I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.
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Articolo metodologico
Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I gate booleani e i circuiti digitali dei geni sintetici hanno una vasta gamma di applicazioni, dalla diagnostica medica alla cura dell'ambiente. La scoperta dei sistemi CRISPR-Cas e dei loro inibitori naturali, le proteine anti-CRISPR (Acrs), fornisce un nuovo strumento per progettare e implementare circuiti digitali genici in vivo . Qui, descriviamo un protocollo che segue l'idea del ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" e fa uso di dCas9 / dCas12a insieme ai loro corrispondenti Acr per stabilire piccole reti trascrizionali, alcune delle quali si comportano come porte booleane, in Saccharomyces cerevisiae. Questi risultati evidenziano le proprietà di dCas9/dCas12a come fattori di trascrizione. In particolare, per ottenere la massima attivazione dell'espressione genica, dSpCas9 deve interagire con un RNA scaffold ingegnerizzato che raccoglie più copie del dominio di attivazione VP64 (AD). Al contrario, dCas12a deve essere fuso, al terminale C, con il forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Inoltre, l'attività di entrambe le proteine Cas non è potenziata aumentando la quantità di sgRNA/crRNA nella cellula. Questo articolo spiega anche come costruire porte booleane basate sull'interazione CRISPR-dCas-Acr. Il dominio di legame ormonale fuso AcrIIA4 del recettore degli estrogeni umani è il nucleo di un gate NOT sensibile al β-estradiolo, mentre gli AcrVA sintetizzati dal promotore inducibile GAL1 consentono di imitare sia le porte SÌ che NOT con galattosio come input. In questi ultimi circuiti, AcrVA5, insieme a dLbCas12a, ha mostrato il miglior comportamento logico.
Introduzione
Nel 2011, i ricercatori hanno proposto un metodo computazionale e sviluppato un software corrispondente per la progettazione automatica di circuiti genetici sintetici digitali1. Un utente doveva specificare il numero di ingressi (tre o quattro) e compilare la tabella di verità del circuito; Ciò ha fornito tutte le informazioni necessarie per derivare la struttura del circuito utilizzando tecniche dall'elettronica. La tavola di verità è stata tradotta in due formule booleane tramite il metodo 2 della mappa di Karnaugh. Ogni formula booleana è composta da clausole che descrivono le operazioni logiche (somma o molt....
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Protocollo
1. Progettazione e costruzione della cassetta di espressione sgRNA/crRNA
NOTA: Esistono due tipi di cassette di espressione sgRNA/crRNA: SNR5210-è composto dal promotore SNR52 RNA polimerasi III-dipendente, dalla sequenza sgRNA/crRNA e dal terminatore SUP4; un altro, abbreviato in RGR11, è costituito dal promotore ADH1 RNA polimerasi II-dipendente, dalla struttura RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) che contiene due ribozimi (un ribozima martello-HH e un ribozima delta virus dell'epatite ribozima-HDV) e la sequenza del sgRNA/crRNA intermedio e il terminatore ....
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Risultati
Espressione di sgRNA/crRNA da parte di un promotore di tipo III della RNA polimerasi
In primo luogo, questo lavoro ha affrontato l'ingegneria del circuito di attivazione trascrizionale (circuito 1) mostrato nella Figura 1A. Conteneva tre componenti di base: 1) il gene che codifica per yEGFP (il reporter), che è stato preceduto da una serie di diversi promotori sintetici che hanno fornito siti bersaglio per dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versione ottimizzata per il codone di l.......
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Discussione
Il protocollo ha mostrato un possibile flusso di lavoro completo per circuiti digitali di geni sintetici, seguendo il ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e riguardante sia esperimenti di laboratorio secco che di laboratorio umido. Qui, ci siamo concentrati sul sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a e le corrispondenti proteine anti-CRISPR, progettando e costruendo in S. cerevisiae piccole reti trascrizionali. Alcuni di loro imitavano le porte booleane, che s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Vogliamo ringraziare tutti gli studenti del laboratorio di biologia sintetica - SPST, TJU - per il loro aiuto generale, insieme a Zhi Li e Xiangyang Zhang per la loro assistenza negli esperimenti FACS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per PCR da 0,1 mL a 8 strisce | NEST | 403112 | |
| Provette per PCR da 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Microprovette da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Provette da centrifuga da 15 mL | BIOFIL | CFT011150 | |
| 2 mL Microprovette | Axygen | MCT-200-C | |
| Provette da centrifuga da 50 mL | BIOFIL | CFT011500 | |
| Agarosio-grado di biologia molecolare | Invitrogen | 75510-019 | |
| Ampicillina sale sodico | Solarbio | 69-52-3 | |
| Applied biosystems veriti Termociclatore a 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep Kit di estrazione del gel di DNA | Axygen | AP-GX-250 | |
| BD FACSuite CS& Amp; Perle di ricerca T | BD | 650621 | Perle fluorescenti |
| BD FACSVicitometro a flusso aziendale | BD-Centrifuge | ||
| Eppendorf | 5424 | ||
| Centrifuge Sorvall ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli cellule competenti (Ceppo DH5&alfa;) | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL seleziona il reagente di rilevamento Western Blotting | GE Healthcare | RPN2235 | |
| Apparecchio per elettroforesi | Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd | JY300C | |
| Tappi piatti a 8 strisce | NEST | 406012 | |
| Società di sintesi genica | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| Kit di sintesi di cDNA HiFiScript | CWBIO | CW2569M | Kit utilizzato nella fase 6.2.2.1 |
| Soluzione di lisato (Zymolyase) | zymoresearch | E1004-A | |
| Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i | Nikon | - | Microscopio a fluorescenza |
| Punte di pipette— 10 μ L | Axygen | T-300-R-S | |
| Punte per pipette— 1000 μ L | Axygen | T-1000-B-R-S Punte per | |
| pipette— 200 μ L | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0491 | |
| Enzima di restrizione-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| Enzima di restrizione-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| Enzima di restrizione-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| Enzima di restrizione-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | Strumento Roche-Real-Time | PCR | |
| S. cerevisiae CEN. PK2-1C | - | - | Il ceppo genitore. Il genotipo è: MATa; il suo3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit SUC2 |
| Stem-Loop | SparkJade | AG0502 | Kit utilizzato nel passaggio 6.2.1.3 |
| T100 Thermal Cycler | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 DNA ligasi | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 Esonucleasi | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq DNA ligasi | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq DNA polimerasi | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Premix verde Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (colorante SYBR Green I) | Takara | RR820Q | |
| Kit RNA YeaStar | Zymo Research | R1002 | |
| β-estradiolo | Sigma-Aldrich | E8875 |
Riferimenti
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the Ameri....
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Ristampe e permessi
