Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Sommario

I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.

Abstract

I gate booleani e i circuiti digitali dei geni sintetici hanno una vasta gamma di applicazioni, dalla diagnostica medica alla cura dell'ambiente. La scoperta dei sistemi CRISPR-Cas e dei loro inibitori naturali, le proteine anti-CRISPR (Acrs), fornisce un nuovo strumento per progettare e implementare circuiti digitali genici in vivo . Qui, descriviamo un protocollo che segue l'idea del ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" e fa uso di dCas9 / dCas12a insieme ai loro corrispondenti Acr per stabilire piccole reti trascrizionali, alcune delle quali si comportano come porte booleane, in Saccharomyces cerevisiae. Questi risultati evidenziano le proprietà di dCas9/dCas12a come fattori di trascrizione. In particolare, per ottenere la massima attivazione dell'espressione genica, dSpCas9 deve interagire con un RNA scaffold ingegnerizzato che raccoglie più copie del dominio di attivazione VP64 (AD). Al contrario, dCas12a deve essere fuso, al terminale C, con il forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Inoltre, l'attività di entrambe le proteine Cas non è potenziata aumentando la quantità di sgRNA/crRNA nella cellula. Questo articolo spiega anche come costruire porte booleane basate sull'interazione CRISPR-dCas-Acr. Il dominio di legame ormonale fuso AcrIIA4 del recettore degli estrogeni umani è il nucleo di un gate NOT sensibile al β-estradiolo, mentre gli AcrVA sintetizzati dal promotore inducibile GAL1 consentono di imitare sia le porte SÌ che NOT con galattosio come input. In questi ultimi circuiti, AcrVA5, insieme a dLbCas12a, ha mostrato il miglior comportamento logico.

Introduzione

Nel 2011, i ricercatori hanno proposto un metodo computazionale e sviluppato un software corrispondente per la progettazione automatica di circuiti genetici sintetici digitali¹. Un utente doveva specificare il numero di ingressi (tre o quattro) e compilare la tabella di verità del circuito; Ciò ha fornito tutte le informazioni necessarie per derivare la struttura del circuito utilizzando tecniche dall'elettronica. La tavola di verità è stata tradotta in due formule booleane tramite ^{il metodo 2} della mappa di Karnaugh. Ogni formula booleana è composta da clausole che descrivono le operazioni logiche (somma o moltiplicazione) tra (parte di) gli ingressi del circuito e le loro negazioni (i letterali). Le clausole, a loro volta, vengono sommate (OR) o moltiplicate (AND) per calcolare l'uscita del circuito. Ogni circuito può essere realizzato secondo una qualsiasi delle sue due formule corrispondenti: una scritta in forma POS (prodotto di somme) e l'altra in rappresentazione SOP (somma di prodotti). Il primo consiste in una moltiplicazione di clausole (cioè porte booleane) che contengono una somma logica dei letterali. Quest'ultimo, al contrario, è una somma di clausole in cui i valori letterali sono moltiplicati.

I circuiti elettrici possono essere realizzati, su una breadboard, collegando fisicamente diversi cancelli insieme. La corrente elettrica consente lo scambio di segnali tra i gate, che porta al calcolo dell'uscita.

In biologia, la situazione è più complessa. Un gate booleano può essere realizzato come unità di trascrizione (TU; cioè la sequenza "promotore-codificante regione-terminatore" all'interno di cellule eucariotiche), dove la trascrizione o la traduzione (o entrambe) sono regolate. Quindi, almeno due tipi di molecole stabiliscono un cablaggio biologico: le proteine del fattore di trascrizione e gli RNA antisenso non codificanti¹.

Un circuito digitale genico è organizzato in due o tre strati di porte, vale a dire: 1) lo strato di ingresso, che è costituito da SÌ (buffer) e NON porte e converte le sostanze chimiche in ingresso in molecole di cablaggio; 2) il livello interno, che consiste di tanti TU quante sono le clausole nella corrispondente formula booleana. Se il circuito è progettato secondo la formula SOP, ogni clausola nello strato interno produrrà l'uscita del circuito (ad esempio, fluorescenza) in una cosiddetta architettura di uscita distribuita. Se viene utilizzata la formula del prodotto della somma (POS), è necessario uno strato finale 3), che conterrà un singolo gate moltiplicativo che raccoglie le molecole di cablaggio dallo strato interno.

Nel complesso, in biologia sintetica, molti schemi diversi possono essere progettati per lo stesso circuito. Differiscono nel numero e nel tipo di TU e molecole di cablaggio. Al fine di scegliere la soluzione più semplice da implementare nelle cellule di lievito, ogni progetto di circuito è associato a un punteggio di complessità S, definito come

dove A rappresenta il numero di attivatori, R rappresenta il numero di repressori e A è la quantità di molecole di RNA antisenso. Se gli attivatori o i repressori sono assenti dal circuito, il loro contributo a S è zero. Pertanto, è più difficile realizzare uno schema circuitale in laboratorio (alto S) quando richiede un numero elevato di fattori di trascrizione ortogonali. Ciò significa che nuovi attivatori e repressori devono essere progettati de novo per realizzare il cablaggio completo all'interno dei circuiti digitali. In linea di principio, nuove proteine leganti il DNA possono essere assemblate utilizzando le proteine Zinc Finger³ e gli effettori TAL⁴ come modelli. Tuttavia, questa opzione appare troppo ardua e richiede tempo; pertanto, si dovrebbe fare affidamento principalmente su piccoli RNA e regolazione della traduzione per finalizzare circuiti genici complessi.

