.
5. Metti i topi in una gabbia separata e monitora fino al completo recupero (sono in grado di mantenere la reclinazione sternale [in grado di giacere in posizione verticale sul petto]).
6. Dopo il recupero, inoculare immediatamente per via intranasale i topi con 10 μL (200 PFU) di IAV utilizzando il metodo di inoculazione nella fase 3.3.
7. Topi domestici che hanno subito un'infezione batterica e virale singola o doppia con lo stesso gruppo di infezione e li separano dagli altri gruppi.

5. Monitoraggio dei topi per i sintomi della malattia

1. Monitorare i topi ogni giorno per almeno 10 giorni e segnare ciecamente i segni di malattia come segue:
   1. Punteggio come segue per la perdita di peso: 0 = 5% o meno; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% o più. Eutanasia i topi usando l'inalazione di CO₂ quando il punteggio di perdita di peso è a 3.
   2. Punteggio come segue per l'attività: 0 = normale/attivo; 1 = in movimento ma leggermente diminuito; 2 = diminuito; 3 = gravemente diminuito/letargico (si muove solo se toccato), 4 = coma/immobile. Eutanasia dei topi quando il punteggio di attività è a 3.
   3. Punteggio come segue per la postura: 0 = nessuna intuizione (normale); 1 = postura leggermente curva; 2 = grave intuizione. Eutanasia dei topi quando il punteggio della postura è a 2.
   4. Punteggio come segue per gli occhi: 0 = normale; 1 = sporgente; 1 = affondato; 1 = chiuso; 1 = scarico. Può essere una combinazione. Aggiungi i totali per il punteggio finale degli occhi.
   5. Punteggio come segue per la respirazione: 0 = Respirazione normale; 1 = irregolare o alterato (tasso più alto/più basso); 2 = faticato (sforzo esagerato o ansimante). Eutanasia dei topi quando il punteggio di respirazione è a 2.
2. Sulla base dei criteri di cui sopra, aggiungere i punteggi individuali per un punteggio clinico totale di sano (0) a estremamente malato (15). Considera che qualsiasi topo che mostra un punteggio totale superiore a 2 è malato. Eutanasia umana tutti i topi che mostrano un punteggio totale superiore a 9 o i punteggi indicati per ciascun criterio e contrassegnarli sulla curva di sopravvivenza.

