Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Summary

Nuove strategie per modellare fedelmente le mutazioni somatiche nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono necessarie per studiare meglio la biologia delle cellule staminali ematopoietiche e le neoplasie ematologiche. Qui, viene descritto un protocollo per modellare mutazioni eterozigoti con guadagno di funzione nelle HSPC combinando l'uso di CRISPR / Cas9 e la doppia trasduzione del donatore rAAV.

Abstract

Nel corso della loro vita, le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) acquisiscono mutazioni somatiche. Alcune di queste mutazioni alterano le proprietà funzionali dell'HSPC come la proliferazione e la differenziazione, promuovendo così lo sviluppo di neoplasie ematologiche. È necessaria una manipolazione genetica efficiente e precisa delle HSPC per modellare, caratterizzare e comprendere meglio le conseguenze funzionali delle mutazioni somatiche ricorrenti. Le mutazioni possono avere un effetto deleterio su un gene e provocare la perdita di funzione (LOF) o, in netto contrasto, possono migliorare la funzione o addirittura portare a nuove caratteristiche di un particolare gene, definito guadagno di funzione (GOF). In contrasto con le mutazioni LOF, le mutazioni GOF si verificano quasi esclusivamente in modo eterozigote. Gli attuali protocolli di modifica del genoma non consentono il targeting selettivo dei singoli alleli, ostacolando la capacità di modellare mutazioni GOF eterozigoti. Qui, forniamo un protocollo dettagliato su come progettare mutazioni hotspot GOF eterozigoti in HSPC umani combinando la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR / Cas9 e la tecnologia AAV6 ricombinante per un efficiente trasferimento del modello di donatore di DNA. È importante sottolineare che questa strategia utilizza un doppio sistema di reporter fluorescente per consentire il monitoraggio e la purificazione di HSPC modificati con successo eterozigosi. Questa strategia può essere impiegata per studiare con precisione come le mutazioni GOF influenzano la funzione HSPC e la loro progressione verso neoplasie ematologiche.

Introduction

Con lo sviluppo della tecnologia CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9, un nuovo ed estremamente potente strumento è stato aggiunto al toolkit degli scienziati. Questa tecnologia consente l'ingegnerizzazione precisa del genoma e si è dimostrata estremamente utile non solo per scopi di ricerca (recensita in Hsu et ^al.1) ma più recentemente è stata anche tradotta con successo in ambito clinico ^2,3,4. Le strategie di editing di CRISPR/Cas9 si basano sull'attività di una proteina Cas9 e di un RNA a guida singola (sgRNA)^5,6,7. Nella cellula ospite, la proteina Cas9 viene guidata verso un sito specifico nel DNA che è complementare alla sequenza di sgRNA e introdurrà una rottura del doppio filamento del DNA (DSB). Una volta generato un DSB, possono verificarsi due meccanismi di riparazione principali e concorrenti: non-homologous end joining (NHEJ) e homology-directed repair (HDR). NHEJ è un meccanismo di riparazione soggetto a errori, prevalentemente utilizzato che porta a inserzioni e delezioni (indels), mentre l'HDR, utilizzando il cromatide fratello come modello di riparazione, è molto preciso ma limitato alla fase S o G2 del ciclo cellulare⁸. Nell'ingegneria del genoma, l'HDR può essere utilizzato per la modifica mirata del DNA fornendo un modello di donatore che è affiancato da bracci di omologia identici a entrambe le estremità del DNA del DSB indotto da Cas9 (Figura 1). Il tipo di modello di donatore utilizzato per l'HDR può influire notevolmente sull'efficienza di editing. Per l'ingegneria genetica nelle HSPC umane, il sierotipo 6 del virus adeno-associato (AAV6) è stato recentemente descritto come un eccellente veicolo per la consegna di modelli di DNA a singolo filamento ^9,10.