Originariamente, questo metodo è stato sviluppato per fabbricare circuiti digitali nei batteri. Infatti, nelle cellule eucariotiche, invece che di RNA antisenso, è più adatto parlare di microRNA (miRNA) o piccoli RNA interferenti (siRNA)⁵. Tuttavia, la via dell'RNAi non è presente nel lievito S. cerevisiae. Quindi, si dovrebbe optare per reti completamente trascrizionali. Supponiamo che un circuito abbia bisogno di cinque attivatori e cinque repressori; il suo punteggio di complessità sarebbe S = 32. La complessità del circuito può essere ridotta sostituendo i 10 fattori di trascrizione con un singolo dCas9⁶ (Cas9 carente di nucleasi) fuso in un dominio di attivazione (AD). Come mostrato in⁷, dCas9-AD funziona come repressore nel lievito quando lega un promotore tra la scatola TATA e il TSS (sito di inizio della trascrizione) e come attivatore quando si lega bene a monte della scatola TATA. Pertanto, è possibile sostituire 10 fattori di trascrizione con una singola proteina di fusione dCas9-AD e 10 sgRNA (RNA guida singola) per un punteggio di complessità totale di S = 11. È facile e veloce sintetizzare dieci sgRNA, mentre, come precedentemente commentato, l'assemblaggio di 10 proteine richiederebbe un lavoro molto più lungo e complicato.

In alternativa, si potrebbero usare due proteine dCas ortogonali (ad esempio, dCas9 e dCas12a): una per fondersi con un AD, e l'altra nuda o in combinazione con un dominio di repressione. Il punteggio di complessità aumenterebbe di una sola unità (S = 12). Quindi, i sistemi CRISPR-dCas sono la chiave per la costruzione di circuiti digitali genici molto complessi in S. cerevisiae.

Questo documento caratterizza profondamente l'efficienza dei repressori e degli attivatori basati su dCas9 e dCas12a nel lievito. I risultati mostrano che non richiedono un'elevata quantità di sgRNA per ottimizzare la loro attività, quindi i plasmidi episomiali sono preferenzialmente evitati. Inoltre, gli attivatori basati su dCas9 sono molto più efficaci quando si utilizza uno scaffold RNA (scRNA) che recluta copie del VP64 AD. Al contrario, dCas12a funziona bene se fuso direttamente al potente VPR AD. Inoltre, un promotore sintetico attivato richiede un numero variabile di siti bersaglio, a seconda della configurazione dell'attivatore (ad esempio, tre quando si utilizza dCas12a-VPR, sei per dCas9-VP64 e solo uno con dCas9 e uno scRNA). Come repressore, dCas12a appare più incisivo quando si lega la regione codificante piuttosto che il promotore.

Come svantaggio, tuttavia, CRISPR-dCas9 / dCas12a non interagiscono direttamente con le sostanze chimiche. Pertanto, potrebbero non essere utili nel livello di input. Per questo motivo, sono stati studiati progetti alternativi di gate booleani contenenti proteine anti-CRISPR (Acrs). Gli Acr agiscono sulle proteine (d)Cas e ne inibiscono il funzionamento⁸. Quindi, sono un mezzo per modulare l'attività dei sistemi CRISPR-(d)Cas. Questo articolo analizza a fondo le interazioni tra il tipo II Acrs e (d)Cas9, così come il tipo V Acrs e (d)Cas12a in S. cerevisiae. Poiché gli Acr sono molto più piccoli delle proteine Cas, è stato costruito un gate NOT sensibile all'estrogeno β-estradiolo fondendo il dominio legante l'ormone del recettore degli estrogeni umani^9-HBD (hER) ad AcrIIA4. Inoltre, sono state realizzate una manciata di porte SÌ e NON che esprimevano costitutivamente dCas12a(-AD) e AcrVA dopo induzione con galattosio. Al momento, queste porte servono solo come prova di concetto. Tuttavia, rappresentano anche il primo passo verso un profondo ripensamento dell'algoritmo per effettuare la progettazione automatica computazionale di circuiti digitali genici sintetici nelle cellule di lievito.