6. Trattamento di tessuti infetti per l'enumerazione batterica

1. A 48 ore dopo l'infezione da IAV, eutanasia i topi.
2. Posizionare il mouse in posizione supina. Usando il 70% di etanolo, spruzzare il petto e l'addome del topo per pulire la pelliccia. Usando una pinza, pizzicare la pelliccia e la pelle nel mezzo del topo e tagliare la pelliccia con 4,5 forbici da dissezione per esporre l'area dal fegato fino al petto.
3. Raccolta del sangue
   1. Usando le forbici da dissezione, tagliare delicatamente nella cavità peritoneale per esporre il fegato. Usando una pinza, esporre la vena porta epatica nella parte superiore del fegato vicino al diaframma. Tagliare la vena porta epatica usando le forbici da dissezione. Una volta che il sangue inizia a raggrupparsi nella cavità peritoneale, raccogliere 10 μL di sangue usando una micropipetta e metterli in 90 μL di soluzione anticoagulante (soluzione EDTA 50 mM in PBS) in una provetta da microcentrifuga per placcare la carica batterica.
   2. Utilizzare una micropipetta P-1000 per raccogliere il resto del sangue, metterlo in una provetta per la raccolta del sangue e centrifugare a 7.600 × g per 2 minuti per raccogliere il siero. Conservare i sieri in provette da microcentrifuga a -80 °C per la successiva analisi di qualsiasi citochina o metabolita desiderato.
4. Collezione Lung
   1. Usando le forbici da dissezione, fai un taglio sui lati della gabbia toracica esposta e tira delicatamente le costole verso la testa del topo per esporre il cuore. Inserire un ago da 25 G collegato a una siringa da 10 ml preriempita con PBS nel ventricolo destro e iniziare lentamente a perfondere. Cerca lo sbiancamento dei polmoni come indicatore di perfusione riuscita. Sciacquare lentamente per evitare di rompere il tessuto polmonare.
   2. Sollevare il cuore con la pinza e fare un taglio per separare i polmoni e il cuore. Una volta separati, raccogliere tutti i lobi del polmone con la pinza e risciacquare in un piatto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue. In una capsula di Petri, tritare i polmoni in piccoli pezzi e mescolare bene. Rimuovere metà della miscela polmonare per la determinazione del CFU batterico o PFU virale e posizionarla in un tubo rotondo da 15 ml preriempito con 0,5 ml di PBS per l'omogeneizzazione.
      NOTA: È importante non prendere diversi lobi dello stesso polmone per le varie valutazioni. Invece, tutti i lobi dovrebbero essere tritati, mescolati bene insieme e analizzati allo stesso modo per le diverse valutazioni.
   3. Rimuovere l'altra metà del polmone per la citometria a flusso (sezione 7 sotto) e posizionarla in una piastra a 24 pozzetti non trattata con coltura tissutale con ciascun pozzetto preriempito con 0,5 ml di RP-10. Lasciare a temperatura ambiente fino alla lavorazione.
5. Collezione Nasofaringe
   1. Al collo, usa le forbici da dissezione per tagliare via la pelliccia, quindi taglia via il muscolo ed esponi la trachea.
      NOTA: La trachea è una struttura tubolare situata sotto il muscolo.
   2. Posizionare una piccola pinza sotto la trachea a una distanza di 1 cm dalla mascella del topo per stabilizzarla. Utilizzando le forbici da dissezione, fare delicatamente una fessura di 0,1 cm sulla porzione anteriore della trachea, evitando di tagliare completamente la trachea.
