Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (<250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.
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Articolo metodologico
Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le fibre di collagene I allineato (COL1) guidano la motilità delle cellule tumorali, influenzano la morfologia delle cellule endoteliali, controllano la differenziazione delle cellule staminali e sono un segno distintivo dei tessuti cardiaci e muscoloscheletrici. Per studiare la risposta cellulare a microambienti allineati in vitro, sono stati sviluppati diversi protocolli per generare matrici COL1 con allineamento delle fibre definito, inclusi metodi magnetici, meccanici, cellulari e microfluidici. Di questi, gli approcci microfluidici offrono funzionalità avanzate come un controllo accurato dei flussi di fluidi e del microambiente cellulare. Tuttavia, gli approcci microfluidici per generare matrici COL1 allineate per piattaforme di coltura in vitro avanzate sono stati limitati a sottili "tappetini" (<40 μm di spessore) di fibre COL1 che si estendono su distanze inferiori a 500 μm e non sono favorevoli alle applicazioni di coltura cellulare 3D. Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare matrici 3D COL1 (130-250 μm di spessore) con regioni su scala millimetrica di allineamento delle fibre definito in un dispositivo microfluidico. Questa piattaforma fornisce funzionalità avanzate di coltura cellulare per modellare microambienti tissutali strutturati fornendo accesso diretto alla matrice microingegnerizzata per la coltura cellulare.
Introduzione
Le cellule risiedono in una complessa rete fibrosa 3D chiamata matrice extracellulare (ECM), la maggior parte della quale è composta dalla proteina strutturale collagene di tipo I (COL1)1,2. Le proprietà biofisiche dell'ECM forniscono indicazioni alle cellule e, in risposta, le cellule rimodellano la microarchitettura ECM 3,4,5. Queste interazioni reciproche cellula-matrice possono dare origine a domini di fibre COL1 allineati6 che promuovono l'angiogenesi e l'invasione ce....
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Protocollo
1. Fabbricazione del canale a due pezzi e della base della piattaforma modulare
NOTA: Il canale microfluidico è costruito utilizzando due parti: il "cutout" del canale microfluidico, che è tagliato a rasoio da un foglio di polidimetil silossano (PDMS) di spessore definito e il coperchio del canale, che si lega reversibilmente al ritaglio e forma il canale. Il canale è circondato da un telaio in poli(metacrilato di metile) (PMMA) che fungerà da serbatoio di supporti (Figura 1). Il telaio in PMMA può anche essere utilizzato per bloccare magneticamente moduli specializzati per una maggiore funzional....
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Risultati
Quando una soluzione COL1 autoassemblante scorre attraverso un canale con area di sezione trasversale decrescente, la velocità del flusso (v x) della soluzione di COL1 aumenta localmente di una grandezza, ∂v x, lungo la lunghezza della costrizione tra i due segmenti (∂x), risultando in una velocità di deformazione estensionale (ε̇) dove ε̇ = ∂v x/∂x. La velocità di deformazione estensionale può essere calcolata dalla velocità del fluido, che viene misurata utilizzando la velocimetria a im.......
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Discussione
I protocolli per generare matrici COL1 con fibre allineate sono stati descritti utilizzando metodi magnetici, l'applicazione diretta di deformazioni meccaniche e tecniche microfluidiche47. Gli approcci microfluidici sono comunemente usati per creare sistemi microfisiologici a causa delle loro caratteristiche di flusso e trasporto ben definite, che consentono un controllo preciso sul microambiente biochimico. Poiché le fibre COL1 allineate forniscono segnali istruttivi chiave durante i processi fis.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health con il numero di premio R21GM143658 e dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzione 2150798. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale delle agenzie di finanziamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (3-amminopropil)trietossisilano, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Punta di erogazione angolata | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" diametro x 1/16" di spessore Magnete nichelato | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENTE ≥ 99,5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORIO TRATTAMENTO CORONA | Prodotti Electro-Technic | 12051A | |
| Albumina sierica bovina (BSA), frazione V, 98%, grado reagente, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Lastra acrilica colata trasparente | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL di tripsina 10x, 2,5% di tripsina in HBSS [-] calcio, magnesio, rosso fenolo, parvovirus suino Testato | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI - Università del Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldeide 50% in soluzione acquosa, Grado di reagente, Confezione=Flacone in HDPE, Dimensioni=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 m) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Gomma siliconica ad alta purezza .010" di spessore, 6" x 8" Foglio, durometro 55A | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Cellule endoteliali della vena ombelicale umana | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanolo | Fisher Scientific | A4154 | |
| Taglierina laser | Full Spectrum | 20x12 serie | |
| Pompa a siringa microfluidica | Era Pompe a siringa | NE-1002X | |
| Microman E Pipettatore a canale singolo, Gilson, modello M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Sonde molecolari Alexa Fluor 488 Falloidina | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Sonde molecolari Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7,4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 10x), con Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Foglio di supporto di ricambio per mestiere graphtec ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Siringa in plastica 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Wafer di silicone Wafer | universitario | 452 | |
| Idrossido di Sodio, ACS, Confezione=Bottiglia in polietilene, Dimensioni=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4),....
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Ristampe e permessi
