Articolo metodologico

Modellazione dello sviluppo cerebellare umano in vitro nella struttura 2D

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 settembre 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo spiega la generazione di un monostrato 2D di cellule cerebellari da cellule staminali pluripotenti indotte per studiare le prime fasi dello sviluppo cerebellare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo preciso e tempestivo del cervelletto è fondamentale non solo per un'accurata coordinazione motoria e l'equilibrio, ma anche per la cognizione. Inoltre, l'interruzione dello sviluppo cerebellare è stata implicata in molti disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui l'autismo, il disturbo da deficit di attenzione-iperattività (ADHD) e la schizofrenia. Le indagini sullo sviluppo cerebellare negli esseri umani sono state precedentemente possibili solo attraverso studi post-mortem o neuroimaging, ma questi metodi non sono sufficienti per comprendere i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano in vivo durante lo sviluppo precoce, che è quando hanno origine molti disturbi dello sviluppo neurologico. L'emergere di tecniche per generare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) da cellule somatiche e la capacità di ridifferenziare ulteriormente le iPSC in neuroni hanno spianato la strada alla modellazione in vitro dello sviluppo precoce del cervello. Il presente studio fornisce passaggi semplificati verso la generazione di cellule cerebellari per applicazioni che richiedono una struttura monostrato 2-dimensionale (2D). Le cellule cerebellari che rappresentano le prime fasi di sviluppo sono derivate dalle iPSC umane attraverso le seguenti fasi: in primo luogo, i corpi embrioidi sono realizzati in coltura 3-dimensionale (3D), quindi sono trattati con FGF2 e insulina per promuovere la specifica del destino cerebellare e, infine, sono differenziati terminalmente come monostrato su substrati rivestiti di poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A 35 giorni di differenziazione, le colture cellulari cerebellari derivate da iPSC esprimono marcatori cerebellari tra cui ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, suggerendo che questo protocollo genera precursori neuronali cerebellari glutammatergici e GABAergici, nonché progenitori delle cellule di Purkinje. Inoltre, le cellule differenziate mostrano una morfologia neuronale distinta e sono positive per marcatori di immunofluorescenza dell'identità neuronale come TUBB3. Queste cellule esprimono molecole guida assonali, tra cui semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e potrebbero servire come modello per studiare i meccanismi molecolari della crescita dei neuriti e della connettività sinaptica. Questo metodo genera neuroni cerebellari umani utili per applicazioni a valle, tra cui studi di espressione genica, fisiologici e morfologici che richiedono formati monostrato 2D.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendere lo sviluppo cerebellare umano e le finestre temporali critiche di questo processo è importante non solo per decodificare le possibili cause dei disturbi dello sviluppo neurologico, ma anche per identificare nuovi bersagli per l'intervento terapeutico. La modellazione dello sviluppo cerebellare umano in vitro è stata impegnativa, ma nel tempo sono emersi molti protocolli che differenziano le cellule staminali embrionali umane (hESC) o iPSC con i destini della linea cerebellare 1,2,3,4,5,6,7,8 . Inoltre, è importante sviluppare protocolli che generino risultati riproducibili, siano relativamente semplici (per ridurre l'errore) e non siano pesanti sui costi monetari.

I primi protocolli per la differenziazione cerebellare sono stati generati da colture 2D da corpi embrioidi placcati (EB), inducendo il destino cerebellare con vari fattori di crescita simili allo sviluppo in vivo, tra cui WNT, BMP e FGF 1,9. Protocolli pubblicati più recenti hanno indotto la differenziazione principalmente nella coltura di organoidi 3D con FGF2 e insulina, seguita da FGF19 e SDF1 per strutture rombiche simili a labbro3,4, o utilizzato una combinazione di FGF2, FGF4 e FGF85. Entrambi i metodi di induzione degli organoidi cerebellari hanno portato a organoidi cerebellari 3D simili poiché entrambi i protocolli hanno riportato un'espressione di marcatori cerebellari simili in punti temporali identici. Holmes e Heine hanno esteso il loro protocollo 3D5 per dimostrare che le cellule cerebellari 2D possono essere generate da hESC e iPSC, che iniziano come aggregati 3D. Inoltre, Silva et al.7 hanno dimostrato che le cellule che rappresentano i neuroni cerebellari maturi in 2D possono essere generate con un approccio simile a Holmes e Heine, utilizzando un punto temporale diverso per passare da 3D a 2D ed estendere il tempo di crescita e maturazione.