   3. Preparare una siringa da 1 mL riempita con 0,5 mL di PBS con tubo da 0,58 mm collegato a un ago da 25 G. Raccogliere il lavaggio nasale inserendo il tubo nella trachea andando verso l'alto verso il rinofaringe. Una volta che si avverte la resistenza che entra nella cavità nasale, posizionare un tubo di microcentrifuga sul naso e lavare lentamente il PBS attraverso la trachea per raccogliere la lavanda nasale.
   4. Posizionare il mouse in posizione prona. Spruzzare la testa del topo con etanolo. Usa le forbici da dissezione per tagliare la pelliccia e il cuscinetto mistaciale per esporre l'osso della testa del topo.
   5. Usando le forbici da dissezione, fai un taglio di 1 cm lungo i lati della mandibola e tra gli occhi. Usando una pinza, allontanare lentamente le ossa facciali dal corpo per esporre la cavità nasale.
   6. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il tessuto nasale e posizionarlo in un tubo inferiore rotondo preriempito con 0,5 ml di PBS per l'omogeneizzazione.
6. Per omogeneizzare il tessuto raccolto, pulire prima la sonda omogeneizzatore mettendola in etanolo al 70% e accendendo l'omogeneizzatore al 60% di potenza per 30 s. Ripetere il passaggio in acqua sterile per 10 secondi. Omogeneizzare ogni tessuto per 1 minuto. Pulire la sonda omogeneizzatore in acqua sterile tra ciascun campione e in una provetta fresca di etanolo al 70% tra ciascun organo e gruppo di campioni.
7. Enumerazione dei numeri batterici
   1. Una volta che tutti gli organi sono stati prelevati e omogeneizzati, diluizioni seriali su piastre di agar sangue. Per calcolare la CFU totale, utilizzare 10 μL per placcare e annotare il volume finale in ml per ciascun campione. Placcare i campioni di rinofaringe su piastre di agar sanguigno integrate con 3 μg / mL di gentamicina per selezionare la crescita di S. pneumoniae mentre inibisce la crescita di altri microrganismi che colonizzano quel tessuto. Incubare per una notte a 37 °C/5% CO₂.
   2. Per enumerare i CFU batterici per il polmone e il rinofaringe, prima contare le colonie sulle piastre di agar sangue. Quindi, utilizzare l'equazione (1) e l'equazione (2) per calcolare la quantità per ml e il numero totale.
      Quantità per mL = numero di colonie × fattore di diluizione × 100 (1)
      Numero totale = quantità per ml × volume totale per campione (2)
      NOTA: Nell'equazione (1), 100 viene utilizzato per moltiplicare poiché 10 μL è placcato, che è una diluizione di 100 volte di 1 ml. Il volume totale per campione nell'equazione (2) è del punto 6.7.1, che si traduce nel limite di rilevazione di 100 per organo.
   3. Per enumerare il CFU batterico Per la batteriemia, prima contare le colonie sulle piastre di agar sangue. Quindi, utilizzare l'equazione (3) per determinare la quantità per ml di sangue.
      Quantità per ml di sangue = numero di colonie × fattore di diluizione × 100 × 10 (3)
      NOTA: Nell'equazione (3), 100 è usato quando 10 μL è placcato, che è una diluizione 100 volte di 1 mL, e 10 indica una diluizione 1:10 del sangue nell'anticoagulante. Ciò si traduce nel limite di rilevamento di 1.000 / ml.