L'ingegneria del genoma CRISPR / Cas9 può essere impiegata terapeuticamente per correggere le mutazioni deleterie¹¹, ma può anche essere utilizzata per introdurre mutazioni patogene nel DNA per modellare lo sviluppo del cancro¹². Il cancro del sangue, come la leucemia, si sviluppa attraverso l'acquisizione sequenziale di mutazioni somatiche in HSPC sani^13,14. Gli eventi genetici precoci portano ad un vantaggio proliferativo clonale, con conseguente emopoiesi clonale a potenziale indeterminato (CHIP)^15,16. Un'ulteriore acquisizione di mutazioni porterà infine alla trasformazione leucemica e allo sviluppo della malattia. Le mutazioni somatiche possono essere trovate nei geni che controllano l'auto-rinnovamento, la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione¹⁷.

L'introduzione di singole mutazioni tramite l'ingegneria del genoma in HSPC sani consente di modellare con precisione questo processo leucemogenico graduale. Il numero limitato di mutazioni ricorrenti riscontrate nelle neoplasie mieloidi come la leucemia mieloide acuta (LMA)^18,19 rende questa malattia particolarmente suscettibile di essere ricapitolata utilizzando strumenti di ingegneria genomica.

Le mutazioni somatiche possono emergere su un solo allele (mutazioni monoalleliche/eterozigoti) o su entrambi gli alleli (mutazioni bialleliche/omozigoti) e possono avere effetti profondi sulla funzione del gene, che potrebbero causare una perdita di funzione (LOF) o un guadagno di funzione (GOF). Le mutazioni LOF portano a un LOF ridotto (se un allele è interessato) o completo (se entrambi gli alleli sono interessati) del gene, mentre le mutazioni GOF portano ad una maggiore attivazione o nuova funzione del gene. Le mutazioni GOF sono tipicamente eterozigoti²⁰.

È importante sottolineare che la zigosità (etero- vs. omozigote) ha importanti implicazioni per il tentativo di modellare fedelmente una mutazione; pertanto, la manipolazione mirata di un solo allele di un gene è necessaria per progettare mutazioni GOF hotspot eterozigoti. L'NHEJ soggetto a errori porta a indels di diverse lunghezze²¹ che possono portare a conseguenze biologiche variabili e imprevedibili. Tuttavia, poiché NHEJ è il programma di riparazione predominante impiegato dalle cellule dopo l'introduzione di un DSB, la maggior parte delle piattaforme CRISPR / Cas9 attualmente utilizzate per manipolare gli HSPC non consentono di prevedere con precisione il risultato genetico^22,23. Al contrario, l'introduzione di una rottura del doppio filamento (DSB) mediata da CRISPR / Cas9, combinata con l'uso di modelli di donatori di DNA basati su vettori di virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) per l'ingegneria del genoma tramite HDR, consente l'inserimento allele-specifico di mutazioni nelle HSPC umane^11,24. L'integrazione simultanea di un mutante e di una sequenza wild-type (WT) accoppiata con distinti reporter fluorescenti sui singoli alleli può essere eseguita per selezionare un genotipo eterozigote (Figura 2). Questa strategia può essere sfruttata come un potente strumento per caratterizzare con precisione gli effetti delle mutazioni recidivanti, leucemiche, eterozigoti dell'hotspot GOF sulla funzione HSPC, sull'inizio della malattia e sulla progressione.