L'attuale protocollo induce il destino cerebellare nelle iPSC prive di alimentazione generando corpi embrioidi (EB) fluttuanti utilizzando insulina e FGF2 e quindi placcando gli EB su piatti rivestiti di PLO / laminina il giorno 14 per la crescita e la differenziazione 2D. Entro il giorno 35, si ottengono cellule con identità cerebellare. La capacità di ricapitolare le prime fasi dello sviluppo cerebellare, specialmente in un ambiente 2D, consente ai ricercatori di rispondere a domande specifiche che richiedono esperimenti con una struttura monostrato. Questo protocollo è anche suscettibile di ulteriori modifiche come superfici micromodellate, saggi di escrescenza assonale e ordinamento cellulare per arricchire le popolazioni cellulari desiderate.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca sui soggetti umani è stata approvata sotto il numero di approvazione del comitato di revisione istituzionale dell'Università dell'Iowa 201805995 e il numero di approvazione del comitato per le cellule staminali pluripotenti umane dell'Università dell'Iowa 2017-02. Le biopsie cutanee sono state ottenute dai soggetti dopo aver ottenuto il consenso informato scritto. I fibroblasti sono stati coltivati in DMEM con il 15% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di soluzione di aminoacidi non essenziali MEM a 37 °C e 5% di CO2. I fibroblasti sono stati riprogrammati utilizzando un kit di riprogrammazione episomiale seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un nucleofector per l'elettroporazione. Tutte le procedure sono state eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II tipo A2 ("cappuccio" in breve). Tutti i terreni di coltura cellulare erano privi di antibiotici; Pertanto, ogni componente che è entrato nel cofano è stato pulito con etanolo al 70%. Tutti i terreni e i componenti di coltura cellulare sono stati filtrati sterili o aperti nel cappuccio per mantenere la loro sterilità.