Protocollo

1. Progettazione e costruzione della cassetta di espressione sgRNA/crRNA

NOTA: Esistono due tipi di cassette di espressione sgRNA/crRNA: SNR52^10-è composto dal promotore SNR52 RNA polimerasi III-dipendente, dalla sequenza sgRNA/crRNA e dal terminatore SUP4; un altro, abbreviato in RGR¹¹, è costituito dal promotore ADH1 RNA polimerasi II-dipendente, dalla struttura RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) che contiene due ribozimi (un ribozima martello-HH e un ribozima delta virus dell'epatite ribozima-HDV) e la sequenza del sgRNA/crRNA intermedio e il terminatore ADH1. Gli omologhi sgRNA che guidano Cas9 sono costituiti da una sequenza distanziatrice e dalla caratteristica ripetizione diretta¹², mentre il crRNA per le proteine Cas12a comprende la ripetizione diretta seguita dalla sequenza spaziatrice^13,14 (vedere la Tabella supplementare 1 per tutte le sequenze di DNA utilizzate in questo studio).

1. Progettare la sequenza distanziatrice per l'attivazione trascrizionale mediata da Cas9/Cas12a.
   1. Sfruttare la sequenza batterica dell'operatore lex (denominata lexOp) come sito bersaglio ^15,16 e inserirla nel promotore CYC1 che guida l'espressione della proteina fluorescente verde potenziata dal lievito (yEGFP)¹⁷. Quindi, la sequenza di spaziatori è definita e complementare al lexOp inserito.
2. Controllare l'ortogonalità della sequenza distanziatrice tramite lo strumento CRISPRDIRECT¹⁸.
   1. Incollare la sequenza lexOp affiancata dalla sequenza PAM nel campo di testo, definire la sequenza PAM come NRG per dCas9 e TTTV per dCas12a e specificare la specie dall'elenco a discesa come Lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Clicca su Design. Assicurati che non ci sia alcun sito di destinazione corrispondente nella ricerca 20mer + PAM né nella ricerca 12mer + PAM.
3. Costruire la cassetta di espressione sgRNA/crRNA.
   1. Utilizzare la PCR touchdown per amplificare le sequenze di DNA di parti biologiche standard, come promotori, sequenze di codifica e terminatori.
      1. Preparare una miscela di reazione contenente: 20-40 ng di modello di DNA, 1 μL di primer forward da 10 μM (cioè ot25, costruzione plasmidica di espressione sgRNA/crRNA), 1 μL di primer inverso da 10 μM (cioè ot26, costruzione plasmidica di espressione sgRNA/crRNA), 5 μL di miscela dNTP da 2,5 mM, 0,5 μL di DNA polimerasi, 10 μL di tampone di reazione 5x DNA polimerasi, e acqua bidistillata (ddH₂O) fino ad un volume totale di 50 μL.
         NOTA: Fare riferimento alla Tabella supplementare 2 per un elenco dei primer utilizzati in questo studio.
      2. Eseguire il programma PCR touchdown su un termociclatore:
         Fase 1: 98 °C per 30 s.
         Fase 2 con 10 cicli: 98 °C per 10 s, 68 °C per 20 s e 72 °C per 15 s.
         Fase 3 con 25 cicli: 98 °C per 10 s, 59 °C per 20 s e 72 °C per 15 s.
         Tappa 4: 72 °C per 2 min.
         Infine, tenere a 4 °C fino all'inizio degli esperimenti di follow-up.
         NOTA: I 68 °C nella fase 2 e i 59 °C nella fase 3 dipendono dalle temperature di fusione dei primer sia avanti che indietro, che variano da diverse coppie di primer. Il tempo a 72 °C negli stadi 2 e 3 è determinato dalla lunghezza del prodotto PCR e dalla velocità della DNA polimerasi.
   2. Isolare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel (100 V, 30 min). Eluire le sequenze di DNA dal gel di agarosio tramite un kit di estrazione del gel di DNA (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Un gel di agarosio allo 0,8% è richiesto per frammenti più lunghi di 500 nt, un gel di agarosio all'1,5% per frammenti tra 100 nt e 500 nt e un gel di agarosio al 2% per frammenti più corti di 100 nt.
   3. Inserire l'TU che esprime sgRNA/crRNA in un vettore shuttle¹⁹ pRSII404/424, che contiene il gene di resistenza all'ampicillina e il gene marcatore auxotrofico selezionabile dal lievito-TRP1.
      1. Digerire il vettore shuttle a 37 °C per 1 ora con i due enzimi di restrizione SacI e Acc65I. Preparare la miscela di reazione aggiungendo 5 μg del vettore shuttle, le quantità raccomandate di enzimi, tampone di digestione (secondo le istruzioni enzimatiche) e ddH₂O fino a un volume totale di 30 μL.
      2. Verificare la digestione vettoriale dello shuttle mediante elettroforesi su gel (vedere il sottopassaggio 1.3.2). Quindi, inattivare i due enzimi a 65 °C per 20 minuti.
      3. Utilizzare il metodo di assemblaggio Gibson 20 per inserire i prodotti PCR purificati nel vettore shuttle cut-open lasciando entrare la miscela di DNA equimolare a⁵⁰ °C per 1 ora.
      4. Trasformare le cellule competenti di Escherichia coli DH5α con la miscela di reazione di Gibson sopra riportata tramite il metodo di trasformazione da shock termico²¹. Trasferire le cellule trasformate di E. coli su piastre di agar Luria-Bertani (LB) contenenti ampicillina (0,1 g/L). Mettere le piastre nell'incubatore a 37 °C e lasciare crescere le cellule durante la notte.
      5. Prelevare quattro colonie dalla piastra di agar LB e coltivarle separatamente per una notte a 37 °C in soluzione di ampicillina contenente ampicillina (0,1 g/L). Quindi, utilizzare la procedura di mini-preparazione per estrarre i plasmidi dalle cellule di E. coli ²².
      6. Utilizzare i primer ot18 e ot19 (vedere la Tabella supplementare 2 per le sequenze oligo) per sequenziare e confermare l'unità di trascrizione inserita tramite il metodo Sanger²³.
         NOTA: In esperimenti successivi, i plasmidi costruiti e confermati saranno inseriti nel genoma del lievito tramite il protocollo PEG / LiAc²⁴.

