La coltura in vitro è un metodo di rilevamento diretto per la presenza di batteri viventi. Questo protocollo descrive i metodi per la coltura di diverse spirochete Borrelia, comprese quelle del complesso Borrelia burgdorferi sensu lato, della febbre recidivante delle specie Borrelia e della Borrelia miyamotoi. Queste specie sono esigenti e a crescita lenta, ma possono essere coltivate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Metodi di coltivazione delle spirochete di Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex e febbre recidivante Borrelia
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La Borrelia è costituita da tre gruppi di specie, quelle del gruppo Borreliosi di Lyme (LB), noto anche come B. burgdorferi sensu lato (s.l.) e recentemente riclassificato in Borreliella, il gruppo della febbre recidivante (RF) Borrelia e un terzo gruppo di spirochete associate ai rettili. I metodi basati sulla coltura rimangono il gold standard per il rilevamento in laboratorio di infezioni batteriche sia per la ricerca che per il lavoro clinico, poiché la coltura di agenti patogeni da fluidi corporei o tessuti rileva direttamente agenti patogeni replicanti e fornisce materiale di partenza per la ricerca. Le spirochete Borrelia e Borreliella sono fastidiose e a crescita lenta, e quindi non sono comunemente coltivate per scopi clinici; Tuttavia, la cultura è necessaria per la ricerca. Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare con successo spirochete LB e RF, comprese tutte le specie riconosciute del complesso B. burgdorferi s.l. tra cui B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis espirochete RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis e B. miyamotoi. Il terreno di base per la coltivazione di spirochete LB e RF è il mezzo Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), che supporta in modo affidabile la crescita delle spirochete nelle culture consolidate. Per essere in grado di coltivare isolati di Borrelia appena isolati da campioni derivati da zecche o ospiti in cui il numero iniziale di spirochete è basso nell'inoculo, è preferibile il mezzo Kelly-Pettenkofer (MKP) modificato. Questo mezzo supporta anche la crescita di B. miyamotoi. Il successo della coltivazione delle spirochete RF dipende anche in modo critico dalla qualità degli ingredienti.
Introduzione
Borrelia è un genere di batteri spirocheta che comprende tre cladi principali: il gruppo della borreliosi di Lyme (LB), il gruppo della febbre recidivante (RF) e un gruppo meno ben caratterizzato apparentemente limitato ai rettili. La tassonomia di Borrelia è in continua evoluzione con l'avvento di metodologie molecolari che consentono confronti tra genoma e proteoma, come è vero per la maggior parte degli altri gruppi tassonomici 1,2,3,4,5,6,7.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università e / o della struttura medica pertinente e il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti prima che i campioni fossero raccolti. Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida del Comitato etico istituzionale per gli animali. Se del caso, sono state ottenute le approvazioni per il campionamento ambientale.
NOTA: Il successo della cultura dipende in modo critico dalla qualità degli ingredienti. Il terreno commerciale BSK è ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I terreni di coltura Borrelia BSK e MKP, e le varianti, sono terreni di coltura ricchi con ingredienti che devono essere preparati e sterilizzati in sequenza. Se preparato correttamente, il terreno BSK deve essere rosso-arancio e chiaro (Figura 1). La torbidità e le precipitazioni che persistono dopo il riscaldamento indicano ingredienti problematici, produzione media o contaminazione; Tale mezzo è meglio scartarlo. Se la gelatina viene aggiunta a BSK e con MKP, il mezzo sarà gelati.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La coltura di laboratorio dei batteri è il trampolino di lancio per la ricerca. Il profondo vantaggio conferito dalla capacità di cultura è esemplificato dalla lotta, nel corso di oltre un secolo culminata solo recentemente nel successo, alla cultura Treponema pallidum, la spirocheta che è l'agente eziologico della sifilide44. Le spirochete Borrelia sono anche impegnative per la cultura, ma la cultura è possibile 23,24,34,44,45,46,47,48,49.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Natural Science and Engineering Research Council of Canada e dalla Canadian Lyme disease Foundation (AB e VL), dal Consiglio svedese delle ricerche (SB, M-LF e IN), DAL PROGETTO TAČR GAMA 2 - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG e NR), e da una sovvenzione del Ministero della Salute della Repubblica Ceca NV19-05-00191 (MG e NR). Ringraziamo S. Vranjes (2021, Rudenko lab) per l'immagine in Figura 4 e J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) per le immagini in Figura 5. Ringraziamo tutti i ricercatori che hanno contribuito al campo e ci scusiamo con coloro il cui lavoro ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 1,7 mL | VWR | 87003-294 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| 0,2 µ m Filtro siringa sterile | VWR | 28145-501 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| 10 µ Puntale per pipetta con barriera L | Neptune | BT10XLS3 | Articolo standard: qualsiasi fornitore eseguirà |