In questo articolo, viene fornito un protocollo dettagliato per l'ingegneria efficiente delle mutazioni GOF eterozigoti mutate ricorrenti nelle HSPC umane primarie. Questa strategia combina l'uso di CRISPR / Cas9 e una doppia trasduzione AAV6 per fornire WT e modelli di donatori di DNA mutante per la generazione futura della mutazione eterozigote GOF. Ad esempio, verrà mostrato l'ingegneria delle mutazioni ricorrenti di tipo 1 (delezione di 52 bp) nel gene della calreticulina (CALR)²⁵. La mutazione eterozigote del GOF nell'esone 9 della CALR si trova frequentemente in disordini mieloproliferativi come la trombocitemia essenziale (ET) e la mielofibrosi primaria (PMF)²⁶. CALR è una proteina residente nel reticolo endoplasmatico che ha principalmente una funzione di controllo della qualità nel processo di ripiegamento delle proteine di nuova sintesi. La sua struttura può essere suddivisa in tre domini principali: un dominio ammino-terminale e un dominio P ricco di prolina, che sono coinvolti nella funzione chaperone della proteina, e un dominio C, che è coinvolto nella conservazione e regolazione del calcio^27,28. Le mutazioni CALR causano un frameshift +1, portando alla trascrizione di una nuova estremità C-terminale estesa e alla perdita del segnale di ritenzione del reticolo endoplasmatico (ER) (KDEL). È stato dimostrato che il CALR mutante lega il recettore della trombopoietina (TPO), portando così a una segnalazione TPO-indipendente con aumento della proliferazione²⁹.

Figura 1: riparazione NHEJ e HDR. Rappresentazione schematica semplificata dei meccanismi di riparazione NHEJ e HDR a seguito dell'introduzione di una rottura a doppio filamento nel DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Panoramica schematica della strategia di editing HDR biallelico. Rappresentazione schematica che mostra l'integrazione dei modelli di donatori negli alleli bersaglio seguita dalla loro traduzione in mRNA funzionanti. Le caselle tratteggiate di arancione indicano le regioni corrispondenti al braccio di omologia sinistro (LHA) e al braccio di omologia destro (RHA). La dimensione ideale degli HA è di 400 bp ciascuno. La casella tratteggiata verde rappresenta la regione corrispondente alla sequenza SA. La dimensione della SA è di 150 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

Questo protocollo richiede l'uso di HSPC CD34⁺ derivati da donatori sani e richiede l'approvazione etica da parte dei comitati di revisione istituzionale locali (IRB) e il consenso informato firmato. Gli HSPC CD34⁺ utilizzati in questo protocollo sono stati isolati dal sangue del cordone ombelicale (UCB) dei parti a termine (>34 settimane di gestazione). Il consenso informato è stato ottenuto dalle madri prima del parto e l'approvazione etica per la raccolta di UCB è stata ottenuta (approvazione IRB: 31-322 ex 18/19) dall'Università di Medicina di Graz. Un elenco completo dei materiali utilizzati in questo protocollo è disponibile nella tabella dei materiali.