1. Preparazione sperimentale

  1. Preparare piastre rivestite con matrice di membrana basale (BMM).
    NOTA: BMM si solidifica più rapidamente a temperature più calde. Le piastre devono essere preparate rapidamente e immediatamente poste a 4 °C per la conservazione.
    1. Scongelare il BMM (vedi tabella dei materiali) su ghiaccio, a 4 °C per almeno 2 ore, o durante la notte.
    2. Miscelare DMEM/F12 e BMM fino ad una concentrazione finale di 80 μg/ml. Distribuire la soluzione di BMM in piastre di coltura tissutale (1 mL per piatti da 35 mm e 2 mL per piatti da 60 mm) e incubare a 37 °C per almeno 1 ora o per una notte prima di placcare le cellule.
      NOTA: Le stoviglie non utilizzate possono essere conservate a 4 °C per 2 settimane.
  2. Preparare poli-L-ornitina / laminina (PLO / laminina)-piastre rivestite.
    1. Preparare 20 μg/mL di PLO (vedi Tabella dei materiali) in DPBS+/+ sterile e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per una notte a 37 °C nell'incubatore.
    2. Il giorno seguente, aspirare l'OLP con un aspiratore a vuoto e lavare due volte con DPBS+/+. Asciugare all'aria nel cofano.
      NOTA: Le piastre essiccate all'aria possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane, avvolte in un foglio di alluminio, per un uso futuro.
    3. Preparare 10 μg/mL di laminina (vedere Tabella dei materiali) in DPBS+/+ e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare almeno per 3 ore o per una notte a 37 °C nell'incubatore.
    4. Aspirare la laminina con un aspiratore a vuoto e aggiungere 1 mL di DPBS+/+ medio o sterile.
      NOTA: Il rivestimento in lamina non deve asciugarsi. PBS o un terreno di coltura appropriato dovrebbe essere aggiunto immediatamente per evitare che ciò accada. Le piastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  3. Preparare la soluzione di passaggio PSC.
    NOTA: è necessario un osmometro (vedere la tabella dei materiali) per effettuare la soluzione di passaggio PSC10.
    1. Sciogliere 11,49 g di cloruro di potassio (KCl) e 0,147 g di citrato di sodio diidrato (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O) in 400 mL di acqua per coltura cellulare sterile (vedere Tabella dei materiali).
    2. Misurare il volume della soluzione e registrarlo come volume iniziale (Vi).
    3. Misurare l'osmolarità e regolarla a 570 mOsm aggiungendo acqua di coltura cellulare sterile usando la formula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtrare-sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,20 μm e fare 10 ml di aliquote. Conservare le aliquote a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 6 mesi.
  4. Preparare il terreno di coltura con cellule staminali pluripotenti (PSC).
    NOTA: le iPSC sono mantenute in un mezzo contenente FGF2 termostabile (vedere la tabella dei materiali), fornendo un programma di alimentazione senza fine settimana. Altri supporti PSC disponibili in commercio non sono stati provati per questo protocollo.
    1. Scongelare il PSC medio per una notte a 4 °C.
    2. Aggiungere 10 mL di PSC medium supplemento a 500 mL di PSC terreno basale. Produrre 25 mL di aliquote e conservare a -20 °C.
      NOTA: Le aliquote congelate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Le aliquote scongelate devono essere conservate a 4 °C e utilizzate entro 2 settimane. Le cellule possono essere congelate per la conservazione a lungo termine in un mezzo PSC con il 10% (v / v) di dimetilsolfossido (DMSO).
  5. Preparare il mezzo di scongelamento PSC.
    1. Integrare PSC mezzo con 50 nM di cromo, 1,5 μM di emricasan, 1x integratore di poliammina e 0,7 μM trans-ISRIB (cocktail CEPT11) (vedere Tabella dei materiali).
    2. Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
  6. Preparare pipette di vetro tirato.
    1. Tirare pipette Pasteur di vetro da 22,9 cm (9 pollici) in due pezzi sopra un bruciatore Bunsen, ~ 2 cm sotto il collo, creando due pipette, con il lato più sottile ~ 4 cm più corto dell'altro.
    2. Con l'aiuto della fiamma, piegare le punte del lato tirato per creare una "r" liscia.
    3. Posizionare le pipette tirate in manicotti di autoclave e autoclave per la sterilizzazione.
  7. Preparare il mezzo di differenziazione cerebellare (CDM).
    1. Mescolare IMDM e la miscela di nutrienti F12 di Ham in un rapporto 1: 1. Integrare la miscela con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina, concentrato lipidico chimicamente definito all'1% (v/v), 0,45 mM di 1-tio-glicerolo, 15 μL/mL di apotransferrina, 5 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 7 μg/ml di insulina (vedere Tabella dei materiali).
    2. Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 1 mese.
  8. Preparare il mezzo di maturazione cerebellare (CMM).
    1. Integrare il mezzo neurobasale con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina e 1x integratore N-2 (vedi Tabella dei materiali).
    2. Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 2 settimane.

