Articolo metodologico

Metodologie ecotossicologiche per valutare biomarcatori a diverse scale negli anuri neotropicali

DOI:

10.3791/64520

⸱

28 aprile 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo, vengono presentati metodi ecotossicologici standardizzati per la valutazione di biomarcatori in specie di anuri neotropicali. In particolare, questo articolo descrive in dettaglio diverse metodologie a diverse scale di valutazione ecotossicologica, come i livelli genetico, istologico-cellulare, biochimico, morfologico e individuale.

Abstract

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Le nuove domande in ecotossicologia evidenziano l'importanza di applicare una batteria di biomarcatori, in quanto ciò si traduce in previsioni ecotossicologiche che migliorano non solo l'interpretazione degli effetti dei fattori di stress ambientale sugli organismi, ma anche la determinazione del loro possibile impatto. È noto che l'uso di biomarcatori ecotossicologici a diversi livelli di organizzazione consente la previsione delle risposte biologiche degli organismi ai fattori di stress ambientale, utile nella valutazione del rischio ambientale.

Tuttavia, è necessario considerare l'ottimizzazione delle procedure di base, generare dati storici in gruppi di controllo e impiegare specifici saggi biologici per valutare le risposte in organi e tessuti al fine di chiarire la natura e la variazione degli effetti osservati. Pertanto, il presente lavoro si propone di descrivere diverse metodologie ecotossicologiche impiegate in tutti gli stadi degli anuri neotropicali a diversi livelli ecologici e di validarle come biomarcatori utili da utilizzare sia in fauna selvatica che in condizioni di laboratorio. In questo lavoro, questi biomarcatori sono stati applicati a livello individuale/organismico (indice di condizione corporea), istologico/fisiologico (istopatologia, analisi istometriche e pigmentarie), biochimico (enzimi dello stress ossidativo) e genetico (danno diretto e ossidativo nel DNA mediante saggio della cometa).

Sebbene queste metodologie presentino piccole variazioni o modifiche a seconda della specie, queste tecniche forniscono biomarcatori efficaci per valutare l'effetto degli xenobiotici sugli anuri, che possiedono determinate caratteristiche che li rendono utili specie indicatrici degli ecosistemi acquatici e terrestri. In conclusione, la batteria di biomarcatori impiegati nel presente studio si è dimostrata adeguata per stimare le risposte tossiche negli anuri neotropicali e può essere ulteriormente raccomandata come bioindicatore per identificare l'impatto degli inquinanti sugli ecosistemi acquatici della regione. Infine, si raccomanda di raggiungere la standardizzazione di questi importanti biomarcatori per gli anuri in regioni specifiche, nonché di includerli eventualmente nelle valutazioni del rischio e nel processo decisionale.

Introduzione

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L'immissione di fattori di stress ambientale nei corpi idrici naturali può influire sulla salute dell'ecosistema acquatico1. L'esposizione a questi fattori di stress ambientale può influenzare la sopravvivenza o l'idoneità degli organismi acquatici attraverso diversi meccanismi di tossicità, tra cui l'esposizione diretta (sia a breve che a lungo termine)2. Pertanto, i biotest di laboratorio standardizzati per valutare gli endpoint tossicologici correlati alla fitness e alla sopravvivenza possono essere una stima inaffidabile dei numerosi effetti indiretti dello stress sul campo. Inoltre, le alterazioni dei normali livelli fisiologici e gli effetti sugli individui, ad esempio in termini di cattura delle prede, possono essere migliori indicatori a lungo termine dell'impatto sulla sopravvivenza e sull'idoneità riproduttiva negli organismi e, in ultima analisi, sulla salute dell'ecosistema 1,3. Prevedere i cambiamenti nella composizione e nella funzione degli ecosistemi, nonché nella salute degli organismi, sulla base di un insieme noto di parametri ambientali e concentrazioni di contaminanti, è importante per migliorare la gestione dell'inquinamento1.

I biomarcatori sono definiti come cambiamenti biochimici, fisiologici o istologici dovuti all'esposizione o agli effetti di sostanze chimiche xenobiotiche 4,5. I biomarcatori si sono dimostrati molto utili come segnali di allarme precoce 4,5. Una domanda importante a cui i biomarcatori aiutano a rispondere è se alcuni fattori di stress sono presenti in concentrazioni sufficientemente elevate nell'ambiente da causare effetti avversi. Queste informazioni contribuiscono a valutare se valga la pena indagare sulla natura e l'entità del danno e sugli agenti causali o se non sia necessario investire ulteriori risorse in tal caso 6,7,8. Inoltre, poiché il concetto di valutare un singolo biomarcatore come bioindicatore potrebbe non essere adeguato 5,7,8,9,10, c'è una tendenza crescente verso l'esecuzione di una valutazione completa di più biomarcatori al fine di rilevare segnali di allarme precoce e, quindi, prevenire effetti irreversibili sugli ecosistemi.