7. Elaborazione dei campioni polmonari per citometria a flusso

1. Preparare il supporto richiesto come segue:
   1. Preparare RP-10 come descritto al punto 2.1.
   2. Preparare il tampone di digestione mescolando RP-10 con 2 mg/mL di collagenasi e 30 μL/mL di DNasi I.
   3. Preparare il tampone di lisi sciogliendo 8,29 g di NH₄Cl, 1 g di NaHCO₃ e 0,038 g di EDTA in 1 L di H₂O.
   4. Preparare 10x tampone FACS mescolando 450 mL di HBSS con 50 mL di FBS inattivato dal calore e 5 g di azoturo di sodio.
   5. Preparare 1x tampone FACS diluendo 50 mL di tampone FACS 10x in 450 mL di HBSS.
2. Prelevare i campioni polmonari del punto 6.4.3 e metterli in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 500 μL di tampone di digestione a ciascun pozzetto. Incubare per 45 minuti fino a 1 h a 37 °C/5% CO₂.
3. Preriempire tubi conici da 50 mL per ogni campione con 5 mL di RP-10. Al termine dell'incubazione, posizionare un filtro da 100 μm nella parte superiore del tubo conico da 50 mL e bagnarlo con 1 mL di RP-10.
4. Utilizzando una micropipetta P-1000, spostare i polmoni digeriti e posizionarli sul filtro. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 3 mL per schiacciare l'organo. Risciacquare 2 volte con 1 mL di RP-10.
5. Centrifugare i campioni a 4 °C e 327 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi. Lasciare agire per 3 minuti per consentire la lisi dei globuli rossi. Neutralizzare con 5 mL di RP-10.
6. Centrifugare i campioni a 4 °C e 327 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di RP-10 e prelevare 10 μL per il conteggio dei campioni.
7. Centrifugare i campioni a 4 °C e 327 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in RP-10 a 2 × 10 6-4 × 10⁶ cellule/ml. Aggiungere 60 μL di ciascun campione in una piastra da 96 pozzetti per colorare i tipi di cellule desiderati²³ elencati al punto 7.9, Tabella 5 e Tabella 6.
8. Girare la piastra a 4 °C e 327 × g per 5 minuti.
9. Nel frattempo, preparare le miscele master di anticorpi, fluorescenti meno uno (FMO) e controlli monomacchia con gli anticorpi desiderati. Per colorare i leucociti polimorfonucleati (PMN), i macrofagi, i monociti, le cellule dendritiche e le cellule T, utilizzare gli anticorpi e le diluizioni finali elencati nella Tabella 5 e nella Tabella 6. Utilizzare un volume totale di 100 μL/pozzetto della miscela anticorpale. Seguire le diluizioni elencate nelle tabelle per determinare il volume appropriato della miscela master e dei singoli anticorpi necessari.
10. Al termine dello spin (fase 7.8), decantare il surnatante, risospendere i pellet in 100 μL delle miscele di anticorpi, FMO o controlli monomacchia e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio.
11. Lavare le celle 2 volte aggiungendo 150 μL di tampone FACS ai pozzetti e ruotando la piastra a 4 °C e 327 × g per 5 minuti.
12. Al termine della centrifuga, decantare il surnatante, risospendere i pellet in 100 μL di tampone di fissazione e incubare su ghiaccio per 20 minuti.
13. Lavare le celle 2 volte aggiungendo 150 μL di tampone FACS ai pozzetti e ruotando la piastra a 4 °C e 327 × g per 5 minuti.
14. Preparare tubi FACS marcati con 200 μL di tampone FACS. Risospendere i pellet in 150 μL di tampone FACS. Filtrare individualmente ogni campione nella provetta FACS corrispondente utilizzando un filtro da 100 μm. Conservare sul ghiaccio o a 4 °C e al riparo dalla luce fino al momento dell'analisi.
15. Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso.

