Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina¹. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro^2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante ^4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l'assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9. Un'altra limitazione del pulldown convenzionale è la verifica della possibile attività di eteromultimerizzazione tra domini che possono esistere come omo-oligomeri stabili assemblati co-traduzionalmente ^8,10, poiché molti di essi non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro durante il tempo di incubazione. La co-espressione è risultata utile per superare tali problemi ^3,11. La co-espressione utilizzando vettori compatibili nei batteri è stata utilizzata con successo per purificare grandi complessi macromolecolari multi-subunità, incluso il complesso repressivo policomb PRC2¹², il modulo testa del mediatore della RNA polimerasi II¹³, il batteriofago T4 baseplate 14, il modulo di deubiquitinylasi del complesso SAGA 15,16 e la ferritina ¹⁷. Le origini di replica comunemente usate per la co-espressione sono ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ e RSF²⁰. Nel sistema di espressione Duet disponibile in commercio, queste origini sono combinate con diversi geni di resistenza agli antibiotici e convenienti siti di clonazione multipli per produrre vettori policistroni, consentendo l'espressione di un massimo di otto proteine. Queste origini hanno numeri di copie diversi e possono essere utilizzate in varie combinazioni per raggiungere livelli di espressione equilibrati delle proteine bersaglio²¹. Per testare le interazioni proteina-proteina, vengono utilizzati vari tag di affinità; i più comuni sono la 6xIstidina, la glutatione-S-transferasi (GST) e la proteina legante il maltosio (MBP), ognuno dei quali ha un'affinità specifica con la resina corrispondente. GST e MBP migliorano anche la solubilità e la stabilità delle proteine marcate²².

Sono stati inoltre sviluppati numerosi metodi che coinvolgono la co-espressione proteica nelle cellule eucariotiche, il più importante dei quali è il saggio a due ibridi di lievito (Y2H)²³. Il test Y2H è economico, facile e consente di testare più interazioni; Tuttavia, il completamento del flusso di lavoro richiede più di 1 settimana. Esistono anche alcuni saggi basati su cellule di mammifero meno frequentemente utilizzati, ad esempio il saggio fluorescente a due ibridi (F2H)²⁴ e il saggio di interazione proteina-proteina (CAPPIA)²⁵. Il test F2H è relativamente veloce, consentendo di osservare le interazioni proteiche nel loro ambiente cellulare nativo, ma comporta l'uso di costose apparecchiature di imaging. Tutti questi metodi hanno un vantaggio rispetto all'espressione procariotica che fornisce la traduzione eucariotica nativa e l'ambiente di piegatura; Tuttavia, rilevano l'interazione indirettamente, sia per attivazione trascrizionale che per trasferimento di energia fluorescente, che spesso produce artefatti. Inoltre, le cellule eucariotiche possono contenere altri partner di interazione di proteine di interesse, che possono interferire con il test delle interazioni binarie tra proteine di eucarioti superiori.

Il presente studio descrive un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate in modo differenziale seguito da tecniche convenzionali di pulldown. Il metodo consente di studiare le interazioni tra proteine bersaglio che richiedono co-espressione. È più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale, consentendo il test in batch di più obiettivi, il che lo rende vantaggioso nella maggior parte dei casi. La co-espressione usando vettori compatibili è più conveniente della co-espressione policistronica poiché non richiede una laboriosa fase di clonazione.

La rappresentazione schematica del flusso di lavoro del metodo è illustrata nella Figura 1.