È molto importante notare che tutti gli effetti tossici iniziano con l'interazione di un fattore di stress con le biomolecole. In questo senso, gli effetti possono ripercuotersi a cascata attraverso i livelli biochimico, subcellulare, cellulare, tissutale, organo, individuale, di popolazione, di comunità, di ecosistema, di paesaggio e biosferico dell'organizzazione. Le cellule sono il sito primario di interazione tra i fattori di stress ambientale e i sistemi biologici. Pertanto, la comprensione degli effetti molecolari e genetici consente ai ricercatori di associare bassi e alti livelli di organizzazione ecologica e li aiuta a prevedere l'effetto degli inquinanti ambientali, ad esempio, sulla salute umana, che non sono ancora stati testati5. Inoltre, a causa dell'elevata specificità delle cellule, non sono utili solo per valutare gli inquinanti ambientali ma anche la salute umana 5,11. Pertanto, la comprensione degli effetti dei fattori di stress a livello biochimico può fornire informazioni sulle cause degli effetti osservati e consentire di collegarli con quelli al livello immediatamente superiore5. Inoltre, comprendendo i meccanismi biochimici dei fattori di stress, gli effetti di nuovi fattori di stress che non sono ancora stati valutati tossicologicamente possono essere previsti rispetto ad altri contaminanti ben noti in base alle loro somiglianze di funzione. In presenza di vari fattori di stress ambientale, i biomarcatori genetici e biochimici possono fornire preziose informazioni sugli effetti specifici osservati. Oltre a ciò, le valutazioni istochimiche relative ai cambiamenti biochimici possono fornire informazioni sulla tossicodinamica5. In breve, è necessaria un'analisi completa dei biomarcatori cellulari, biochimici e istologici10,12 e questo tipo di analisi, a sua volta, dovrebbe essere inclusa nei programmi di biomonitoraggio per le specie locali 5,13,14.

Lo studio dei biomarcatori in condizioni di laboratorio può tuttavia presentare alcune difficoltà, tra cui difficoltà nell'individuazione degli effetti subletali e degli impatti cronici dopo l'esposizione agli inquinanti e nella convalida e standardizzazione dei metodi impiegati, nonché le complesse risposte dipendenti dal tempo o dalla dose, i legami poco chiari o indeterminati con l'idoneità e la mancanza di modelli meccanicistici integrati1, 4. Per risolvere questi problemi, la soluzione non è aumentare il numero di biomarcatori misurati, ma progettare attentamente studi e ipotesi verificabili che contribuiscano a spiegare le basi meccanicistiche degli effetti chimici suinteri organismi.

Le nuove domande in ecotossicologia evidenziano l'importanza di applicare una batteria di biomarcatori per generare previsioni ecotossicologiche che migliorino l'interpretazione degli effetti dei fattori di stress ambientale sugli organismi, nonché il processo decisionale sul loro possibile impatto. Inoltre, l'importanza di combinare entrambi i concetti - biomarcatori e bioindicatori - nelle valutazioni del rischio ambientale e nel biomonitoraggio è che ciò consentirà ai ricercatori di determinare se gli organismi in uno specifico ambiente di interesse sono fisiologicamente normali o stressati. L'approccio adottato in questo studio assomiglia a quello dell'analisi biochimica che viene effettuata nell'uomo. In questo senso, una batteria di biomarcatori può essere analizzata per vedere se un organismo è sano sia sul campo che in laboratorio6. Infine, i biomarcatori contribuiranno alla valutazione del rischio ecologico in due modi: (1) valutando l'esposizione di specie rare e/o longeve e (2) testando ipotesi sui meccanismi degli impatti chimici a diversi livelli di organizzazione biologica4.

Nell'ultimo decennio, i biomarcatori sono stati utilizzati negli anuri per il biomonitoraggio dell'esposizione a contaminanti citotossici e genotossici. Tra queste, le tecniche che sono state utilizzate più frequentemente sono il saggio del micronucleo (MN) e il saggio della cometa o l'induzione di rotture di DNA a singolo filamento mediante saggio di elettroforesi su gel a singola cellula (SCGE). Inoltre, queste tecniche sono state utilizzate con successo per stimare il danno al DNA indotto da vari fattori di stress ambientale in diversi anuri neotropicali 14,15,16,17,18,19. Altri biomarcatori possono essere utilizzati per esaminare i cambiamenti nello stato ossidativo negli organismi esposti a inquinanti ambientali 16,17,18,19. Lo stress ossidativo è una risposta all'esposizione a diversi xenobiotici, che porta a diversi effetti dannosi, tra cui la capacità antiossidante degli individui esposti 5,6,7,19,20.

Negli studi ecotossicologici, le specie bioindicatrici vengono utilizzate perché sono organismi che identificano le interazioni a lungo termine e gli effetti negativi dei fattori di stress ambientale a livelli organizzativi più elevati (ad esempio, organismo, popolazione, comunità ed ecosistema)10,20,21. Integrando i due concetti - biomarcatori e bioindicatori - le specie possono essere esaminate per definire a grandi linee strutture o processi biochimici, fisiologici o ecologici che sono correlati o collegati con gli effetti biologici misurati a uno o più livelli di organizzazione biologica. Infine, la grande sfida di utilizzare entrambi i concetti per migliorare le stime della tossicità di un fattore di stress riguarda l'analisi di biomarcatori e bioindicatori che hanno un'elevata utilità nella valutazione dei rischi ecologici20. In questo senso, c'è consenso sull'importanza di impiegare biomarcatori e bioindicatori come segnali di allarme precoce, in quanto offrono informazioni rilevanti sulla risposta di un organismo in esame ai fattori di stress ambientale 12,20,21.