2. Progettazione e costruzione della cassetta di espressione dell'RNA dello scaffold

NOTA: L'RNA guida dello scaffold (scRNA) è composto dalla sequenza di sgRNA e dalle strutture a forcina MS2²⁵. In questo lavoro vengono utilizzati due tipi di strutture a forcina MS2: hairpin-wt MS2 wild-type e aptamer-f6 MS2 coat protein (MCP).

1. Sintetizzare un modello di scRNA che è in grado di ospitare diverse sequenze di spaziatori (ad esempio, pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
   NOTA: In questo studio, il modello di scRNA è stato sintetizzato da una società di sintesi genica (vedi Tabella dei materiali).
2. Progettare primer appropriati (vedere Tabella supplementare 2) per eseguire la PCR sulle sequenze di distanziatori necessarie.
3. Seguire le procedure descritte al punto 1.3 per costruire una cassetta di espressione scRNA.

3. Ingegneria dSpCas9 e costruzione di plasmidi di espressione

1. Ottenere il pTPGI_dSpCas9_VP64 plasmidico (vedere Tabella dei materiali).
2. Costruire il vettore accettore pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basato sul vettore shuttle pRSII406, tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passo 1.3). Il plasmide fornisce un forte promotore costitutivo-pGPD e un terminatore-CYC1t.
3. Digerire il plasmide pTPGI_dCas9_VP64 e il vettore accettore di nuova costruzione (5 μg per 1 ora o 10 μg per la notte; vedere il punto 1.3.3.1 come riferimento) con XbaI e XhoI a 37 °C. Separare e purificare il frammento di inserto e il vettore accettore come al punto 1.3.2.
4. Argare il frammento di inserto purificato e il vettore accettore con T4 DNA ligasi a 16 °C per 8 ore. Preparare la soluzione di legatura aggiungendo 50-100 ng del vettore accettore purificato, frammenti bersaglio purificati in quantità equimolare con il vettore accettore, 1,5 μL di tampone T4, 0,5 μL di T4 ligasi e ddH₂O fino ad un volume totale di 15 μL.
5. Seguire i passaggi 1.3.3.3 e 1.3.3.4. Quindi, confermare che il plasmide di nuova costruzione sia corretto mediante digestione con XbaI e Xhol (37 °C, 1 ora) ed elettroforesi su gel (vedere punto 1.3.2).

4. Ingegneria dCas12a e costruzione di plasmidi

1. Costruire i plasmidi che esprimono dCas12a-AD.
   1. Sintetizzare due proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito (denAsCas12a e dLbCas12a) affiancate da siti enzimatici di restrizione BamHI e Xhol.
      NOTA: In questo studio, le due proteine dCas12a ottimizzate per il codone di lievito sono state sintetizzate da una società di sintesi genica (vedi Tabella dei materiali).
   2. Costruire il vettore accettore pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson (vedere passo 1.3), dove il "promotore" è pGPD o pGAL1, "sp" rappresenta una breve sequenza casuale e "AD" è VPR o VP64.
   3. Inserire ciascuna proteina dCas12a nei due vettori accettori di nuova costruzione tramite digestione con BamHI e XhoI e legatura con T4 DNA ligasi (fare riferimento ai punti 3.3 e 3.4).
2. Costruire i plasmidi che esprimono un dCas12a nudo.
   1. Costruire un vettore accettore per le cassette di espressione inducibili dal galattosio di dCas12a come pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t usando la PCR touchdown e il metodo di assemblaggio Gibson (vedere il passo 1.3).
   2. Digerire i plasmidi contenenti le proteine dCas12a e il vettore accettore sopra riportato con BamHI e Xhol, quindi ligarli con T4 DNA ligasi per ottenere il plasmide pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (fare riferimento ai passaggi 3.3 e 3.4).
   3. Digerire il plasmide ottenuto al punto 4.2.2 con Acc65I e BamHI, quindi sostituire pGAL1 con pGPD tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson per costruire pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Ingegneria proteica anti-CRISPR e costruzione di plasmidi