2. Coltura iPSC senza alimentatore

  1. Scongelare le celle seguendo i passaggi seguenti.
    1. Posizionare una piastra BMM (fase 1.1) nell'incubatore a 37 °C per gelificare per almeno 1 ora o durante la notte prima di scongelare le cellule.
    2. Preriscaldare 10 mL di mezzo di scongelamento PSC (fase 1.5) a 37 °C.
    3. Trasferire il crioviale con cellule da azoto liquido a bagnomaria a 37 °C.
      NOTA: Per evitare di generare una fonte di contaminazione nello spazio della coltura cellulare, non è consigliabile utilizzare un bagno d'acqua standard. Invece, l'acqua dolce può essere riscaldata in un piccolo becher a 37 ° C per generare un bagno d'acqua monouso.
    4. Quando rimane un piccolo pezzo di ghiaccio nel tubo, rimuoverlo dal bagnomaria, asciugare il tubo e spruzzare con etanolo al 70%. Trasferire il tubo sulla cappa e utilizzare una pipetta sierologica da 2 mL o 5 mL (vedere Tabella dei materiali) per trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico da 15 ml.
    5. Aggiungere 8 ml di mezzo di scongelamento PSC alle cellule nel senso della goccia mentre si ruota il tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT.
    6. Aspirare con attenzione il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 2 ml di mezzo di scongelamento PSC.
    7. Aspirare il BMM dalla piastra e aggiungere le celle risospese a goccia su tutta la piastra per una distribuzione uniforme.
    8. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2. Aggiornare il mezzo il giorno successivo con PSC medium. Successivamente, cambia il mezzo ogni giorno.
  2. Mantenere le celle seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preriscaldare il volume necessario di mezzo PSC a 37 °C (ad esempio, 1 mL di terreno per piastra da 35 mm).
    2. Studiare le piastre per cellule o colonie differenziate e rimuovere le cellule differenziate con una pipetta di vetro tirato (punto 1.6).
      NOTA: le colonie iPSC hanno bordi lisci con celle morfologicamente identiche.
    3. Cambiare il mezzo speso ogni giorno e passare ogni 3-4 giorni o quando viene raggiunta la confluenza del 70%.
  3. Passare le celle.
    1. Posizionare la quantità necessaria di piastre BMM nell'incubatore per almeno 1 ora o durante la notte prima di passare. Preriscaldare la quantità necessaria di PSC (fase 1.3) a 37 °C.
    2. Utilizzando una pipetta di vetro tirato, pulire eventuali cellule o colonie differenziate.
    3. Aspirare il mezzo esaurito con un aspiratore a vuoto e aggiungere il mezzo di dissociazione PSC, 1 mL per piatto da 35 mm. Incubare a 37 °C per 1-3 min.
      NOTA: Se le colonie si sollevano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere il mezzo PSC, il tempo di incubazione può essere ridotto.
    4. Aspirare la soluzione di passaggio PSC e aggiungere il mezzo PSC preriscaldato.
    5. Utilizzando una punta sterile per pipetta da 200 μL, graffiare le linee parallele tra loro in una direzione, ruotare la piastra di 90° e creare una seconda serie di linee di graffio perpendicolari alle precedenti (creando un motivo a tratteggio incrociato attraverso la piastra).
    6. Aspirare la soluzione BMM dalle piastre di fissaggio. Raccogliere le colonie utilizzando una pipetta sierologica e distribuirle su nuove piastre BMM.
    7. Incubare a 37 °C, 5% CO2. Cambia il mezzo ogni giorno.
  4. Congelare le celle.
    1. Preparare i crioviali etichettando il contenuto e sterilizzare sotto la luce ultravioletta (UV) nel cappuccio (vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti.
    2. Preparare il mezzo di congelamento PSC integrando il mezzo PSC con DMSO al 10% (v/v). Seguire i passaggi 2.3.2-2.3.5.
    3. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL con una pipetta sierologica da 5 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT.
    4. Aspirare con cautela il mezzo e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di congelamento PSC.
    5. Distribuire in crioviali. Introdurre i flaconcini in un contenitore di congelamento e porre il contenitore in un congelatore a -80 °C.
    6. Il giorno seguente, trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

3. Differenziazione cerebellare

NOTA: Prima di iniziare la differenziazione, le iPSC vengono passate a sei piatti da 35 mm e sono pronte per la differenziazione quando sono al 70% di confluenza. Ogni piastra da 35 mm verrà trasferita in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti.

  1. Il giorno 0, sollevare le colonie di iPSC sane per la formazione di EB.
    1. Aggiungere 1 mL di CDM (fase 1.7) integrato con 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa (ULA) a 6 pozzetti e collocarli nell'incubatore fino a quando le colonie sollevate sono pronte per essere aggiunte ai pozzetti.
    2. Pulire le celle differenziate utilizzando una pipetta di vetro tirato. Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di soluzione di passaggio PSC per ogni piatto da 35 mm. Incubare per 3 minuti a 37 °C, aspirare e aggiungere 2 mL di CDM integrato con 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542.
      NOTA: Se le colonie si sollevano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere CDM, il tempo di incubazione può essere ridotto.
    3. Sotto un microscopio invertito a luce trasmessa, sollevare delicatamente le colonie usando il bordo piegato della pipetta di vetro tirata usando un ingrandimento 4x. Una volta sollevata ogni colonia, trasferire delicatamente tutto in un pozzetto della piastra ULA a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Ripetere questa procedura per ogni piastra iPSC. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Se le colonie sono troppo grandi o sono unite, possono essere tagliate con la punta della pipetta di vetro tirata per creare EB più piccoli.
  2. Il giorno 2, aggiungere FGF2 a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 50 ng / ml.
    NOTA: L'FGF2 utilizzato per la differenziazione cerebellare non è termostabile. Questo protocollo non è stato testato con FGF2 termostabile.
  3. Il giorno 7, fai un cambio medio di 1/3. Per 3 ml di terreno totale in un pozzetto, con un pipettatore da 1.000 μL, aspirare delicatamente 1 mL di mezzo esaurito e sostituirlo con 1 mL di CDM fresco. Incubare gli EB per 7 giorni.
  4. Il giorno 14, aspirare delicatamente quasi tutto il mezzo esaurito utilizzando un pipettatore da 1.000 μL. Per garantire un danno minimo agli EB, ruotare la piastra per raccogliere tutti gli EB al centro della piastra, quindi inclinare la piastra e aspirare lentamente dal bordo.
    1. Man mano che la quantità media diminuisce, appoggiare lentamente la piastra piatta e continuare ad aspirare. Lasciare abbastanza mezzo per evitare di asciugare gli EB. Successivamente, aggiungere 3 ml di CDM fresco integrato con 10 μM Y-27632. Trasferire gli EB utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL su un piatto rivestito di OLP/laminina (punto 1.2).
      NOTA: A seconda dell'applicazione a valle, gli EB possono essere trasferiti su una piastra PLO/laminina a 6 pozzetti o singoli EB possono essere trasferiti in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita di PLO / laminina o di un coprifoglio.
  5. Il giorno 15, aspirare il mezzo e sostituirlo con CDM fresco.
    NOTA: È importante aggiungere abbastanza terreno ai pozzetti per garantire un mezzo sufficiente tra un'alimentazione e l'altra poiché, nel tempo, ci sarà evaporazione (ad esempio, per un pozzo in una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 3 ml di mezzo). Se il terreno ha iniziato ad acidificarsi (diventa chiaro e giallo), rinfrescare il terreno anche se non è nel programma di alimentazione fino alla fine del protocollo.
  6. Il giorno 21, aspirare il mezzo esaurito e sostituirlo con CMM. Il giorno 28, sostituisci il mezzo con una nuova CMM. Il giorno 35, raccogliere le celle per ulteriori applicazioni.