1. Progettazione di sgRNA e valutazione delle efficienze di taglio

1. Cerca la posizione della mutazione desiderata e la trascrizione corretta su uno strumento di database online (ad esempio, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
2. Selezionare uno sgRNA adiacente alla mutazione (targeting esonico) o nell'introne precedente (targeting intronico) utilizzando uno strumento di progettazione sgRNA. In questo protocollo viene utilizzato lo strumento online di Benchling. Vedere la tabella dei materiali per un elenco di possibili strumenti online per la progettazione di sgRNA.
3. Selezionare l'opzione + (crea) > Sequenza DNA > Importa sequenze DNA > Importa da database. Inserisci il gene desiderato, ad esempio CALR e seleziona l'uomo come specie > Cerca > Seleziona la trascrizione corretta (ad esempio, CALR-201 -ENST00000316448) > Importa. Selezionare la regione di interesse in cui introdurre l'interruzione DS (ad esempio, intron 7).
4. Seleziona l'opzione CRISPR sul lato destro dello schermo e seleziona Progetta e analizza guide. Selezionare una singola guida, mantenere la lunghezza della guida a 20 bp e la sequenza PAM per l'editing con SpCas9 (NGG).
5. Scegli una guida con un punteggio alto sul target (alta probabilità di modifica nel luogo desiderato) e un punteggio alto fuori target (bassa probabilità di modificare in loci indesiderati). Scegli almeno tre guide da testare per trovare lo sgRNA più performante. Ordina lo sgRNA come sgRNA sintetico chimicamente modificato da un fornitore commerciale.
   NOTA: In questa fase è consigliabile ordinare una piccola quantità di sgRNA sintetici per la schermata iniziale. Una volta identificato uno sgRNA con buone prestazioni, procedere con un ordine più ampio dello sgRNA selezionato.
6. Scongelare 2 x 10 5-5 x 10⁵ CD34⁺ HSPCs. Trasferire le cellule in 10 ml di RPMI1640 preriscaldato integrato con antibiotici all'1% (ad esempio, penicillina / streptomicina).
   NOTA: gli HSPC CD34⁺ con purezza >90% devono essere utilizzati per ottenere i risultati migliori e più riproducibili.
7. Centrifugare a 350 x g a temperatura ambiente (RT) per 10 min. Contare le cellule con un emocitometro e sospendere le cellule in mezzo SFEM II integrato con 0,2% penicillina / streptomicina (P / S), 100 ng / mL trombopoietina (TPO), 100 ng / mL fattore delle cellule staminali (SCF), 100 ng / mL tirosin-chinasi 3 ligando (FLT3L), 100 ng / mL interleuchina-6 (IL-6), 35 nM UM171 e 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) ad una concentrazione di 2,5 x 10⁵ cellule / mL . Incubare a 37 °C/5% CO₂ per 48 h - 72 h.
   NOTA: il supporto completo verrà d'ora in poi denominato supporto di ritenzione HSPC.
8. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e contare le cellule. Controllare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu tripano.
   1. Prima di iniziare, accendi il sistema di trasfezione e seleziona l'opzione per le cuvette. Selezionare il programma e la soluzione di nucleofezione appropriati per gli HSPC (vedere Tabella dei materiali). Tra 2 x 10 5 e⁵ x 10⁶ cellule possono essere nucleofettate in una cuvetta da 100 μL. Mettere da parte un piccolo numero di cellule (ad esempio, 1 x 10 5-2 x 10⁵) da tenere in coltura per 48 ore da utilizzare come controllo WT.
9. Preparare il complesso RNP. In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 15 μg di Cas9 e 8 μg di sgRNA (rapporto molare 1:2,5) e incubare a 25 °C per 10 minuti in un blocco riscaldante.