NOTA: Tre tipi di promotori sono stati impiegati per guidare l'espressione di Acrs: un promotore inducibile-pGAL1, quattro promotori costitutivi del lievito-pGPD, pACT1, pTEF1 e pTEF2 e un promotore costitutivo sintetico-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. Ottenere i plasmidi contenenti le sequenze di Acr di tipo II (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ e AcrIIA5²⁸) e di tipo V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 e AcrVA5²⁹) da una società di sintesi genica.
2. Costruire i plasmidi in base al vettore shuttle pRSII403 per esprimere Acrs.
   1. Costruire cassette di espressione AcrIIA.
      NOTA: Utilizzare la PCR touchdown per amplificare quattro diversi promotori (cioè pGPD, pACT1, pTEF2 e genCYC1t_pCYC1noTATA), i tre tipi di AcrIIA e due terminatori (ADH1t e CYC1t). Costruire una serie di TU che esprimono AcrIIA, sotto diversi promotori, tramite il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passaggio 1.3).
   2. Costruire cassette di espressione AcrVA.
      1. Sintetizzare la sequenza accettore: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, dove "sp" è una sequenza casuale che verrà sostituita da AcrVA in seguito.
         NOTA: In questo studio, le sequenze accettori sono state sintetizzate da una società di sintesi genica (Table of Materials).
      2. Assemblare i vettori accettori pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, dove il "promotore" è: pGAL1, pTEF1 e genCYC1t_pCYC1noTATA. Utilizzare il metodo di assemblaggio Gibson (fare riferimento al passaggio 1.3).
      3. Inserire ciascuno dei tre AcrVA nel vettore accettore descritto al punto 5.2.2.2 (tramite touchdown PCR e il metodo di assemblaggio Gibson [vedere punto 1.3]) per costruire un insieme di plasmidi che producono AcrVA.
3. Ingegnerizzare ulteriormente AcrIIA4 estendendo la sua sequenza con le sequenze del linker GS e HBD(hER). Ciò consente la costruzione di un circuito β-estradiolo-responsivo.
   1. Utilizzare la PCR touchdown per ottenere separatamente le parti GS-HBD e AcrIIA4 (vedere il punto 1.3.1).
   2. Inserire AcrIIA4, GS-HBD e il vettore shuttle nella miscela Gibson e costruire il plasmide completo utilizzando il metodo Gibson (vedere il punto 1.3.3).

6. Rilevazione di crRNA: RT-qPCR e progettazione di primer

NOTA: il rilevamento del crRNA è stato ottenuto tramite RT-qPCR, che è organizzato in tre fasi.