Gli anfibi sono uno dei gruppi di organismi più minacciati e in rapido declino in tutto il mondo. Una delle ragioni principali di questo declino sono gli inquinanti che entrano nel loro habitat, come pesticidi, metalli e inquinanti emergenti 22,23,24,25. Gli anuri hanno diverse caratteristiche che li rendono utili come specie bioindicatrici, come la loro pelle permeabile, la stretta relazione con l'acqua e la sensibilità all'inquinamento ambientale 2,23,24. Queste caratteristiche rendono gli anfibi efficaci bioindicatori della salute ambientale 7,8,22,23,24,26.

Tuttavia, è necessario non solo considerare l'ottimizzazione delle procedure di base e la generazione di dati storici nei gruppi di controllo, ma anche impiegare specifici saggi biologici per valutare le risposte in organi e tessuti per chiarire la natura e la variazione degli effetti osservati nei bioindicatori. In questo senso, il presente lavoro si propone di descrivere diverse metodologie ecotossicologiche da impiegare in tutti gli stadi degli anuri neotropicali a diversi livelli ecologici e di validarle come biomarcatori utili da impiegare sia in condizioni faunistiche che di laboratorio. Questo lavoro presenta una batteria di biomarcatori che possono essere integrati e che sono stati testati per il biomonitoraggio di laboratorio e della fauna selvatica in anuri esposti a fattori di stress ambientale.

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Protocollo

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Le tecniche successive includono il precedente sacrificio dell'animale, che è stato effettuato in conformità con gli standard etici internazionali 46,47,48, e la successiva dissezione e ablazione degli organi. Gli animali sono stati catturati con l'autorizzazione del Ministero dell'Ambiente, dell'Agricoltura e della Produzione della Provincia di San Luis (Risoluzione 49-PMA2019). Le modalità di sacrificio e di eutanasia degli animali sono state debitamente approvate dai protocolli del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (CICUA, protocollo Q-322/19) dell'Università Nazionale di San Luis. Le procedure con organismi anuri sono state eseguite secondo le linee guida dettagliate in Garber et al.46, CONICET47 e INTA48. Inoltre, tutti i protocolli qui presentati sono per le specie di anuri neotropicali nelle loro fasi di vita larvale e adulta; sono già stati ampiamente accettati dai ricercatori locali e vengono svolti secondo un rigido protocollo e con l'autorizzazione del "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" di ogni università coinvolta. Un elenco dei materiali e delle soluzioni utilizzate è presentato nella Tabella dei materiali e nella Tabella 1.