8. Saggio della placca per l'enumerazione dell'IAV

1. Preparare il supporto richiesto come segue:
   1. Preparare il terreno di infezione sciogliendo 2,5 g di sieroalbumina bovina (BSA) in 40 mL di DMEM agitando a 37 °C per 10-20 minuti fino alla dissoluzione. Filtrare-sterilizzare in 460 mL di DMEM.
   2. Preparare il 2,4% di cellulosa microcristallina sciogliendo 1,2 mg di cellulosa microcristallina in 50 ml di H₂O. Autoclave sull'impostazione del liquido e conservare a temperatura ambiente.
   3. Preparare il 5% di BSA DMEM sciogliendo 2,5 g di BSA in 40 mL di DMEM agitando a 37°C per 10-20 minuti. Aggiungere i restanti 10 ml di DMEM per un volume finale di 50 ml. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C.
   4. Preparare 2x MEM/0,5% BSA mescolando 1 mL di 5% BSA DMEM con 9 mL di 2x MEM.
   5. Preparare un mezzo di sovrapposizione a bassa viscosità mescolando un rapporto 1:1 di cellulosa microcristallina al 2,4% e 2x MEM/0,5% BSA con 1 mg/mL di TPCK (inibitore della chimotripsina) tripsina.
   6. Preparare EMEM/10% FBS mescolando 450 mL di Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) con 50 mL di FBS termoattivato.
2. Coltivare la linea cellulare del rene canino Madin-Darby (MDCK). Aggiungere le cellule di un flaconcino acquistato a 5 ml di EMEM/10% FBS in un matraccio trattato con coltura tissutale T-25. Incubare per 3-5 giorni a 37 °C/5% CO₂ fino a quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza. Verificare la confluenza come al punto 2.3.
3. Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura e risciacquare 2 volte con 5 ml di PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA al matraccio e incubare a 37 °C/ 5% CO₂ per 10-15 minuti fino al distacco delle cellule. Una volta sollevato, neutralizzare con 4mL di EMEM/10% FBS per ottenere una sospensione cellulare a 2 × 10⁵ cellule/mL.
4. Seminare le cellule MDCK in una piastra trattata con coltura tissutale a 12 pozzetti aggiungendo 1 ml di cellule risospese per pozzetto (a 2 × 10⁵ cellule / pozzetto) 1 giorno prima di iniziare il test della placca.
   NOTA: Assicurarsi che le cellule raggiungano il 100% di confluenza prima dell'uso e incubano più a lungo se necessario per raggiungere la confluenza.
5. Per l'uso come standard, effettuare diluizioni seriali 10 volte (10^6-10 1) di stock IAV (di un titolo noto) nel mezzo di infezione elencato al punto 8.1.1. Produrre 1,2 ml di ogni diluizione per testare in triplice copia.
6. Scongelare l'organo omogenea sul ghiaccio. Girare su una centrifuga da tavolo a 2.000 × g e raccogliere il surnatante chiaro.
7. Ripetere il passaggio 8.5 ma con il surnatante dei campioni nel punto 8.6.
8. Aspirare il mezzo dalle cellule e lavare 2 volte con 1 mL di PBS per rimuovere tutto l'FBS.
9. Aggiungere 300 μL di ogni diluizione standard o campione diluito in serie delicatamente lungo il lato di ciascun pozzetto, iniziando dalla diluizione più alta fino alla più bassa, e farlo in triplice copia.
10. Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂, agitando la piastra ogni 10 minuti per un totale di 50 minuti. Assicurati di posizionarli piatti nell'incubatrice e non impilarli.
11. Dopo i 50 minuti, lavare le celle 2x con 1 mL di PBS.
12. Aggiungere 2 mL del mezzo di rivestimento a bassa viscosità in ciascun pozzetto ad eccezione dei pozzetti a più bassa diluizione e senza virus; A quelli, aggiungi mezzo di infezione e tripsina.
13. Riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C/5% CO 2 per_2-4 giorni per ottenere placche visualizzabili ad occhio nudo.
14. Lavare le piastre aggiungendo 2 ml di PBS in ciascun pozzetto velocemente dal lato e agitare delicatamente per sospendere il mezzo di sovrapposizione a bassa viscosità depositato.
15. Scartare l'intero volume di liquido nel pozzetto rimuovendo delicatamente il fluido.
16. Ripetere il lavaggio ancora una volta con 2 ml di PBS in ciascun pozzetto, quindi eliminare l'intero volume di liquido mediante pipettaggio delicato.
17. Per fissare le placche, aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto, agitare e lasciare riposare per 30 minuti.
18. Lavare lentamente lungo il lato con 1 mL di PBS; Quindi, scartare delicatamente il liquido.
19. Aggiungere 500 μL di viola cristallino all'1% (diluito in acqua) in ciascun pozzetto per coprire il monostrato cellulare. Incubare per 5 min.
20. Lavare con 1 mL di acqua di rubinetto. Assicurarsi di gettare tutto il liquido nel pozzetto mediante pipettaggio delicato. Metti il piatto capovolto su un pannolino per asciugarlo durante la notte.
21. Conta visivamente le targhe e salva le immagini su qualsiasi imager disponibile.

S. pneumoniae coltivato con biofilm (Figura 1A) è stato utilizzato per infettare i topi (Figura 1B) utilizzando un piccolo inoculo da 10 μL somministrato per via intranasale a topi non anestetizzati. Questo inoculo di piccolo volume si traduce in un trasporto pneumococcico coerente limitato al rinofaringe (Figura 2A, gruppi +sp) evitando la diffusione sistemica (Figura 2B, C, gruppi +sp). Due giorni dopo l'inoculazione intranasale, i topi sono stati infettati da un virus dell'influenza A H1N1 adattato alle urine A/PR/8/34 (IAV)22,30 somministrato sia per via intranasale che intratracheale per ottenere una consegna coerente di quantità specifiche al rinofaringe e ai polmoni 23.