1. Eseguire l'estrazione e la purificazione dell'RNA dalle cellule di lievito tramite un kit di RNA.
   1. Colture di cellule di lievito per una notte in 2 mL di terreno completo definito sintetico (SDC, 1 L volume: 20 g di glucosio, 2 g di miscela AA, 6,7 g di YNB, 396 mg di leucina, 79,2 mg di triptofano, 79,2 mg di istidina e 79,2 mg di uracile) utilizzando una piastra a 24 pozzetti (240 rpm, 30 °C).
   2. Al mattino, diluire la coltura cellulare (1:100) in 2 ml di SDC fresco e continuare a far crescere le cellule di lievito a 30 °C, 240 giri/min, per altre 4 ore.
   3. Raccogliere tutti i 2 ml della soluzione cellulare e centrifugare a 20.238 x g per 2 minuti. Rimuovere accuratamente il surnatante poiché il pellet cellulare è piccolo.
   4. Estrarre l'RNA dalle cellule di lievito utilizzando un kit di RNA.
   5. Controllare la qualità dell'RNA.
      1. Preparare un gel di agarosio all'1%. Mescolare 5 μL di ciascun campione di RNA con 1 μL di colorante di carico del DNA. Quindi caricare la miscela sul gel ed eseguirla.
      2. Assicurarsi che sul gel siano presenti due bande chiare a ~4.000 nt e ~2.000 nt, corrispondenti all'RNA ribosomiale (25S/18S). Un'ulteriore banda sfocata può essere vista a ~ 80 nt per il tRNA.
   6. Utilizzare immediatamente i campioni di RNA per la sintesi del cDNA o conservarli a -80 °C per un uso futuro.
2. Trascrizione inversa: utilizzare il metodo stem-loop 30 per formare il primo filamento di cDNA corrispondente al crRNA (⁴⁰ nt). Per la trascrizione inversa dello sgRNA (quasi 100 nt), la procedura è la stessa di quella per la sintesi di cDNA del gene di riferimento ACT1.
   NOTA: Il metodo per la trascrizione inversa del crRNA è diverso da quello utilizzato con l'sgRNA e l'mRNA ACT1 . Poiché il crRNA è molto corto, è stato trattato come un microRNA e ha utilizzato il metodo di trascrizione inversa dei microRNA (approccio stem-loop) per ottenere il corrispondente cDNA. Due kit di sintesi del cDNA (un kit stem-loop per il crRNA e un usuale kit di trascrizione inversa per il gene ACT1 ) sono stati utilizzati nella quantificazione del crRNA. La stessa quantità di RNA è stata utilizzata nei due kit (vedi Tabella dei materiali) per rendere comparabili i risultati dell'esperimento. Il primer utilizzato con il kit stem-loop è stato progettato secondo la sequenza stem-loop e gli ultimi sei nucleotidi all'estremità 3' del crRNA (per la sequenza stem-loop e primer, vedi Tabella supplementare 2).
   1. Metodo stem-loop per la trascrizione inversa di crRNA
      1. Prendi il modello di RNA, il primer e i tamponi dal congelatore e lasciali sciogliere sul ghiaccio.
      2. Rimozione del DNA genomico: in primo luogo, preparare 10 μL della miscela di reazione secondo le istruzioni del kit. Mettere la miscela in un termociclatore a 42 °C per 2 min. Infine, trasferirlo sul ghiaccio.
      3. Sintesi del primo filamento di cDNA: preparare 20 μL della miscela di reazione aggiungendo 10 μL della miscela dal punto 6.2.1.2, 1 μL di primer stem-loop (concentrazione di 2 μM), 2 μL di tampone di reazione RT 10x, 2 μL di miscela enzimatica di trascrizione inversa (contenente la trascrittasi inversa) e 5 μL di H₂O privo di RNasi.
      4. Mettere la miscela di reazione in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 25 °C per 5 min, 50 °C per 15 min e 85 °C per 5 min. Utilizzare immediatamente il prodotto per la reazione qPCR o conservarlo a -80 °C.
   2. trascrizione inversa di sgRNA e mRNA ACT1
      1. Prima reazione: preparare una miscela da 13 μL composta dalla miscela di primer, miscela dNTP, modello di RNA (50 pg-5 μg) e acqua priva di RNasi (a parte il modello di RNA, tutto fornito dal kit), secondo le istruzioni del kit. Utilizzare 1 μg di modello di RNA. Mettere la miscela in un termociclatore a 70 °C per 10 minuti.
      2. Seconda reazione (sintesi del cDNA): preparare la miscela di reazione aggiungendo i reagenti (come descritto nelle istruzioni del kit) ai 13 μL della prima soluzione di reazione fino ad un volume finale di 20 μL. Porre la miscela in un termociclatore per 15 minuti a 50 °C e poi per altri 5 minuti a 85 °C. Utilizzare immediatamente il prodotto per la reazione qPCR o conservarlo a -80 °C.
3. Kit SYBR per qPCR: rilevamento del valore Ct
   NOTA: Il primer inverso utilizzato nella qPCR del crRNA è fisso perché corrisponde al complemento inverso della sequenza stem-loop (vedi Tabella supplementare 2). Il primer in avanti, al contrario, è variabile e dipende dalla sequenza del crRNA. I primer avanti e indietro per la qPCR di sgRNA e ACT1 mRNA sono progettati in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Due primer vengono scelti quando la differenza tra le loro temperature di fusione non è superiore a 2 °C (vedi tabella supplementare 2). Ogni campione viene misurato in tre repliche.
   1. Preparare la miscela di reazione qPCR secondo le istruzioni del produttore per il kit SYBR.
   2. Impostare il seguente programma qPCR in una macchina real-time PCR.
      Preincubazione: 10 min a 95 °C.
      Stadio PCR: 15 s a 95 °C, seguito da 34 s a 55 °C. Impostare il ciclo della fase PCR su 45 volte. Fase di fusione: 10 s a 95 °C, seguita da 60 s a 65 °C e infine 1 s a 97 °C.
   3. Calcolare i valori relativi di espressione dell'mRNA tramite la formula³¹ di Pfaffl.

7. Immunofluorescenza per rilevare le proteine Cas

NOTA: Le proteine Cas (CasP) sono fuse in un His_tag.