1. Livello individuale: Condizione corporea e indici epatici e gonadici

  1. Indice di condizione corporea: Indice di massa scalato
    NOTA: Questo indice può essere utilizzato sia con gli adulti che con i giovani e le larve. Questa metodologia si basa su Peig e Green27, con modifiche minori per gli anuri secondo Brodeur et al.28,30 e MacCracken and Stebbings29.
    1. Registrare la massa corporea di ciascun campione utilizzando una bilancia analitica di precisione.
    2. Posiziona ogni esemplare su un foglio millimetrico e scatta una fotografia a una distanza di ~15 cm.
      NOTA: È importante scattare sempre fotografie dalla stessa distanza.
    3. Analisi fotografica:
      NOTA: Le fotografie possono essere analizzate con il programma ImageJ, disponibile gratuitamente online (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), o con qualsiasi altro programma di analisi delle immagini che consenta di effettuare misurazioni da una scala inclusa nella fotografia.
      1. Misurare la lunghezza del muso-sfiato (SVL) di ciascun campione utilizzando lo strumento di misurazione del programma ImageJ e fare riferimento prima a una misura nota nel foglio millimetrico.
        NOTA: Nei girini, la misura della lunghezza del corpo deve essere effettuata fino al tubo cloacale, trascurando la pinna caudale.
    4. Indice di massa scalato (S)
      1. Con i dati ottenuti dalla massa corporea e dall'SVL di ciascun anuran, costruisci una linea di regressione della massa corporea (asse y) rispetto all'SVL (asse x).
      2. Calcola la lunghezza media con i dati SVL di tutti gli individui misurati dalla popolazione studiata.
      3. Infine, calcola l'indice di massa in scala (S) secondo Peig e Green27 e Brodeur et al.28 utilizzando l'equazione (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        dove Mi e Li sono rispettivamente la massa corporea e la SVL dell'individuo i; b è l'esponente di scala stimato da una regressione della funzione di potenza non lineare28; L0 è la lunghezza media per la popolazione studiata; e S è la massa corporea prevista per l'individuo i quando il suo SVL è standardizzato al valore L0 .
        NOTA: È importante notare che b è una costante specie-specifica che potrebbe anche essere sesso-specifica nelle specie sessualmente dimorfiche.
  2. Indice epatosomatico: indice epatico scalato
    NOTA: Per quanto riguarda l'indice di condizione corporea, questo indice può essere utilizzato con individui in tutte le fasi di sviluppo. La metodologia si basa su Brodeur et al.28.
    1. Registrare l'SVL di ciascun campione secondo i passaggi 1.1.2 e 1.1.3.
    2. Eutanasia degli individui secondo gli standard etici per gli anfibi anuri 46,47,48.
    3. Rimuovere l'intero fegato e registrare la sua massa su una bilancia analitica di precisione al milligrammo.
    4. Con i dati ottenuti dalla massa epatica e dalla SVL di ciascun anuran, costruire una linea di regressione della funzione di potenza non lineare della massa epatica (asse y) rispetto alla SVL (asse x).
    5. Calcola la lunghezza media con i dati SVL di tutti gli individui misurati dalla popolazione studiata.
    6. Calcola l'indice epatico scalato (SLI) secondo Brodeur et al.28 utilizzando l'equazione (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      dove Lmi e Li sono rispettivamente la massa epatica e la SVL dell'individuo i; b è l'esponente di scala stimato da una regressione della funzione di potenza non lineare28; L0 è la lunghezza media per la popolazione studiata; e SLI è la massa epatica prevista per l'individuo i quando il suo SVL è standardizzato a L0.
  3. Indice gonadico: Indice gonadico scalato
    NOTA: Questa metodologia si basa su Brodeur et al.30 ed è utile solo con individui adulti. È importante notare che gli indici maschili e femminili devono essere analizzati separatamente in quanto variano su scale distinte.
    1. Registrare l'SVL di ciascun campione secondo i passaggi 1.1.2 e 1.1.3.
    2. Eutanasia degli individui secondo gli standard etici per gli anfibi anuri 46,47,48.
    3. Rimuovere le gonadi destra e sinistra e registrare la massa su una scala analitica di precisione al milligrammo.
    4. Con i dati ottenuti dalla massa delle gonadi e dall'SVL di ciascun anuran, costruire una linea di regressione della funzione di potenza non lineare della massa delle gonadi (asse y) rispetto all'SVL (asse x), simile al passaggio 1.1.4.1 e al passaggio 1.2.3.
    5. Calcola la lunghezza media con i dati SVL di tutti gli individui misurati dalla popolazione studiata.
    6. Stimare l'indice gonadico scalato (SGI) secondo Brodeur et al.30 per ogni animale utilizzando l'equazione (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      dove Gmi e Li sono la massa delle gonadi e SVL dell'individuo i, rispettivamente, b è l'esponente di scala stimato da una regressione della funzione di potenza non lineare di Brodeur et al.30, L0 è la lunghezza media per la popolazione studiata e SGI è la massa delle gonadi prevista per un individuo i quando la sua SVL è standardizzata a L0.

2. Livello morfologico-istologico

NOTA: Per questa analisi è necessario utilizzare sezioni istologiche. Il primo passo è raccogliere il tessuto.