1. Co-trasformazione di E. coli

1. Preparare vettori di espressione per proteine bersaglio utilizzando metodi di clonazione standard.
   NOTA: Tipicamente, un buon punto di partenza è quello di utilizzare vettori pGEX/pMAL convenzionali che portano un gene di resistenza all'ampicillina e l'origine ColE1 per l'espressione di proteine marcate con GST / MBP e un vettore compatibile con origine p15A o RSF e resistenza alla kanamicina per esprimere proteine marcate con 6xHis, in alcuni casi combinate con tioredossina o SUMO-tag per aumentare la solubilità. Di solito, diverse combinazioni di tag devono essere testate prima dell'esperimento. Il metodo descritto è conveniente per testare in batch le condizioni di espressione delle proteine bersaglio. È importante notare che la maggior parte dei ceppi di Rosetta contiene già il plasmide con origine p15A per esprimere i tRNA per il codone raro, quindi se l'uso di tali ceppi è una possibile opzione, i plasmidi p15A dovrebbero essere evitati. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli.
   1. Coltivare batteri di un ceppo appropriato in mezzi di Luria-Bertani (LB) a 37 °C fino a una densità ottica (OD) di 0,1-0,2. Il ceppo BL21 (DE3) è stato utilizzato come esempio in questo studio.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare cellule competenti appena preparate per ottenere una co-trasformazione efficiente con due vettori. Se più di due vettori devono essere co-trasformati, è meglio trasformarli sequenzialmente per ottenere una buona efficienza di trasformazione. L'elettroporazione è una buona alternativa.
   2. Centrifugare 1,0 mL della sospensione batterica per 1 minuto a 9.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   3. Aggiungere 0,5 mL di tampone di trasformazione del tampone ghiacciato (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 e 15 mM CaCl₂) e incubare per 10 minuti su ghiaccio.
   4. Centrifugare per 30 s a 8.000 x g a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   5. Aggiungere 100 μL di tampone TB, aggiungere 100 ng di ciascun vettore e incubare per 30 minuti su ghiaccio. Trasformare separatamente singoli vettori per studiare il comportamento delle proteine senza co-espressione. Inoltre, co-trasformare i vettori di espressione in coppie con vettori di co-espressione vuoti per controlli di associazione non specifici.
      NOTA: Negli esempi forniti in questo studio, i vettori pGEX/pMAL con corrispondenti cDNA fusi a cDNA GST/MBP sono stati utilizzati in combinazione con vettori derivati da pACYC compatibili recanti domini proteici partner codificanti cDNA fusi con cDNA tioredossina.
   6. Riscaldare a 42 °C per 150 s, quindi raffreddare per 1 minuto su ghiaccio.
   7. Aggiungere 1 mL di liquido LB senza antibiotici e incubare a 37 °C per 90 minuti. Piastra su piastre di agar LB contenenti 0,5% di glucosio e corrispondenti antibiotici (le concentrazioni comuni sono: 50 mg/L di ampicillina; 20 mg/L di kanamicina; 50 mg/L di streptomicina; 35 mg/L di cloramfenicolo). Incubare le piastre per una notte a 37 °C.

2. Espressione

1. Lavare le cellule dalla piastra con 2 ml di media LB liquido in 50 ml di media LB con antibiotici corrispondenti (concentrazioni comuni sono: 50 mg / L di ampicillina; 20 mg / L di kanamicina; 50 mg / L di streptomicina; 35 mg / L di cloramfenicolo). Aggiungere ioni metallici o altri cofattori noti (negli esempi forniti in questo studio, 0,2 mM ZnCl₂ è stato aggiunto al supporto). Conservare un'aliquota con glicerolo al 20% a -70 °C per una successiva ripetizione dell'esperimento.
   NOTA: Si raccomanda di lavare diverse colonie direttamente dalla piastra per escludere la possibilità di cattiva espressione in un singolo clone isolato a causa di eventi occasionali di ricombinazione tra due plasmidi.
2. Far crescere le cellule con una rotazione costante di 220 rpm a 37 °C a un OD di 0,5-0,7, raffreddare a temperatura ambiente (RT) e aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopyranoside (IPTG) a 1 mM. Conservare un'aliquota di 20 μL di sospensione cellulare come controllo del campione non indotto.
3. Incubare le cellule con una rotazione costante di 220 rpm a 18 °C durante la notte.
   NOTA: Il tempo e la temperatura ottimali di incubazione possono variare; 18 °C durante la notte funziona meglio per la maggior parte delle proteine e si consiglia di provare di default. Ridurre il tempo di incubazione a 2-3 ore se si osserva un forte legame non specifico.
4. Dividere la sospensione batterica in due parti (o più se sono stati utilizzati più di due tag diversi) e conservare un'aliquota di 20 μL della sospensione cellulare per confermare l'espressione proteica. Centrifugare a 4.000 x g per 15 min.
   NOTA: Punto di pausa: i pellet batterici possono essere conservati a -70 °C per almeno 6 mesi.

3. Saggio di pulldown

NOTA: Le procedure dettagliate sono descritte per le proteine marcate con 6xHis o MBP/GST. Tutte le procedure vengono eseguite a 4°C.