1. Preparazione delle cellule di lievito
   1. Prelevare alcune cellule di lievito usando un ciclo sterile e coltivarle in 5 ml di terreno ricco di YPD durante la notte a 240 giri / min a 30 ° C. Al mattino, aggiungere 500 μL della soluzione cellulare a 20 ml di YPD fresco e farli crescere a 240 giri/min a 30 °C fino a quando OD₆₀₀ raggiunge 0,6.
   2. Prendi 5 ml di coltura e mescolala con 500 μL di formaldeide al 37%. Lasciare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.500 x g per 5 minuti.
   3. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di tampone di fissazione (0,1 M KH 2 PO₄, 0,5 M MgCl₂, 3,7% formaldeide, pH = 6,5). Mantenere la soluzione cellulare a RT per 20 minuti.
   4. Centrifugare la soluzione cellulare a 1.500 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio (0,1 M KH 2 PO 4,_1,2M sorbitolo, pH = 6,5) integrato con 4 μL di beta-mercaptoetanolo e₄ μL di soluzione di lisato (5 mg/ml). Mettere la soluzione cellulare in un incubatore a 37 °C per 20 minuti.
   5. Centrifugare la soluzione cellulare a 1.500 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet cellulare due volte con 1 mL di PBS mediante centrifugazione (1.500 x g per 5 minuti).
   6. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS più 0,05% Tween 20 e aggiungere 4 μL di soluzione di BSA (10 mg/ml). Mantenere la soluzione cellulare a RT per 20 minuti.
2. Incubazione con anticorpo primario
   1. Aggiungere l'anticorpo primario anti-His tag alla miscela al punto 7.1.6 con una diluizione 1:400. Mantenere la soluzione a RT per 2 ore.
   2. Centrifugare la miscela al punto 7.2.1 a 1.500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBST e centrifugare (1.500 x g) per 5 minuti per lavare il pellet cellulare. Ripetere questa operazione due volte. Infine, scartare il surnatante e sospendere le cellule in 100 μL di 1x PBST.
3. Rilevamento di cellule al microscopio
   1. Montare le celle su una diapositiva; prelevare 2 μL della soluzione cellulare dal punto 7.2.2 e posizionarla su un vetrino. Coprilo con un foglietto.
   2. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza. Accendere la sorgente luminosa fluorescente, il microscopio e il computer. Annotare il numero della sorgente luminosa fluorescente e aprire il software del microscopio sul computer.
   3. Metti il vetrino sul palco del microscopio. Scegli l'obiettivo 40x e osserva le celle sotto la luce verde (550 nm). Spostare la manopola di messa a fuoco grossolana fino a quando non appare il contorno delle cellule di lievito. Spostare la manopola di messa a fuoco fine per mettere a fuoco le celle.
   4. Rileva le cellule con il software del microscopio. Chiudere il campo visivo del microscopio e passare allo schermo del computer. Fare clic su Live, attendere 3-5 secondi e fare clic su Cattura per scattare una foto. Salvare l'immagine.
   5. Spegnere il computer, il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente.

8. Acquisizione dati: FACS

NOTA: La fluorescenza verde viene rilevata tramite citometria a flusso (cioè misurazioni di selezione cellulare attivata da fluorescenza [FACS]). Le cellule di lievito vengono coltivate, in generale, a 30 °C e 240 giri/min per eseguire esperimenti FACS. Tuttavia, le cellule potrebbero richiedere alcune precauzioni a seconda del loro contenuto genetico. Le cellule che contengono il gene dCas12a-VPR (controllato dal promotore costitutivo GPD ) devono essere coltivate per 24 ore nella soluzione SDC. Successivamente, le cellule vengono diluite con un rapporto di 1:100 in SDC fresco e coltivate per altre 12 ore prima di misurare l'intensità della fluorescenza. Anche le cellule modificate con il gene AcrIIA4-HBD(hER) richiedono la diluizione. Inoltre, OD₆₀₀ deve essere controllato. In primo luogo, le cellule possono crescere in SDC durante la notte (oltre 14 ore). Al mattino, viene misurato OD₆₀₀ . Quindi la coltura viene diluita in SDC, fornita con una concentrazione diversificata di β-estradiolo, fino a OD₆₀₀ = 0,1. Prima degli esperimenti FACS, le cellule vengono coltivate per altre 7 ore in modo tale che OD₆₀₀ raggiunga 0,8-1,0. Le cellule che esprimono dCas9-VP64 o dCas12a-VP64 vengono coltivate in SDC per 20-24 ore senza diluizione e ulteriore crescita prima delle misurazioni presso la macchina FACS.

1. Accendere la macchina FACS 20 minuti prima delle misurazioni per riscaldare il laser.
2. Preparare i campioni (diluizione): mescolare 20 μL della coltura cellulare con 300 μL di ddH₂O.
3. Eseguire il software FACS sul computer collegato al computer FACS e creare un nuovo esperimento. Impostare i parametri di misurazione (ad esempio, FSC(SSC)-A/H/W e istogramma).
4. Selezionare il filtro in base alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei campioni. Ad esempio, la proteina bersaglio qui è yEGFP, le cui lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono rispettivamente 488 nm e 507 nm. Quindi, selezionare il filtro FITC o GFP (lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm; lunghezza d'onda di emissione: 527/32 nm). Impostare il numero di cella di acquisizione su 10.000.
5. Regolare la tensione del filtro FITC misurando l'intensità delle sfere fluorescenti. Assicurarsi che la differenza relativa nell'intensità delle perle tra due esperimenti consecutivi non superi il 5%.
6. Lavare la macchina con ddH₂O per alcuni secondi per rimuovere eventuali perline in eccesso.
7. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione. Fare clic su Anteprima e attendere 3-5 s per la stabilità dell'iniezione del campione. Infine, fai clic su Acquisisci.
8. Misurare nuovamente le perline alla fine dell'esperimento. La tensione è quella utilizzata durante la misurazione iniziale delle sfere (vedere passo 8.4, 438-441 V). Controllare se la differenza relativa tra le misure delle due perle supera il 5%.
9. Esportare i dati FACS come file FCS.
10. Analizza i file FCS con il software R Studio.

9. Analisi dei dati

NOTA: utilizzare il pacchetto 32 di Flowcore R Bioconductor all'interno di R studio. I file FCS sono stati analizzati utilizzando uno script scritto in linguaggio R.