Qui, il modello è stato utilizzato per confrontare il decorso della malattia a seguito di infezione virale in topi sfidati per via intranasale con diversi ceppi di S. pneumoniae, tra cui TIGR4 e D39, che sono ceppi invasivi che provocano polmonite che progredisce in batteriemia, e EF3030, che è un ceppo di otite media 21,24,25,26,31. La presentazione della malattia nei topi co-infetti da S. pneumoniae/IAV dipendeva dal ceppo batterico (Figura 2). Mentre non vi era alcuna differenza significativa nel numero batterico del rinofaringe (Figura 2A) tra nessuno dei ceppi, S. pneumoniae TIGR4 e D39, ma non EF3030, si sono diffusi ai polmoni entro 48 ore dopo l'infezione IAV (Figura 2B). Il quaranta percento dei topi infettati per via intranasale con S. pneumoniae TIGR4 ha mostrato disseminazione batterica ai polmoni, e di questi, la metà di loro è diventata batterica (Figura 2C), coerentemente con i risultati precedenti23.

I topi infettati per via intranasale con S. pneumoniae D39 hanno mostrato una disseminazione più efficiente, perché la diffusione ai polmoni è stata osservata nel 100% dei topi co-infetti (Figura 2B). Simile a S. pneumoniae TIGR4, la metà di quelli ha sperimentato batteriemia (Figura 2C). Nel tracciare la sopravvivenza globale, indipendentemente dal ceppo batterico, il tasso di sopravvivenza dei topi co-infetti era significativamente inferiore rispetto ai topi singolarmente sfidati con S. pneumoniae da solo per tutti i ceppi testati (Figura 2D). Rispetto ai topi di controllo sfidati con IAV da solo, i topi infettati per via intranasale con S. pneumoniae TIGR4 e D39, ma non EF3030, hanno mostrato tassi accelerati di malattia. Al giorno 2 dopo l'infezione da IAV, il 30% (D39) e il 20% (TIGR4) dei topi avevano ceduto, mentre i gruppi di controllo solo IAV non hanno iniziato a soccombere fino al giorno 5 dopo la sfida (Figura 2D). I topi co-infettati con S. pneumoniae EF3030 e IAV avevano sintomi ritardati, più simili ai controlli solo IAV (Figura 2D). Questi risultati dimostrano che il modello di co-infezione provoca la malattia in giovani topi sani che è dipendente dal ceppo batterico, il che lo rende ideale per esplorare i fattori batterici richiesti in ogni fase della progressione della malattia.

Questo modello è stato utilizzato per valutare la presenza di varie cellule immunitarie nei polmoni (tipi di cellule e strategia di gating in Figura 3) a seguito di infezione da IAV in topi inoculati per via intranasale con diversi ceppi di S. pneumoniae. I ceppi batterici D39 e TIGR4, che si sono dispersi nei polmoni dopo l'infezione da IAV, hanno provocato un aumento significativo al di sopra del basale (non infetti) nell'afflusso di cellule immunitarie infiammatorie dalla circolazione, come neutrofili (PMN) e monociti, mentre EF3030 non lo ha fatto (Figura 4A-C). L'infezione da IAV da sola ha provocato un aumento significativo al di sopra del basale nell'afflusso di cellule immunitarie importanti per la difesa dell'ospite contro l'infezione virale, come le cellule NK e le cellule T gamma-delta (Figura 4A-C). Queste risposte antivirali sono state significativamente attenuate nei topi infettati per via intranasale da S. pneumoniae prima della sfida virale (Figura 4A-C). Ciò è coerente con studi precedenti che valutavano le risposte delle citochine che hanno scoperto che il trasporto di S. pneumoniae attenuava la produzione di interferoni di tipo I e comprometteva la capacità dell'ospite di controllare i carichi IAV nei polmoni23. Questi risultati dimostrano che il modello di co-infezione può essere utilizzato per studiare come le risposte immunitarie cambiano nelle infezioni mono rispetto a quelle polimicrobiche.

