Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Mansour Aboelenain; Karen Schindler; Cecilia S. Blengini

doi:10.3791/64459

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Articolo metodologico

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

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DOI:

10.3791/64459

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13 settembre 2022

Mansour Aboelenain¹^,²^,³ , Karen Schindler¹^,² , Cecilia S. Blengini¹^,²

¹Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, ²Human Genetics Institute of New Jersey, ³Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

In questo articolo

Sommario

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Abstract

L'aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l'aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all'aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell'assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l'MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l'anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l'APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l'insorgenza dell'anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l'uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell'integrità del SAC.

Introduzione

L'aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi¹. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi².

Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo d....