10. Mentre il complesso RNP è in incubazione, centrifugare le cellule a 350 x g a RT per 5 minuti e scartare il surnatante usando una pipetta. Sospendere le cellule in 100 μL di soluzione di nucleofezione.
11. Mescolare le cellule con il complesso RNP e trasferirle nella cuvetta. Picchiettare delicatamente la cuvetta per rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero essersi formate durante il trasferimento.
12. Inserire la cuvetta nel supporto del sistema di trasfezione ed elettroporcare le cellule con il programma DZ-100.
13. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 400 μL di mezzo di ritenzione HSPC preriscaldato senza P/S.
14. Trasferire le cellule con una pipetta di trasferimento fine in una piastra di coltura contenente terreno di ritenzione HSPC preriscaldato senza P/S. A seconda del numero di celle, utilizzare una piastra di coltura appropriata (piastra a 24, 12 o 6 pozzetti) per raggiungere una densità compresa tra 0,25 x 10⁶ e 1 x 10⁶ celle/ml.
15. Trasferire la piastra nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂. Incubare le cellule nucleofettate per 6-8 ore.
16. Dopo 6-8 ore, rimuovere il vecchio mezzo e sostituirlo con un nuovo mezzo di ritenzione HSPC preriscaldato integrato con P/S. Sospendere le cellule ad una concentrazione compresa tra 2,5 x 10 5 e 5 x 10⁵ e trasferirle in una piastra di coltura cellulare (piastra da 24, 12 o 6 pozzetti). Incubare le cellule per 48 ore a 37°C/5% CO₂.
17. Raccogliere 2 x 10 5 celle e centrifugare a 350 x g a RT per⁵ min. Prima di iniziare, impostare i blocchi riscaldanti a 65 °C e 98 °C.
18. Scartare il surnatante e sospendere le cellule in 1 mL di 1x DPBS in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare a 350 x g a RT per 5 min.
19. Eliminare il surnatante e sospendere le cellule in 50 μL di soluzione di estrazione del DNA. Vortice per 15 s.
20. Incubare per 6 min a 65 °C. Vortice per 15 s e incubare per 2 min a 98 °C.
21. Amplificare la regione del DSB mediante PCR utilizzando primer che generano un amplicone di circa 400-600 bp con il DSB al centro. Utilizzare 0,5-1 μL di DNA estratto per la reazione PCR.
    NOTA: A causa della composizione della soluzione di estrazione del DNA, le concentrazioni di DNA non possono essere quantificate con precisione mediante spettrofotometria.
22. Eseguire il prodotto PCR con una scala di DNA su un gel di agarosio all'1,5% a 100 V per 45-60 minuti. Posizionare il gel su una luce blu o transilluminatore UV.
23. Estrarre la banda di DNA della dimensione corretta dal gel utilizzando un kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
24. Sequenziare i campioni mediante sequenziamento Sanger utilizzando il primer in avanti o il primer inverso della PCR. Per i prodotti PCR di 400-600 bp di lunghezza, sono necessari 75 ng di DNA per il sequenziamento con una concentrazione di 5 ng/mL in un volume totale di 15 μL.
25. Analizzare l'efficienza di editing degli sgRNA caricando i file di sequenziamento su un programma progettato per calcolare l'efficienza di editing identificando l'inserimento e le delezioni prodotte dallo sgRNA. Seleziona lo sgRNA più performante con cui procedere.
    NOTA: Gli strumenti online dedicati sono elencati nella tabella dei materiali. Questa analisi richiede i file .ab1 degli HSPC trasfettati e WT, la sequenza sgRNA e la sequenza PAM.