| pipette sierologiche da 10 ml. | Celltreat | 229011B | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| 1000 µ Puntale per pipetta con barriera L | Neptune | BT1000.96 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| una provetta da 15 ml | Celltreat 188261 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà | |
| 20 &; Puntale per pipetta con barriera L | Neptune | BT20 | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| una siringa sterile da 20 ml | BD | 309661 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| 200 µ Puntale per pipetta barriera L | Neptune | BT200 | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| provette di coltura con tappo a vite da 25 mL | Scientific | 14-933C | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| pipette sierologiche da 25 mL Celltreat | 229025B | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà | |
| 3 mL Siringa sterile | BD | 309657 | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| 35% di BSA | Sigma | A-7409 | La fonte è importante - vedere la nota |
| Pipette sierologiche da 5 ml | Celltreat | 229006B | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| provette da 50 ml | Celltreat | 229421 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| provette di vetro MKP da 6,5 ml... | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Amfotericina B | Sigma | A9528-100MG | articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Bactrim / rimetoprim / sulfametossazolo | Sigma | PHR1126-1G | articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| BBL Brucella brodo | BD | 211088 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Armadio di biosicurezza | Labconco | 302419100 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Provette per la raccolta del sangue (parte superiore gialla - ACD) | Fisher Scientific | BD Provette per la raccolta del sangue in vetro Vacutainer con destrosio acido citrato (ACD) | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| BSK-H Medium [con 6% di siero di coniglio] | Darlynn biologicals | BB83-500 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| centrifuga | Eppendorf | modello 5430 | Articolo standard - qualsiasi fornitore lo farà |
| Acido citrico TrisodiumSaltDihydrate | Sigma | C-8532 100 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 mL | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Tubi criogenici (Nalgene) | Fisher Scientific | 5000-0020 | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| Deep Petri con anello di impilamento 100 mm & volte; 25 mm | Sigma | P7741 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Incubatore digitale | VWR | modello 1545 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Filtri per la sterilizzazione dei | filtriMillipore 0,22μ m Membrana GPExpressPLUS | SCGPU05RE | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Gelatina | Difco BD | 214340 500 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Provette per coltura in vetro | Fisher Scientific | 99449-20 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Glucosio | Sigma | G-7021 1 kg | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Hemafuge (Ematocrito & Centrifuga immuno-ematologica ) | Labwissen | Modello 3220 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore eseguirà |
| N-acetilglucoseamina | Sigma | A-3286 25 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore lo farà |
| Neubauer Ematocitometro | Sigma | Z359629 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| il microscopio a contrasto di fase | Leitz | Standard item - qualsiasi fornitore farà | |
| Phosphomycin | Sigma | P5396-1G | Standard item - qualsiasi fornitore farà |
| Phosphomycine | Sigma | P5396 | Standard item - qualsiasi fornitore farà |
| Pipetboy | Integra | Standard item - qualsiasi fornitore farà | |
| Precision Standard Balance | OHAUS | modello TS200S | Standard item - qualsiasi il fornitore farà |
| l'acido piruvico (sale Na) | Sigma | P-8574 25 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| il siero di coniglio. | Gibco | 16-120-032 | La fonte è importante |
| Siero di coniglio | Sigma | R-4505 100 mL | La fonte è importante |
| Rifampicina | Sigma | R3501-1G | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S-5761 500 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Sufametaxazolo | Sigma | PHR1126 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 100 g | Articolo standard - qualsiasi fornitore lo farà |
| Pipette di trasferimento | VWR | 470225-044 | Articolo standard - qualsiasi fornitore farà |
| Trimetoprim | Sigma PHR1056 | articolo standard - qualsiasi fornitore lo farà |
Riferimenti
- Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
- Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