Questo modello è stato utilizzato anche per valutare l'effetto dell'invecchiamento sul decorso della malattia a seguito di infezione da IAV in topi infettati per via intranasale con S. pneumoniae TIGR4. Nei topi infettati singolarmente, i titoli virali non variavano tra le coorti giovani e anziane (Figura 5A)23. Come negli studi precedenti23, i topi anziani hanno mostrato segni di malattia più precoci e significativamente più gravi rispetto alle loro controparti giovani, come dimostrato dai punteggi clinici più elevati (Figura 5B). Coerentemente con i sintomi della malattia, i topi anziani inoculati con S. pneumoniae hanno iniziato a morire più velocemente entro 24 ore dall'infezione IAV e tutti hanno ceduto alla malattia, mentre i giovani controlli sono sopravvissuti all'infezione con un tasso significativamente più alto (33%) (Figura 5C). Questi risultati dimostrano che il modello di co-infezione può essere utilizzato per rilevare la malattia più grave negli ospiti vulnerabili, rendendolo ideale per esplorare i fattori dell'ospite che conferiscono resistenza o suscettibilità alla co-infezione.

Figura 1: Cronologia della co-infezione e del trattamento degli organi per la valutazione dell'afflusso di cellule immunitarie e del carico patogeno . (A) Streptococcus pneumoniae sono coltivati in biofilm. (B) I topi vengono inoculati per via intranasale con 5 × 106 CFU del ceppo indicato di S. pneumoniae coltivato con biofilm per stabilire il trasporto nasofaringeo o non trattati. Quarantotto ore dopo, i topi vengono fintamente trattati con PBS o ricevono 200 PFU del virus dell'influenza A PR8 per via intranasale e 20 PFU per via intratracheale. I topi vengono monitorati nel tempo per i punteggi clinici della malattia e la sopravvivenza. (C) A 48 ore dopo l'infezione da IAV, vengono valutati i CFU batterici o i PFU virali nei diversi organi o l'afflusso di cellule immunitarie nei polmoni. Abbreviazioni: CFU = unità formanti colonie; PFU = unità formanti placca; IAV = virus dell'influenza A PR8; IT = intratrachealmente; NP = nasofaringea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: La doppia infezione da IAV intranasale/intratracheale di topi inoculati da S. pneumoniae porta alla diffusione batterica e alla malattia che dipende dal ceppo batterico. I topi maschi C57BL/6 (B6) giovani (10-12 settimane) sono stati infettati come nella Figura 1. I numeri batterici nel rinofaringe (A), nei polmoni (B) e nel sangue (C) sono stati tutti determinati a 48 ore dopo l'infezione IAV. (B,C) Le percentuali indicano la frazione di topi che hanno mostrato diffusione. (D) La sopravvivenza è stata monitorata per 10 giorni dopo l'infezione da IAV. Vengono mostrati i dati aggregati di (A,B) n = 5, (C) n = 11 e (D) n = 6 topi per gruppo. Ogni cerchio corrisponde a un mouse e le linee tratteggiate indicano il limite di rilevamento. (A-C) *, indica una differenza significativa (p < 0,05) tra i gruppi indicati come determinato dal test di Kruskal-Wallis. (D) *, indica una differenza significativa (p < 0,05) tra topi +sp e Co-inf per ceppo batterico come determinato dal test log-rank (Mantel-Cox). Abbreviazioni: +sp = topi infettati per via intranasale con batteri utilizzando solo il ceppo indicato; Co-inf = topi infetti da batteri che sono stati infettati da IAV; IAV = topi che hanno ricevuto il virus dell'influenza A; CFU = unità formanti colonie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Strategia di gating delle cellule immunitarie. I polmoni sono stati raccolti e l'afflusso di cellule immunitarie è stato determinato mediante citometria a flusso. Viene mostrata la strategia di gating rappresentativa dei diversi tipi di cellula. (A) CD45+, singole cellule vive sono state controllate e le percentuali di (B) PMN (Ly6G+, CD11b+), macrofagi (Ly6G-, Ly6C-, F480+) e monociti (Ly6G-, Ly6C+), (C) DC (Ly6G-, CD11c+) e cellule NK (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ e CD8 (CD8+, TCRβ+) e CD4 (CD4+, TCRβ+ ) Sono state determinate le cellule T. Abbreviazioni: SSC-A = area laterale scatter-peak; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-W = larghezza del picco di dispersione laterale; L/D = vivi/morti; FMO = fluorescente meno uno; NK = natural killer; PMN = leucocita polimorfonucleato; DC = cellula dendritica; TCR = Recettore delle cellule T. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Le risposte immunitarie polmonari sono dipendenti dal ceppo batterico. I topi maschi C57BL / 6 giovani (10-12 settimane) non erano infetti, inoculati singolarmente con il ceppo indicato di Streptococcus pneumoniae (+sp), singolarmente sfidati con IAV (IAV) o co-infettati con S. pneumoniae e IAV (Co-inf). Quarantotto ore dopo l'infezione da IAV (vedi il disegno sperimentale in Figura 1), i polmoni sono stati raccolti e l'afflusso di cellule immunitarie è stato determinato mediante citometria a flusso seguendo la strategia di gating in Figura 3. (A) Le percentuali medie di ciascun tipo di cellula indicato all'interno del gate CD45 sono visualizzate per tutti i gruppi di trattamento sulla mappa di calore. (B) Per ciascun gruppo di topi sono mostrati grafici a punti rappresentativi di tipi di cellule che hanno mostrato differenze significative tra i trattamenti. (C) Sono indicate le percentuali dei tipi di cellule immunitarie indicate. Ogni cerchio corrisponde a un mouse. (A,C) Vengono mostrati i dati aggregati di n = 5 topi per gruppo. *, indica una differenza significativa (p < 0,05) tra Co-inf e non infetti; $, indica un significativo tra IAV e non infetti; #, indica una differenza significativa tra Co-inf e IAV da solo. Le differenze significative tra i gruppi di sfida per ciascun tipo di cellula sono state determinate da ANOVA seguito dal test di Tukey. Abbreviazioni: NK = natural killer; PMN = leucocita polimorfonucleato; DC = cellula dendritica; TCR = recettore delle cellule T; IAV = virus dell'influenza A. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Invecchiamento e aumento della suscettibilità dell'ospite alla co-infezione IAV/Streptococcus pneumoniae . Topi maschi giovani (10-12 settimane) e invecchiati (21-22 mesi) C57BL/6 sono stati co-infettati con S. pneumoniae TIGR4 i.n. e IAV i.n. e i.t. (come nella Figura 1) o singolarmente sfidati con IAV da solo. (A) I titoli virali sono stati determinati 48 ore dopo. Gli asterischi indicano la significatività statistica (p < 0,05) determinata dal test t dello studente. I dati sono raggruppati da n = 4 topi per gruppo. (B) Il punteggio clinico e (C) la sopravvivenza sono stati monitorati nel tempo. (B) Viene mostrata la media ± SEM aggregati da n = 6 topi per gruppo. Gli asterischi indicano la significatività statistica (p < 0,05) tra i topi giovani e quelli anziani al punto temporale indicato, come determinato dal test di Mann-Whitney. (C) I dati sono raggruppati da n = 6 topi per gruppo. Gli asterischi indicano la significatività statistica (p < 0,05) tra topi giovani e vecchi come determinato dal test log-rank (Mantel-Cox). Abbreviazioni: IAV = virus dell'influenza A; i.n. = per via intranasale; i.t. = intratrachealmente; SEM = errore standard della media. La Figura 5A è ristampata con il permesso di Joma et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Mix I, II, III e IV stock di CDM. Abbreviazione: CDM = mezzi chimicamente definiti.

Tabella 2: Mix di vitamine per CDM. Abbreviazione: CDM = mezzi chimicamente definiti.

Tabella 3: Stock di aminoacidi per CDM. Abbreviazione: CDM = mezzi chimicamente definiti.

Tabella 4: Starter stock e supplementi finali per CDM. Abbreviazione: CDM = mezzi chimicamente definiti.

Tabella 5: Pannello anticorpali 1.

Tabella 6: Pannello anticorpali 2.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.