4. Preparazione del campione per l'isolamento dell'RNA

  1. Aspirare il mezzo e aggiungere 500 μL di reagente di dissociazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Lasciare agire per un paio di secondi e aspirare.
  2. Incubare la piastra, con il coperchio, a temperatura ambiente per 2 min. Picchiettare i lati della piastra per staccare le celle.
  3. Aggiungere 1 mL di CMM (fase 1.8) e raccogliere le celle in una provetta da 1,5 mL.
  4. Pellettare le celle mediante centrifugazione utilizzando una mini centrifuga da banco (vedi tabella dei materiali) per 30 s a RT (velocità massima 2000 x g), scartare il mezzo e aggiungere 1 mL di 1x PBS pH 7,4 per lavare il pellet cellulare.
  5. Pellettare nuovamente le celle utilizzando una mini centrifuga da banco per 30 secondi a RT e lavare nuovamente con PBS.
  6. Pellet le cellule e scartare il PBS. Lisare le cellule nel reagente contenente fenolo e guanidina isotiocianato (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Le cellule lisate in fenolo e isotiocianato contenente reattivo possono essere conservate a -80 °C fino a 1 anno. Le cellule possono essere lisate direttamente nel piatto a seconda del metodo di isolamento dell'RNA e dei reagenti utilizzati. A causa del basso numero di cellule in un piatto, isolare l'RNA usando colonne di spin di silice (vedi Tabella dei materiali) si tradurrà in rese più elevate di RNA.

5. Preparazione delle cellule per la colorazione immunofluorescente

NOTA: Per una piastra a 24 pozzetti, è sufficiente un EB per pozzetto.