  1. Fissaggio e disidratazione
    1. Utilizzare una soluzione fissativa per preservare le strutture. Per i tessuti anurani, utilizzare preferibilmente la soluzione di metacarn o Bouin, consigliata rispetto al resto delle soluzioni di fissaggio (Tabella 1).
      NOTA: Tutte le sostanze devono essere miscelate al momento dell'uso.
    2. Porre i girini o un frammento di tessuto di 50-100 mg in una provetta conica con 1-2 mL di soluzione fissativa a 4 °C per 3 ore. Lavare il fazzoletto nello stesso volume di alcol etilico al 70% per 30 minuti.
    3. Mettere il fazzoletto in una soluzione fresca di alcol etilico al 70%.
      NOTA: A questo punto è possibile interrompere la procedura per alcuni giorni prima di continuare con la disidratazione.
    4. Disidratare il tessuto in una serie di soluzioni alcoliche: alcol etilico 80% (10 min), alcol 90% (10 min), alcol etilico 100% (10 min) e alcol etilico 100% (10 min).
    5. Eseguire la diafanizzazione (schiaritura) 2 x 10 minuti in xilene.
    6. Sciogliere la paraffina in un bicchiere. Immergere il fazzoletto per 10 minuti. Rimuovere il fazzoletto e metterlo in uno stampo istologico con paraffina fusa. Attendere che si solidifichi a temperatura ambiente.
    7. Posizionare sezioni da 3 μm realizzate su un microtomo rotante su un vetrino.
  2. Analisi istometrica
    1. Colorare le sezioni di tessuto in ematossilina-eosina31.
    2. Utilizzare 10-20 fotomicrografie per la misurazione con un obiettivo 100x in un microscopio ottico. Analizza 5-10 cellule epatiche in ogni fotomicrografia.
      NOTA: Qui, il fegato è stato usato come modello per descrivere la tecnica. E' possibile utilizzare altri tessuti; Assicurarsi che l'obiettivo del microscopio ottico da utilizzare sia adatto al tipo di tessuto. È necessario essere in grado di vedere e identificare le cellule da misurare.
  3. Istopatologia
    1. Dopo aver colorato le sezioni di tessuto in ematossilina-eosina32, esaminare 5-10 sezioni istologiche con obiettivi 10x, 20x, 40x e 100x.
    2. Cerca i cambiamenti tissutali e stima il grado di indice dei cambiamenti tissutali (DTC) come descritto da Bernet et al.32 utilizzando l'equazione (4):
      DTC =Σalt. (a × w)    (4)
      dove Σalt è la somma dell'alterazione; A rappresenta la fase del danno (0, assente; 1, basso; 2, moderato; 3, alto); e w rappresenta il grado di reversibilità del danno (1, reversibile; 2, parzialmente reversibile; 3, irreversibile).
      NOTA: Qui, il fegato è stato usato come modello per descrivere la tecnica. E' possibile utilizzare altri tessuti; Assicurarsi che l'obiettivo del microscopio ottico da utilizzare sia adatto al tipo di tessuto.
  4. Sistema pigmentario
    1. Dopo aver colorato i vetrini in ematossilina-eosina, esaminare 10-20 fotomicrografie con un obiettivo 20x.
    2. Quantificare l'area occupata dalla melanina misurando le differenze nell'intensità della colorazione utilizzando il software Image Pro-Plus secondo Santos et al.33.
    3. Aprire il software Image Pro Plus 6.0®.
    4. Seleziona Menu e barra degli strumenti: Biologico.
    5. Selezionare la calibrazione spaziale dell'ingrandimento utilizzata per scattare le fotomicrografie.
    6. Apri un'immagine istologica.
    7. Seleziona Conteggio utensili | Misurare gli oggetti.
    8. Fare clic sul pulsante Seleziona colori .
    9. Seleziona lo strumento contagocce e contrassegna la colorazione da misurare nell'immagine.
    10. Chiudi la finestra e fai clic su Conteggio.
    11. Seleziona Visualizza | Statistiche per vedere i risultati.

