Il terreno privo di fenolo rosso/siero fetale bovino è un'opzione migliore rispetto all'RPMI avanzato per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione delle cellule caliciformi congiuntivali nello studio delle differenze basate sul sesso.
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Articolo metodologico
In vitro Metodo per studiare le differenze basate sul sesso nelle cellule caliciformi congiuntivali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'occhio secco è una malattia multifattoriale che colpisce la salute della superficie oculare, con una prevalenza profondamente più elevata nelle donne. La rottura della mucina gelificante secreta dalle cellule caliciformi congiuntivali (CGC) sulla superficie oculare contribuisce a molteplici malattie della superficie oculare. L'eliminazione degli ormoni sessuali esogeni è essenziale per ottenere risultati coerenti durante lo studio in vitro delle differenze basate sul sesso nei CGC. Questo articolo descrive un metodo per ridurre al minimo la presenza di ormoni esogeni nello studio delle differenze basate sul sesso nei CGC mantenendo la loro funzione fisiologica. I CGC di donatori umani post-mortem di entrambi i sessi sono stati coltivati da pezzi della congiuntiva in terreno RPMI con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (indicato come il terreno completo) fino alla confluenza. Circa 48 ore prima dell'inizio degli esperimenti, i CGC sono stati trasferiti in un terreno RPMI senza rosso fenolo o FBS ma con l'1% di BSA (indicato come mezzo privo di rosso fenolo). La normale funzione cellulare è stata studiata misurando l'aumento della stimolazione intracellulare [Ca2+] ([Ca2+]i) dopo stimolazione con carbacolo (Cch, 1 x 10-4 M) utilizzando la microscopia fura 2/acetossimetile (AM). Il risultato mostra che i CGC hanno mantenuto la normale funzione nei terreni privi di rosso fenolo dopo 48 ore. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella risposta [Ca2+]i tra il terreno RPMI privo di rosso fenolo e il terreno completo dopo stimolazione Cch. Pertanto, si consiglia di utilizzare il terreno RPMI privo di rosso fenolo con l'1% di BSA per eliminare gli ormoni esogeni senza alterare la normale funzione dei CGC nello studio delle differenze basate sul sesso.
Introduzione
Le differenze basate sul sesso influenzano molteplici processi della superficie oculare 1,2,3. La manifestazione clinica di queste differenze basate sul sesso è la differenza nella prevalenza di molte malattie della superficie oculare tra uomini e donne, come l'occhio secco e la congiuntivite 4,5,6. L'evidenza suggerisce che le differenze basate sul sesso derivano da più livelli biologici, compresi i diversi profili dei geni sui cromosomi X e Y7 e gli effetti ....
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Protocollo
Tutti i tessuti umani sono stati donati alla banca degli occhi con il previo consenso informato e l'autorizzazione del donatore per l'uso nella ricerca scientifica. L'uso del tessuto congiuntivale umano è stato esaminato dal Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee ed è risultato esente e non conforme alla definizione di ricerca con soggetti umani.
1. Colture primarie di cellule di calici umani
- Dalla banca degli occhi, ricavare il tessuto congiuntivale umano16.
- Preparare il terreno di coltura, il terreno di coltura RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FB....
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Risultati
I CGC umani nella coltura primaria crescono fino all'80% di confluenza in circa 14 giorni. Il tipo di cellula è stato confermato mediante colorazione in immunofluorescenza con anticorpi contro i marcatori delle cellule caliciformi CK7 e HPA-125 (Figura 1). Anche se la rimozione di FBS dal mezzo può eliminare gli ormoni sessuali, la mancanza di FBS potrebbe potenzialmente influenzare la risposta cellulare. Per verificare il metodo di eliminazione ormonale, è stato util.......
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Discussione
Studiare le differenze basate sul sesso nei tessuti oculari aiuta a comprendere i processi delle malattie, in particolare l'occhio secco e la congiuntivite allergica, che colpiscono in modo sproporzionato un sesso 4,5,6. Anche se i modelli animali possono essere utilizzati per questi studi, i dati ottenuti direttamente dal tessuto umano sono essenziali a causa della massima somiglianza con le cellule umane in vivo. I te.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro è finanziato dal National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% di tripsina con 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico acido | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Siero fetale Bovin | R& D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetossimetile estere | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Tessuto congiuntivale umano | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| sale inorganico per tampone KRB | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Qualsiasi marca funzionerà | |
| L-glutammina | Lonza Group (Basilea, Svizzera) | 17-605F | |
| aminoacidi non essenziali | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillina/streptomicina | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| media RPMI senza rosso fenolo | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Acido pluronico F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| Terreno di coltura RPMI-1640 | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| bisturi | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Qualsiasi bisturi chirurgico sterile può funzionare |
| con piruvato di sodio | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpirazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Riferimenti
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al.
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Ristampe e permessi