2. Costruzione vettoriale di riparazione diretta dall'omologia (HDR)

1. Progettazione di modelli HDR
   NOTA: devono essere progettati due modelli HDR: un modello per la sequenza WT e un modello per la sequenza mutata.
   1. Importare la sequenza genomica e la sequenza codificante (CDS) del gene desiderato in un software appropriato per la clonazione molecolare (strumenti dedicati possono essere trovati elencati nella Tabella dei Materiali). Dal file di sequenza genomica, progettare il braccio di omologia sinistro (HA) selezionando idealmente 400 bp sull'estremità 5' del DSB. Incollare questa sequenza in un nuovo file.
   2. Se un introne è mirato con l'sgRNA, è necessario includere una sequenza di accettori di giunzione (SA). Selezionare gli ultimi 150 bp dell'introne di destinazione e incollarlo dopo l'HA sinistro. Se l'esone è direttamente mirato, questa sequenza non è necessaria (Figura 3).
   3. Dal file CDS, selezionare il cDNA di interesse. Nel caso in cui una sequenza esonica sia mirata, assicurarsi che il cDNA inizi immediatamente a valle del sito DSB e includa tutti i seguenti esoni del gene di interesse e il codone di stop. Nel caso in cui un introne sia mirato, assicurarsi che il cDNA inizi con il primo codone dell'esone successivo. Codone-ottimizzare il cDNA e inserirlo dopo la sequenza SA. Utilizzare strumenti online dedicati a tale scopo (Tabella dei materiali).
   4. Inserire un segnale di poliadenilazione 3' (PolyA) dopo il cDNA di interesse (ad esempio, SV40 o bGH) (Tabella 1). Dopo il PolyA, inserire una sequenza del promotore (ad esempio, virus che forma il fuoco della milza [SFFV] o la poliubiquitina C [UBC], Tabella 1) per la proteina fluorescente.
   5. Inserire la sequenza per la proteina fluorescente (cioè GFP, BFP o mCherry). Inserire un secondo segnale PolyA diverso ma diverso.
      NOTA: L'inserimento di una sequenza PolyA diversa eviterà problemi come la ricombinazione batterica del plasmide o problemi con l'allineamento della sequenza a causa di due sequenze identiche nel modello.
   6. Dal file di sequenza genomica, progettare l'HA giusto selezionando idealmente 400 bp sull'estremità 3' del DSB. Inserire questa sequenza dopo il secondo PolyA.
   7. Creare una copia dell'intero modello e modificare il cDNA di interesse in modo che contenga la sequenza della mutazione desiderata.
   8. Scambiare la proteina fluorescente con una diversa proteina fluorescente. Ad esempio, se GFP è stato utilizzato per il modello WT, sostituirlo con BFP o mCherry per il modello mutante. Costruisci e clona i modelli HDR nel plasmide pAAV-MCS (o in altre dorsali adatte).
      NOTA: I frammenti necessari per l'assemblaggio possono essere prodotti tramite PCR o ordinati commercialmente e devono contenere sequenze sovrapposte con i frammenti vicini. Se la mutazione di interesse è una mutazione puntiforme, una piccola inserzione o una piccola delezioni, il cDNA mutato può essere prodotto mediante PCR eseguendo una mutagenesi sito-diretta sul modello HDR contenente il cDNA WT.
   9. Trasformare Escherichia coli competente con il prodotto assemblato utilizzando il metodo dello shock termico. Prima di iniziare, posizionare i batteri per scongelare sul ghiaccio per 10 minuti.
   10. Aggiungere 2 μL dei prodotti assemblati a 50 μL di batteri. Mescolare il contenuto scorrendo delicatamente.
   11. Mettere i campioni sul ghiaccio per 30 minuti. Trasferire i campioni in un blocco termico impostato a 42 °C per 30 s.
   12. Trasferire i campioni su ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 450 μL di mezzo SOC a temperatura ambiente e incubare i campioni a 37 °C per 1 ora.
   13. Distribuire i campioni su piastre di agar LB contenenti ampicillina. Per ogni campione, distribuire 100 μL di tre diverse diluizioni della soluzione batterica (non diluita, 1:5 e 1:10) al fine di ottenere piastre di agar LB con singole colonie che possono essere raccolte. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
   14. Il giorno successivo, scegli tre colonie per campione. Trasferire le colonie in provette da 15 mL con tappi contenenti 4 mL di terreno LB integrato con ampicillina e incubare per una notte in uno shaker a 37 °C.