3. Livello biochimico: specie reattive dell'ossigeno (ROS) ed enzimi colinergici

  1. Omogeneizzazione dei campioni
    NOTA: Una volta terminato l'esperimento, conservare i campioni (tessuti o girini) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) se non verranno trattati in quel momento congelandoli a -20 °C (per 2 mesi) o -80 °C (per 6 mesi). In alternativa, possono essere omogeneizzati al momento secondo le raccomandazioni proposte di seguito.
    1. Girini
      1. Pesare 1 g di girino o di un gruppo di girini su una bilancia analitica di precisione.
      2. Mettere 1 g di girini in una provetta conica da 15 mL contenente 1 mL di PBS e immergerla in un bagno di ghiaccio (4 °C).
      3. Omogeneizzare con un omogeneizzatore con punta in teflon adattato a un tubo conico e lavorare in condizioni di freddo (4 °C).
        ATTENZIONE: Evitare di utilizzare un numero elevato di giri, in quanto ciò potrebbe distruggere le proteine e aumentare la temperatura.
      4. Trasferire lo stesso volume di omogeneiato liquido di ciascun campione in due provette per microcentrifuga da 2 mL marcate e lavorare a freddo (4 °C).
      5. Centrifugare i campioni con l'omogeneizzato liquido per 10 minuti a 4 °C e 9,520 × g.
      6. Infine, estrarre il surnatante, metterlo in provette da microcentrifuga, etichettarlo in aliquote da 0,5 mL a 1 mL e conservare in congelatore a -80 °C (per 6 mesi) o -20 °C (per 2 mesi) fino al test enzimatico.
    2. Adulti
      1. Rimuovere il tessuto di interesse (ad es. fegato, muscolo, rene) e pesare 1 g su una bilancia analitica di precisione.
      2. Mettere il fazzoletto in una provetta conica da 50 mL contenente 1 mL di PBS e immergerlo in un bagno di ghiaccio (4 °C).
      3. Omogeneizzare con un omogeneizzatore con punta in teflon adattato a un tubo conico e lavorare a freddo (4 °C).
        ATTENZIONE: Evitare di utilizzare un numero di giri elevato, in quanto ciò potrebbe distruggere le proteine e aumentare la temperatura.
      4. Trasferire lo stesso volume di omogeneizzato liquido di ciascun campione in due provette da microcentrifuga da 2 mL etichettate e lavorare a freddo (4 °C).
      5. Centrifugare le provette con l'omogeneizzato liquido per 10 minuti a 4 °C e 9,520 × g.
      6. Infine, estrarre il surnatante, metterlo in provette da microcentrifuga, etichettare in aliquote da 0,5 mL a 1 mL e conservare in congelatore a -80 °C (per 6 mesi) o -20 °C (per 2 mesi) fino al test enzimatico.
  2. Determinazione delle proteine
    NOTA: Il valore proteico si ottiene per stimare l'attività enzimatica in relazione alla quantità totale di proteine, evitando la sottostima o la sovrastima dei valori di attività enzimatica. Questa metodologia si basa su Bradford34 con piccole modifiche per gli anuri:
    1. Preparare il reagente Bradford (vedere Tabella 1).
    2. Aggiungere 100 mL di H3PO4 all'85% (p/v) a Coomassie G-250 + etanolo e portare a un volume di 1 L con acqua distillata.
    3. Preparare la curva di calibrazione con l'albumina sierica bovina (BSA) come standard proteico noto (Tabella 1).
    4. Preparare gli standard di albumina in concentrazioni crescenti per una cuvetta spettrofotometrica da 3 mL. Per un esempio della curva standard, vedere la Tabella 2.
    5. Misurare l'assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a 590 nm (questa è la lunghezza d'onda alla quale si forma il complesso del reagente e della proteina).
      NOTA: L'esecuzione della reazione di Bradford con il campione per la lettura nello spettrofotometro utilizzando una cuvetta di vetro con un volume massimo di 3 mL e un percorso ottico di 1 cm aiuta la determinazione della proteina.
    6. Posizionare i seguenti reagenti in una cuvetta in questo ordine: 2.000 μl del reagente Bradford + X μl del campione (X = 20 μl del campione omogenato dell'organo di interesse da un anura adulto, o 40 μl del campione omogenato da un girino).
    7. Infine, misurare l'assorbanza nello spettrofotometro a 590 nm.
      NOTA: Non è necessario lavorare a 4 °C.
  3. Catalasi
    NOTA: Questa metodologia si basa su Aebi35 con piccole modifiche per gli anuri.
    1. Incubare 1.900 μL di PBS + 40 μL di perossido di idrogeno (H202) + 20 μL del campione (puro in girini e diluito 1/25 per il tessuto adulto) in una cuvetta di quarzo da 3 mL con una lunghezza del percorso di 1 cm.
      ATTENZIONE: Seguire l'ordine sopra indicato per l'aggiunta dei reagenti e del campione durante l'incubazione. I reagenti possono essere incubati a temperatura ambiente (25 °C) poiché gli anuri sono fisiologicamente ectotermici.
    2. Leggere la cinetica della catalasi a 240 nm per 2 minuti in uno spettrofotometro UV.
    3. Calcola l'attività enzimatica con la seguente equazione (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (Δ assorbanza/1.000)/concentrazione proteica (5)
      NOTA: Negli studi con preparati enzimatici purificati, l'attività specifica k'0 si ottiene dividendo k per il coefficiente di estinzione molare, (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. Glutatione S-transferasi (GST)
    NOTA: Questa metodologia si basa su Habig et al.36 con modifiche minori per gli anuri.
    1. Incubare 300 μL di GST + 10 μL di 1-coro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0,1 M) + 10 μL del campione (puro in girini e diluito 1/25 per il tessuto adulto) nella cuvetta.
      ATTENZIONE: Rispettare l'ordine di aggiunta dei reagenti e del campione sopra indicato durante l'incubazione. I reagenti possono essere incubati a temperatura ambiente (25 °C) poiché gli anuri sono fisiologicamente ectotermici.
    2. Preparare l'imposta GST (Tabella 1).
    3. Leggere la cinetica GST a 340 nm per 2 minuti nello spettrofotometro.
    4. Calcolare l'attività enzimatica con la seguente equazione (6):
      Tasso di attività della GST (mmol/al minuto/mg di proteine) = ([Δ assorbanza/1.000]/9,6 × 104)/concentrazione di proteine (6)
      Dove 9,6 mM−1 cm−1 = coefficiente di estinzione molare.
  5. Perossidazione lipidica (TBARS)
    NOTA: Questa metodologia si basa su Buege e Aust37 con piccole modifiche per gli anuri.
    1. Costruire una curva di calibrazione con MDA come standard e 0,7% TBA (Tabella 3).
    2. Preparare la soluzione MDA standard (10 mM) (Tabella 1). Effettuare l'idrolisi del THP a MDA ponendo la soluzione in un bagno d'acqua a 50 °C per 1 ora.
    3. Preparare una soluzione allo 0,7% (p/v) di TBA (Tabella 1) utilizzando un agitatore magnetico a piastra riscaldante.
    4. Quindi, centrifugare l'omogeneizzazione del campione per 30 minuti a 9,520 × g e 4 °C.
    5. Estrarre 500 μL di surnatante, aggiungere 100 μL di NaOH 6 M e porre in un bagno termale a 60 °C per 30 min.
    6. Dopo il bagno termale, aggiungere 250 μL di HClO4 al 35%, quindi immergere in un bagno di ghiaccio (4 °C) per 30 min.
    7. Trascorso questo tempo, centrifugare a 9.520 × g per 12 minuti ed estrarre 300 μl di surnatante.
    8. Aggiungere 300 μl di TBA allo 0,7% al surnatante (campione) e porre in un bagno termale (97,5 °C) per 30 minuti.
    9. Leggere l'assorbanza del complesso formato dal campione e il TBA a 532 nm e determinare la concentrazione di MDA nei campioni sostituendo i valori di assorbanza nell'equazione della curva (Figura 1).
  6. Acetilcolinesterasi (AChE)
    NOTA: Questa metodologia si basa su quella proposta da Ellman et al.38 con modifiche minori per gli anuri.
    1. Al momento della misurazione, impostare i reagenti DTNB e acetiltiocolina ioduro (ATCh).
    2. Preparare la reazione DTNB (Tabella 1).
    3. Preparare la reazione AChE (Tabella 1).
    4. In una cella di vetro con un percorso ottico di 1 cm, preparare la reazione AChE posizionando questi reagenti nel seguente ordine: 150 μL di tampone PBS (pH = 8) + 150 μL di DTNB + 50 μL di ATCh + 10 μL del campione (puro nei girini e diluito 1/10 negli anuri adulti).
    5. Leggere la cinetica AChE a 412 nm per 2 minuti a temperatura ambiente.
    6. Ottenere il valore dell'attività dell'AChE utilizzando la seguente equazione (7):
      Tasso di attività dell'AChE (proteina mmol∙min-1∙mg-1 ) = ([Δ assorbanza/1.000]/1,36)/concentrazione proteica (7)