1. Risospendere i pellet batterici in 1 mL di tampone di lisi ghiacciato con inibitori della proteasi e agenti riducenti (vedi sotto) aggiunti immediatamente prima dell'esperimento. Evitare il ditiotreitolo (DTT) quando si utilizzano resine chelanti dei metalli poiché elimina gli ioni metallici. Regolare la composizione del tampone per le proteine testate. Le ricette comuni di tamponi di lisi trovati adatti per la maggior parte delle proteine sono:
   1. 6xHis-pulldown: Miscelare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazolo, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo, 5 mM beta-mercaptoetanolo, 1 mM fenilmetilsfulfonilfluoruro (PMSF) e una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi (vedere Tabella dei materiali).
   2. GST o MBP-pulldown: miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo, 5 mM DTT, 1 mM PMSF e una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi (vedere Tabella dei materiali).
2. Interrompere le cellule con la sonicazione sul ghiaccio. Conservare un'aliquota di 20 μl per l'elettroforesi.
   NOTA: In genere, sono necessari 20-25 impulsi di 5 s con intervalli di 15 s con una potenza di uscita di 20 W per campione. La potenza di sonicazione appropriata deve essere regolata per ogni strumento per evitare il surriscaldamento e garantire la totale interruzione della cella. Per ottenere prestazioni migliori, si consiglia vivamente di utilizzare sonde sonicator multi-tip ad alta produttività.
3. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min. Raccogliere 20 μL di lisato chiarificato per la successiva analisi SDS-PAGE.
4. Equilibrare la resina (50 μL per ciascun campione) con 1 mL di tampone di lisi ghiacciato per 10 minuti, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.
5. Aggiungere lisati cellulari (concentrazione proteica totale: 20-50 mg/ml) alla resina, incubare per 10 minuti a rotazione costante di 15 giri/min, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante. Raccogliere 20 μL della frazione non legata per la successiva analisi SDS-PAGE.
6. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato e incubare per 1 minuto. Centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante. Le ricette comuni per i tamponi di lavaggio sono:
   1. 6xHis-pulldown: mescolare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazolo, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo e 5 mM beta-mercaptoetanolo.
   2. GST o MBP-pulldown: miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [p/p] glicerolo e 5 mM DTT.
7. Eseguire due lavaggi lunghi: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato, incubare per 10-30 minuti con una rotazione costante di 15 giri/min, centrifugare a 2.000 x g per 30 s e scartare il surnatante.
8. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato, incubare per 1 minuto, centrifugare a 2.000 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.
9. Eluire le proteine legate con 50 μL del tampone di eluizione in uno shaker a 1.200 rpm per 10 minuti. Le ricette comuni dei tamponi di eluizione sono:
   1. 6xHis-pulldown: mescolare 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazolo e 5 mM beta-mercaptoetanolo.
   2. GST pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutatione (regolato a pH 7,5 con Tris basico) e 5 mM DTT.
   3. MBP-pulldown: Miscelare 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM di maltosio e 5 mM DTT.
10. Analizzare le proteine eluite con SDS-PAGE.
    NOTA: La percentuale di acrilammide deve essere adattata alla dimensione delle proteine. Negli esempi forniti in questo studio, sono stati utilizzati gel di acrilammide al 12%, funzionanti in tampone tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) a tensione costante di 180 V. I gel sono stati colorati mediante ebollizione in 0,2% di blu Coomassie R250, acido acetico al 10% e isopropanolo al 30% e decolorati mediante ebollizione in acido acetico al 10%. La quantità di proteine caricate non dovrebbe essere uguale, poiché varie quantità di proteine interagenti possono essere abbattute in diversi esperimenti.

Il metodo descritto è stato utilizzato di routine con molti obiettivi diversi. Presentati qui sono alcuni risultati rappresentativi che probabilmente non possono essere ottenuti utilizzando tecniche di pulldown convenzionali. Il primo è lo studio della dimerizzazione specifica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Gli ZAD formano dimeri stabili e specifici, con eterodimeri possibili solo tra domini strettamente correlati all'interno di gruppi paraloghi. I dimeri formati da questi domini sono stabili e non si dissociano per almeno alcuni giorni; pertanto, la miscelazione di ZAD purificati non produce alcun legame rilevabile. Allo stesso tempo, la co-espressione di ZAD fusi con MBP e tioredossina-6xHis mostra una buona e riproducibile attività di omo-dimerizzazione (Figura 2A), che appare come una banda aggiuntiva nei risultati SDS-PAGE del saggio MBP-pulldown. Una piccola porzione di eterodimeri può essere vista con M1BP co-espresso con un altro dominio; questa interazione non è stata confermata con Y2A e molto probabilmente è il risultato di un'associazione non specifica dovuta all'elevata concentrazione proteica, poiché questi domini sono ricchi di cisteina ed estremamente inclini all'aggregazione. In particolare, in questo caso, 6xHis-pulldown è inappropriato in quanto gli ZAD sono domini di coordinazione dei metalli che non si legano specificamente alla resina chelante del metallo. Tale attività dovrebbe essere attentamente esaminata in un esperimento parallelo.