   15. Aliquot 500 μL della soluzione batterica di ogni colonia e conservarla in frigorifero per un uso successivo. Eseguire una mini-preparazione per estrarre il DNA plasmidico secondo le istruzioni del produttore.
   16. Inviare i campioni per il sequenziamento Sanger per confermare il corretto assemblaggio dei plasmidi. Utilizzare abbastanza primer distribuiti in tutto il plasmide per garantire una conferma ininterrotta della sequenza, coprendo idealmente ogni regione due volte con letture avanti e indietro.
   17. Aggiungere 200 μL della soluzione batterica contenente il plasmide correttamente assemblato a 200 mL di mezzo LB integrato con ampicillina e incubare in uno shaker per una notte a 37 °C.
   18. Eseguire una preparazione midi o maxi-prep per estrarre il DNA plasmidico secondo le istruzioni del produttore. Conservare il DNA plasmidico a -20 °C.
2. Preparazione AAV6 ricombinante
   NOTA: Sarà necessario eseguire due preparazioni AAV6 separate: una per l'rAAV6 con il modello WT HDR e una per l'rAAV6 con il modello HDR mutato. In questa sezione vengono descritti i passaggi necessari per la preparazione di un solo virus.
   1. Scongelare le cellule HEK293T, trasferire le cellule in 10 ml di DMEM preriscaldato integrato con 10% FBS, 1% P / S e 25 mM HEPES e centrifugare a 350 x g a RT per 5 minuti.
   2. Sospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/ml e trasferirle in un matraccio adatto (ad esempio, un matraccio da 175 cm² ). Trasferire il matraccio in un incubatore a 37 °C/5% CO₂.
      NOTA: Le cellule HEK293T devono essere scongelate in anticipo per consentire alle cellule di recuperare completamente e ottenere un numero sufficiente di cellule (11 x 10⁷ cellule sono necessarie per la produzione di un virus). Si raccomanda di utilizzare le celle dopo un minimo di tre passaggi e di mantenere le celle al di sotto di 20 passaggi. Le cellule HEK293T dovrebbero essere divise tre volte a settimana. Pur mantenendo le cellule, queste non dovrebbero superare il 70% -80% di confluenza. Anche il DMEM utilizzato nella preparazione AAV dovrebbe già essere integrato con L-glutammina e piruvato di sodio.
   3. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml e centrifugare a 350 x g a RT per 5 minuti.
   4. Sospendere le cellule in 20 ml di DMEM integrato con 10% FBS, 1% P / S e 25 mM HEPES e contare con un emocitometro. Utilizzare trypan blue per l'esclusione delle cellule morte.
   5. Seme 3 x 10⁶ cellule in 20 ml di DMEM integrato con 10% FBS, 1% P / S e 25 mM HEPES in un matraccio da 175 cm² . Per la produzione di un virus, preparare almeno quattro matraccio da 175 cm² . Incubare le cellule a 37 °C/5% CO₂ per 3 giorni.
      NOTA: questo passaggio viene eseguito al meglio di venerdì in quanto consente alle celle di espandersi durante il fine settimana.
   6. Raccogliere e contare le celle HEK293T.
   7. Per la preparazione di uno dei virus, preparare dieci piatti da 150 mm contenenti ciascuno 11 x 10⁶ HEK293T in 20 ml di DMEM integrato con 10% FBS, 1% P/S e 25 mM HEPES.
   8. Posizionare i piatti nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂ per 24 ore. Scartare con cautela il vecchio terreno e sostituirlo con 20 ml di DMEM privo di antibiotici integrato con FBS al 10%, HEPES da 25 mM e 1 mM di butirrato di sodio. Prima di procedere, verificare che la confluenza delle celle non sia superiore all'80%.
   9. Preparare due tubi da 15 ml che conterranno le miscele di trasfezione. Alla provetta 1, aggiungere 5 ml di terreno sierico ridotto, 60 μg di plasmide HDR mutato rAAV6 e 220 μg di pDGM6 (plasmide helper). Al tubo 2, aggiungere 5 ml di mezzo sierico ridotto e 1120 μL di soluzione di polietilenimina 1 mg/ml (PEI, reagente di trasfezione).
   10. Aggiungere il contenuto del tubo 2 al tubo 1 e vortice per 30 s. Incubare per 15 minuti a RT per garantire il corretto incapsulamento del DNA nelle micelle PEI.
       NOTA: Non conservare la soluzione per più di 20 minuti.
   11. Aggiungere con cautela 1,1 ml di soluzione a ciascun piatto e distribuire ruotando delicatamente. Mettere i piatti nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂ per 48 ore.
   12. Dopo 48 ore, aggiungere 250 μL di 0,5 M EDTA a ciascun piatto e posizionare i piatti nell'incubatore per 10 minuti. Raccogliere le cellule lavandole via dal piatto e trasferirle in una provetta da centrifuga da 500 ml o in più provette da 50 ml.
