Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Summary

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Abstract

L'aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l'aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all'aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell'assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l'MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l'anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l'APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l'insorgenza dell'anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l'uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell'integrità del SAC.

Introduction

L'aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi¹. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi².

Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo d....

Protocol

Tutti i topi utilizzati in questi protocolli sono stati ospitati e allevati secondo il Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali della Rutgers University (protocollo 201702497) e le linee guida del National Institutes of Health. Questi organismi di regolamentazione hanno approvato tutte le procedure sperimentali che coinvolgono studi sugli animali. Tutti i topi utilizzati nel presente studio erano femmine CF-1 di 6-8 settimane.

1. Preparazione sperimentale

1. Prima di iniziare le valutazioni SAC, raccogliere ovociti di topo seguendo il rapporto¹² precedentemente pubblicato. Divi....

Results

Valutazione della risposta al SAC mediante trattamento con nocodazolo
Lo scopo di questo esperimento è valutare l'attivazione e la forza del SAC. Utilizzando il nocodazolo per depolimerizzare i microtubuli del fuso, tutti i cinetocori saranno scollegati, il che causerà un arresto del ciclo cellulare mediato da SAC. Nell'attuale sistema di imaging, gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone (Figura 1.......

Discussion

Il checkpoint di assemblaggio del mandrino è un meccanismo di controllo critico durante la divisione cellulare progettato per prevenire errori di segregazione cromosomica. Consente alla cellula di avere abbastanza tempo per correggere gli attacchi KT-MT impropri. La meiosi negli ovociti è un processo soggetto a errori, in cui la maggior parte della mis-segregazione cromosomica si verifica durante la meiosi I, portando alla generazione di uova aneuploidi che sono la principale causa di aborti precoci e infertilità nell'uo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimetil-solfossido (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Microscopio
a fluorescenzaEVOS Incubatore Onstage	Life Technologies		Camera dell'incubatore
Fondo in vetro Piastre a 96 pozzetti N 1.5 non rivestito	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
capra-anti-umano-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
umani anti-ACA	incorporati	15-234	Diluizione 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 dotato di un obiettivo a immersione in olio 63×, 1.40 NA	Leica
MgSO4· 7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazolo	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti-MAD2	Biolegend	924601	Diluizione 1/1000; precedentemente Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Laboratori vettoriali Vectashield		H-1000