Un altro esempio è il saggio di competizione tra la proteina ENY2 e i suoi partner di legame Sgf11 (1-83aa) e il dominio a dita di zinco (460-631 aa) della proteina CTCF26. Quando espressa da sola, la proteina ENY2 forma dimeri che le impediscono di interagire con i suoi partner di legame nativi. Presumibilmente, entrambe le proteine Sgf11 e CTCF si legano alla stessa superficie molecolare di ENY2, rendendo la loro interazione reciprocamente esclusiva. Nel test di co-espressione, ENY2 marcato con 6xHis, ha interagito sia con Sgf11 marcato con GST che con MBP-CTCF, ma nessun GST-Sgf11 era presente nei pulldown MBP e viceversa (Figura 2B). Questi risultati suggeriscono che non può essere formato alcun triplo complesso e le interazioni si escludono a vicenda. Questi dati sono stati confermati in modo indipendente con altri saggi e supportano i diversi ruoli funzionali di ENY2 in questi complessi. Va sottolineato che i grandi tag di affinità possono imporre da soli ostacoli sterici, impedendo la formazione di complessi; Pertanto, la conclusione non dovrebbe basarsi esclusivamente su dati di co-espressione.

Un confronto passo-passo dei flussi di lavoro dei pulldown di co-espressione convenzionali e accoppiati è mostrato nella Figura 3A. Il pulldown accoppiato di co-espressione è almeno due volte più efficiente in termini di tempo, anche con un piccolo numero di campioni, e consente una buona scalabilità. I risultati dell'utilizzo di entrambe le tecniche per studiare la stessa interazione tra il dominio BTB della proteina CP190 (1-126aa) e il dominio C-terminale marcato GST (610-818aa) della proteina Drosophila CTCF (dCTCF) sono mostrati nella Figura 3B. Entrambi i metodi mostrano una buona efficienza e riproducibilità (i saggi sono stati eseguiti in tre repliche); per questo caso, il pulldown accoppiato di co-espressione ha mostrato un legame non specifico inferiore, come si può vedere nei campioni di controllo con la sola proteina GST.

Figura 1: La rappresentazione schematica del protocollo. Lo schema mostra il flusso di lavoro del metodo utilizzato in questo studio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi . (A) Studio dell'omodimerizzazione del dominio associato a dita di zinco (ZAD) in saggi di pulldown MBP e 6xHis. Gli ZAD fusi con MBP (40 kDa) o con 6xHis-tioredossina (20 kDa) sono stati co-espressi in cellule batteriche e affinità purificata con resina di amilosio (lega proteine marcate MBP) o con resina Ni-NTA (lega proteine marcate con 6xHis). Le proteine co-purificate sono state visualizzate con SDS-PAGE seguita dalla colorazione di Coomassie. I risultati del pulldown MBP sono mostrati nei pannelli superiori, i risultati del pulldown 6xHis-sono nei pannelli inferiori (usati solo come controllo dell'espressione proteica poiché molti ZAD si legano in modo non specifico a Ni-NTA). (B) Studio delle interazioni reciprocamente esclusive tra le proteine ENY2 e Sgf11/CTCF. Le proteine Sgf11 marcate con GST (1-81aa), CTCF marcate con MBP (460-631aa) e ENY2 marcate con 6xHis sono state co-espresse in varie combinazioni e affinità purificate con resina di amilosio, resina di glutatione (lega proteine marcate con GST) o resina Ni-NTA. Le proteine co-purificate sono state visualizzate con SDS-PAGE seguita dalla colorazione di Coomassie. La figura nei pannelli A e B è stata modificata con il permesso di Bonchuk et al.11 e Bonchuk et al.26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Confronto dei flussi di lavoro dei saggi di pulldown di co-espressione convenzionali e accoppiati. (A) Confronto passo-passo degli intervalli di tempo richiesti nel flusso di lavoro del saggio di pulldown convenzionale rispetto al pulldown accoppiato alla co-espressione. (B) Confronto di due diverse tecniche di pulldown nello studio dell'interazione tra il dominio C-terminale dCTCF (610-818aa) e il dominio BTB della proteina CP190 (1-126aa) in saggi di pulldown GST. dCTCF (610-818aa) fuso con GST (25kDa) o GST da solo sono stati co-espressi in cellule batteriche o incubati in vitro con tioredossina-6xHis-marcato CP190 BTB e affinità purificata con resina glutatione. Vengono mostrate tre repliche indipendenti di ciascun test. Le proteine co-purificate sono state visualizzate con SDS-PAGE seguita dalla colorazione di Coomassie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.