1. Aprire R studio e caricare l'analisi Bdverse dello script. R per analizzare i file FCS.
2. Impostare il nome dell'esperimento (ename), la directory (percorso) in cui si trovano i file FCS
   Archiviato (dir_d) e dove verranno creati i file dei risultati (dir_r).
3. Impostare il canale di fluorescenza. Ad esempio, select_ch = "GPA-A" se è stata misurata la fluorescenza verde.
4. Impostare il numero di campioni misurati (s_num).
5. Impostate le dimensioni di ciascun dot plot (sxlim, sylim). Impostate la lunghezza massima degli assi x e y per i grafici a barre e i box plot (xlimit, ylimit). xlimit deve essere maggiore o uguale a s_num.
6. Scegliere il metodo di gating rimuovendo il # dalle righe corrispondenti.
   NOTA: morphGate è un metodo di gating automatico eseguito dallo script (cioè, la regione dei grafici di punti in cui le celle sono più dense viene riconosciuta e selezionata dal programma). polygonGate e rectangleGate richiedono di esaminare i grafici a punti e definire i vertici di un poligono o il lato di un rettangolo che abbraccia la zona in cui si trova la maggior parte delle celle.
7. Selezionare l'oggetto flowSet gated, corrispondente al metodo di gating scelto. Selezionare la risoluzione del dot plot (res; deve essere almeno uguale a 256).
8. Decommentare flt_low <- filter_low(sp) per rimuovere le misurazioni in cui la fluorescenza è negativa. Rimuovi il commento flt_sp <- filter(flt_lw) per rimuovere i valori anomali dovuti ad altri esperimenti.
9. Premere Source ed eseguire lo script. Tutti i file contenenti i risultati dell'analisi vengono creati in dir_r.

Risultati

Espressione di sgRNA/crRNA da parte di un promotore di tipo III della RNA polimerasi
In primo luogo, questo lavoro ha affrontato l'ingegneria del circuito di attivazione trascrizionale (circuito 1) mostrato nella Figura 1A. Conteneva tre componenti di base: 1) il gene che codifica per yEGFP (il reporter), che è stato preceduto da una serie di diversi promotori sintetici che hanno fornito siti bersaglio per dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versione ottimizzata per il codone di l...

Discussione

Il protocollo ha mostrato un possibile flusso di lavoro completo per circuiti digitali di geni sintetici, seguendo il ciclo di ingegneria biologica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e riguardante sia esperimenti di laboratorio secco che di laboratorio umido. Qui, ci siamo concentrati sul sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a e le corrispondenti proteine anti-CRISPR, progettando e costruendo in S. cerevisiae piccole reti trascrizionali. Alcuni di loro imitavano le porte booleane, che s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per PCR da 0,1 mL a 8 strisce	NEST	403112
Provette per PCR da 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
Microprovette da 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Provette da centrifuga da 15 mL	BIOFIL	CFT011150
2 mL Microprovette	Axygen	MCT-200-C
Provette da centrifuga da 50 mL	BIOFIL	CFT011500
Agarosio-grado di biologia molecolare	Invitrogen	75510-019
Ampicillina sale sodico	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti Termociclatore a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep Kit di estrazione del gel di DNA	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS& Amp; Perle di ricerca T	BD	650621	Perle fluorescenti
BD FACSVicitometro a flusso aziendale	BD-Centrifuge
	Eppendorf	5424
Centrifuge Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli cellule competenti (Ceppo DH5&alfa;)	Life Technologies	18263-012
ECL seleziona il reagente di rilevamento Western Blotting	GE Healthcare	RPN2235
Apparecchio per elettroforesi	Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
Tappi piatti a 8 strisce	NEST	406012
Società di sintesi genica	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
Kit di sintesi di cDNA HiFiScript	CWBIO	CW2569M	Kit utilizzato nella fase 6.2.2.1
Soluzione di lisato (Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 80i	Nikon	-	Microscopio a fluorescenza
Punte di pipette— 10 μ L	Axygen	T-300-R-S
Punte per pipette— 1000 μ L	Axygen	T-1000-B-R-S Punte per
pipette— 200 μ L	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs	M0491
Enzima di restrizione-Acc65I	New England Biolabs	R0599
Enzima di restrizione-BamHI	New England Biolabs	R0136
Enzima di restrizione-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
Enzima di restrizione-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96	Strumento Roche-Real-Time		PCR
S. cerevisiae CEN. PK2-1C	-	-	Il ceppo genitore. Il genotipo è: MATa; il suo3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit SUC2
Stem-Loop	SparkJade	AG0502	Kit utilizzato nel passaggio 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M0202
T5 Esonucleasi	New England Biolabs	M0363
Taq DNA ligasi	New England Biolabs	M0208
Taq DNA polimerasi	New England Biolabs	M0495
TB Premix verde Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (colorante SYBR Green I)	Takara	RR820Q
Kit RNA YeaStar	Zymo Research	R1002
β-estradiolo	Sigma-Aldrich	E8875