  1. Il giorno 35, aspirare il mezzo esaurito e lavare le celle aggiungendo 1 ml di DPBS +/+ per pozzetto (per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti).
  2. Aspirare il DPBS+/+ e aggiungere 500 μL di paraformaldeide fredda al 4% (PFA, vedi Tabella dei materiali) preparata in DPBS+/+ per pozzetto. Incubare per 20 minuti a RT.
  3. Rimuovere il 4% di PFA e lavare le celle due volte con DPBS+/+, come al punto 5.1. Aggiungere 1 mL di DPBS+/+ e conservare le celle a 4 °C fino al termine della colorazione.
    NOTA: Si consiglia di eseguire la colorazione immunofluorescente entro 1 settimana dalla fissazione per evitare il distacco cellulare e la perdita di antigeni. Tuttavia, a seconda dell'anticorpo e della posizione cellulare del bersaglio, la colorazione può essere eseguita in momenti successivi fino a 4 settimane dopo la fissazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Panoramica della differenziazione cerebellare da 3D a 2D
Le cellule cerebellari sono generate a partire da iPSC. La Figura 1A mostra il flusso di lavoro complessivo e l'aggiunta di componenti principali per la differenziazione. Il giorno 0, gli EB vengono realizzati sollevando delicatamente le colonie iPSC (Figura 1B) utilizzando una pipetta di vetro tirata in CDM contenente SB431542 e Y-27632 e posizionati in piastre di fissaggio ultra-basse...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità di modellare lo sviluppo cerebellare umano in vitro è importante per la modellazione della malattia e per promuovere la comprensione del normale sviluppo del cervello. Protocolli meno complicati ed economici creano maggiori opportunità per la generazione di dati replicabili e un'ampia implementazione in più laboratori scientifici. Un protocollo di differenziazione cerebellare è descritto qui utilizzando un metodo modificato di generazione di EB che non richiede enzimi o agenti di dissociazione, utili...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Jenny Gringer Richards per il suo accurato lavoro nella convalida dei nostri soggetti di controllo, da cui abbiamo generato le iPSC di controllo. Questo lavoro è stato supportato da NIH T32 MH019113 (a D.A.M. e K.A.K.), dal Nellie Ball Trust (da T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (da V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.), e dal Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). Le figure sono state create con BioRender.com.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipetta sierologica da 10 mLFisher Scientific13-678-26D
1-tio-gliceroloSigmaM6145
Pipetta sierologica da 2 mLFisher Scientific13-678-26B
Unità filtrante da 250 mL, 0,2 &; m aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Piastra per clutura tissutaleFalcon353001
Unità centrale Nucleofector 4DLonza276885Nucleofector
5 mL Pipetta sierologicaFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Piastra per coltura tissutaleFalcon353004
6 pozzetti piastre di fissaggio ultra-basseCorning3471
9" Pipette Pasteur usa e gettaFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinaSigmaT1147
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA9418
Acqua per colture cellulariCytivaSH30529.02
Concentrato lipidico chimicamente definitoGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Classe II, Tipo A2, Armadio di sicurezza biologicaNuAire, Inc.Cappa NU-540-600, luce UV,
piastra Costar a 24 pozzetti, piastraCorning3526
Costar a 6 pozzettiCorning3516
DAPIThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (dimetly solfossido)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Kit di riprogrammazione iPSC episomiale Epi5Life TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium con FGF2
EVOS XL Core Imaging systemLife TechnologiesAMEX1000
Siero fetale bovino - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX integratoreGibco35050061L-alanina-L-glutammina
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i Incubatore a CO2Thermo Scientific50144906
Umano Anti-EN2, topoSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Umano anti-Ki67/MKI67, coniglioR& D SystemsMAB7617
Umano anti-PTF1a, coniglioNovus BiologicalsNBP2-98726
Umano anti-TUBB3, topoBiolegend801213
IMDMGibco 12440053
InsulinaGibco12585
Laminina Proteina di topoGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Matrice a membrana basale
MEM-NEAAGibco11140050
Mini centrifugaLabnet InternationalC1310Mini centrifuga da banco
Kit di pulizia dell'RNA Monarch (50 &; g)New England BioLabsT2040Colonne di spin in silice
Kit di minipreparazione per RNA totale Monarch NewEngland BioLabsT2010Colonne di spin in silice
Integratore N-2Gibco17502-048
Mezzo neurobasaleGibco21103049
PBS, pH 7,4Gibco10010023
PFA 16%Scienze della microscopia elettronica15710
Integratore di poliammineSigmaP8483
Poli-L-Ornitina (PLO)Sigma3655
Cloruro di potassioSigma746436
SB431542Sigma54317
Buste autosigillanti trasparentiSterikingSS-T2 (90x250)Buste per autoclave
Sodio citrato diidrato Fisher ScientificS279-500
Filtri per siringhe, sterili, PES 0,22 e micro; m, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagenteInvitrogen15596018Fenolo e guanidina isotiocianato
TrypLE Express Enzyme (1x)Gibco12604039Reagente di dissociazione cellulare 
Osmometro a pressione di vaporeWescor, Inc.Modello 5520Osmometro
Y-27632Biogems1293823
trattata TC, soluzione trattata TC

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959(2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012(2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232(2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cerebellar DevelopmentHuman iPSCs2D Monolayer CultureEmbryoid BodiesCerebellar DifferentiationNeuronal ProgenitorsPurkinje Cell ProgenitorsImmunofluorescence MarkersAxonal Guidance MoleculesNeurodevelopmental Disorders

Articoli correlati