4. Livello genetico e cellulare: saggio del micronucleo e della cometa

  1. Saggio del micronucleo (MN)
    NOTA: La metodologia è in accordo con quella proposta da Fenech39 con lievi modifiche per gli anuri neotropicali.
    1. Anestetizzare i campioni mediante immersione in acqua ghiacciata (4 °C) e ottenere campioni di sangue sezionando dietro l'opercolo nei girini o mediante puntura cardiaca negli adulti.
    2. Spalmare due gocce di sangue periferico dai campioni su vetrini prepuliti.
    3. Successivamente, asciugare i vetrini all'aria, fissarli con metanolo freddo al 100% (v/v) (4 °C) per 20 minuti, quindi colorare con soluzione di Giemsa al 5% per 12 minuti.
    4. Chiedi a un ricercatore di codificare e codificare alla cieca i vetrini con un ingrandimento di 1.000x.
    5. Determinare la frequenza delle MN analizzando 1.000 eritrociti maturi da ciascun campione ed esprimere come numero totale di MN per 1.000 cellule.
    6. Utilizzare i seguenti criteri per la corretta identificazione dei MN:
      1. Cerca MN che abbiano diametri inferiori a 1/3 di quello del nucleo principale.
      2. Assicurarsi che la colorazione del MN non sia rifratbile ma abbia un'intensità di colorazione uguale o più chiara di quella del nucleo principale.
      3. Cerca un confine MN che sia distinguibile dal confine del nucleo principale senza alcuna connessione con il nucleo o sovrapposto al nucleo principale.
      4. Assicurarsi che il numero di MN nelle cellule non superi più di quattro MN associati al nucleo.
  2. Saggio cometaria o elettroforesi su gel a cellula singola (SCGE)
    1. Anestetizzare i campioni mediante immersione in acqua ghiacciata e ottenere campioni di sangue sezionando dietro l'opercolo nei girini o mediante puntura cardiaca negli adulti.
    2. Diluire il sangue con 1 mL di PBS, centrifugare (381 × g, 9 min) e risospendere in un volume finale di 50 mL di PBS.
    3. Miscelare 30 μl del campione di sangue in 70 μl di agarosio a basso punto di fusione (LMPA) a una concentrazione dello 0,5% di agarosio per formare lo strato 2. Successivamente, posizionare 50 μL di strato 2 su un vetrino precedentemente rivestito con lo strato 1 contenente 100 μL di agarosio allo 0,5% con punto di fusione normale.
    4. Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti e metterlo al freddo (4 °C) per 10 minuti per solidificare lo strato 2.
    5. Dopo la solidificazione, rimuovere il vetrino coprioggetti e formare il terzo strato stendendo 100 μl di LMPA allo 0,5%.
    6. Quando il terzo strato si solidifica, rimuovere il vetrino coprioggetti e immergere ciascun vetrino in un barattolo Coplin da 100 ml contenente soluzione di lisi (Tabella 1) preparato lo stesso giorno e mantenuto a 4 °C. Mettere i barattoli Coplin in un bagno freddo per 1 ora al buio (4 °C) per consentire la lisi.
      NOTA: l'esperimento può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento. È stato riportato che il periodo di lisi dura da 1 ora a 1 mese.
    7. Al termine della lisi, rimuovere i vetrini e immergere nella soluzione tampone per elettroforesi (Tabella 1) nella vasca per elettroforesi. Eseguire questo passaggio al buio per 15 minuti a 4 °C per consentire al DNA di srotolarsi. Dopo lo svolgimento del DNA nucleare, eseguire l'elettroforesi sullo stesso tampone a una temperatura di 4 °C per 10 minuti a 25 V e 250 mA.
    8. Al termine dell'elettroforesi, neutralizzare i campioni contenuti nei vetrini 3 x 5 min aggiungendo 2 mL di soluzione di Tris-HCl (Tabella 1).
    9. Nell'ultima fase della tecnica del saggio della cometa, disidratare i campioni mettendoli in barattoli Coplin da 100 ml contenenti alcol (95%) a 4 °C.
    10. Infine, colorare i campioni posizionando 10 μL di 4′,6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) al centro del vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti che distribuisca il colorante su tutti i campioni. Esaminare i vetrini con un fotomicroscopio a fluorescenza con un filtro WB.
      ATTENZIONE: L'intero processo deve essere eseguito al buio per evitare la fotodegradazione del DNA.
    11. Quantificare il danno al DNA valutando la lunghezza della migrazione del DNA dal nucleoide. In questo caso, determinalo visivamente su 100 celle selezionate casualmente senza sovrapposizioni. Classifica il danno al DNA in quattro classi: 0-I (nessun danno), II (danno minimo), III (danno medio) e IV (danno massimo). Esprimere i dati come il numero medio di cellule danneggiate (somma delle classi II-IV) e il punteggio medio della cometa per ciascun gruppo di trattamento. Sulla base di questi dati, calcolare l'indice di danno genetico (GDI) per ciascun organismo in esame utilizzando la seguente equazione (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      dove I-IV rappresenta il tipo di danno nucleoide e NI-NIV rappresenta il numero totale di nucleoidi valutati secondo Pitarque et al.40.

5. Biomarcatori correlati

NOTA: In tempi recenti, i biomarcatori possono essere integrati a tutti i livelli utilizzando l'indice di risposta del biomarcatore (IBR) proposto da Beliaeff e Burgeot49 e adattato per gli anuri neotropicali. L'IBR fornisce un valore numerico che integra tutte le risposte dei biomarcatori; valori IBR più elevati indicano livelli di stress più elevati49. Per quanto riguarda la stima dell'IBR per una determinata stazione o il trattamento di una determinata indagine, le fasi successive di elaborazione dei dati per determinare il punteggio finale sono le seguenti:

  1. Calcolare la stima media (X) quando sono disponibili i singoli risultati; In caso contrario, utilizzare il valore del campione aggregato in ciascuna stazione di campionamento.
  2. Per ogni biomarcatore, calcolare la media generale (m) e la deviazione standard (s) di X per tutte le stazioni e/o rilevamenti, a seconda dei confronti da effettuare.
  3. Standardizzare X per ottenere Y. Calcola un valore chiamato Y: Y = (X- m)/s.
  4. Calcola il valore Z come segue: Z = Y o Z = −Y, nel caso di un effetto biologico corrispondente, rispettivamente, all'inibizione o all'attivazione in risposta a un fattore di stress.
  5. Infine, calcola il punteggio (S), con S = Z + |Min|, dove S ≥ 0 e |Min| è il valore assoluto minimo determinato.
  6. Traccia un diagramma a ragno o a stella dopo aver calcolato il valore di S per ogni biomarcatore (Si) ed eseguito la sommatoria per ottenere l'IBR.
    NOTA: fare riferimento al documento originale49 per qualsiasi dettaglio dei calcoli.

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Risultati

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Tutte le tecniche di biomarcatori qui presentate sono metodi semplici, rapidi, convenienti, sensibili, a basso costo e accurati. Per ogni biomarcatore, è importante notare quanto segue.

Livello individuale
Indice di massa in scala
Scattare fotografie su scala millimetrica è di grande importanza poiché questo valore verrà utilizzato per calibrare il software, e questo si traduce in una migliore obiettività rispetto alla misura del calibro quando si prende...

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Discussione

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I biomarcatori a livello individuale sono molto semplici da determinare e molto economici, poiché l'esame di questi biomarcatori richiede solo poche attrezzature che di solito sono disponibili in qualsiasi laboratorio di ricerca. Inoltre, questi biomarcatori forniscono informazioni generali sulla salute e l'idoneità degli animali. Il numero di animali impiegati in ciascun protocollo è fondamentale per ottenere risultati affidabili. A causa della variabilità dei dati, è necessario un mini...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano l'Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Progetto PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) e Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 e PICT-2018-01067) per il sostegno finanziario. Ringraziamo inoltre Lidia Unger, madrelingua e GAECI-UNSL (centro di assistenza alla scrittura scientifica) dell'Università Nazionale di San Luis per la correzione di bozze del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bilancia
Alimentazione per elettroforesi  Enduro  E0203-250V 
Eosin Fotomicroscopio
  Olimpo  BX50Dotato di un'appropriata combinazione
di filtri Ematossilina di HarrisMerck
Fotocamera ad alta risoluzione   >16 megapixel
Omogeneizzatore
Camera di elettroforesi orizzontale  Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscopeLeicaDM4000 BDotato di sistema di acquisizione delle immagini Leica DFC 280
MicrotomoLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Personal Computer  Equipaggiato con Mac OS X, Lynux o Windows
Centrifuga
refrigerata UV– Spettrofotometro VisRayleigh723Gcon lampada UV
analitica a fluorescenza Merck

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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