   13. Centrifugare a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Per garantire la completa rimozione del surnatante, centrifugare nuovamente a 2.000 x g per 1 minuto a 4 °C.
   14. Scartare qualsiasi supernatante rimanente. Qualsiasi surnatante residuo potrebbe compromettere la purificazione del virus.
   15. Allentare il pellet a vortice ed estrarre il virus utilizzando un kit di purificazione AAV (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. In alternativa, eseguire l'estrazione mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo^30,31.
   16. Aliquot del virus purificato e conservare a -80 °C. Titolare l'AAV funzionalmente o quantificare il titolo AAV mediante digital droplet PCR (ddPCR)³² al fine di determinare le condizioni ottimali di trasduzione.
   17. Ripetere questo processo per la preparazione del plasmide rAAV6 WT HDR.
3. Titolazione AAV mediante ddPCR
   1. Prima di iniziare, impostare i blocchi riscaldanti a 65 °C e 98 °C.
   2. Estrarre il DNA virale aggiungendo 15 μL di soluzione di estrazione del DNA a 5 μL del virus. Vortice per 15 s.
   3. Incubare per 6 min a 65 °C. Vortice per 15 s. Incubare per 2 min a 98 °C.
   4. Utilizzare il DNA estratto (che è una diluizione 1:4 del DNA virale) per preparare diluizioni seriali (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) con nucleasi (nf) H₂O per la ddPCR.
      NOTA: Le diluizioni possono essere conservate a -20 °C se la ddPCR non viene eseguita immediatamente.
   5. Selezionare tre delle diluizioni per la ddPCR. La scelta della diluizione da utilizzare dipende dalla concentrazione del virus. Preferibilmente, utilizzare tre diverse diluizioni (ad esempio, 1:40.000, 1:160.000 e 1:640.000) per trovare la migliore diluizione entro il limite di rilevamento della macchina.
   6. Mantenere i reagenti sul ghiaccio durante il lavoro. Preparare un master mix (tutti i campioni saranno misurati in duplicati). Per ogni reazione, preparare quanto segue: 12,5 μL di ddPCR Supermix per sonde, nessun dUTP, 1,25 μL di PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (vedere Tabella dei materiali) e 6,25 μL nf-H₂O.
   7. Mescolare 5 μL di DNA con 20 μL della miscela master. Eseguire questa operazione per le diluizioni 1:40.000, 1:160.000 e 1:640.000.
   8. Inserire una cartuccia nel supporto della cartuccia. Aggiungere 70 μL di olio per la generazione di goccioline alle sonde nella riga denominate Olio. Fai attenzione a non generare bolle.
   9. Aggiungere 20 μL del volume del campione nella riga denominata Campione. Fai attenzione a non generare bolle.
   10. Sigillare la cartuccia con la guarnizione e posizionarla nel generatore di gocce. Generare le goccioline premendo il pulsante di avvio sulla macchina, rimuovere la guarnizione e trasferire con cura, con una pipetta multicanale, 40 μL delle goccioline generate in una piastra a 96 pozzetti. Lavorare lentamente per evitare la distruzione delle goccioline e delle bolle d'aria.
   11. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con una pellicola perforante (la striscia rossa rivolta verso l'alto) utilizzando il sigillante per piastre PCR. Posizionare la piastra in un termociclatore.
   12. Impostare il volume su 40 μL, la temperatura del coperchio su 105 °C e la velocità di rampa su 2 °C/s. Eseguire il programma PCR come descritto nella Tabella 2.
   13. Accendere il lettore di gocce 30 minuti prima dell'uso. Aprire il software sul desktop.
   14. Inserisci il layout della piastra e seleziona ABS nella scheda dell'esperimento e ddPCR Supermix nella scheda Supermix. Quindi, premere prima PRIME, quindi fare clic su FLUSH SYSTEM sul software per avviare il sistema.
   15. Inserisci la piastra nel lettore. Avviare l'esecuzione e, al termine, esportare i dati come file CSV per la successiva analisi come foglio di calcolo.
       NOTA: I numeri generati dal software sono copie del genoma (GC) per μL. Questi devono essere moltiplicati per i fattori di diluizione: GC/μL x 5 (diluizione del DNA nella miscela principale) x diluizione iniziale (cioè 40.000 o 160.000).

Figura 3: Panoramica schematica del targeting intronico ed esonico durante il knock-in HDR CRISPR/Cas9. Confronto schematico tra strategie di targeting intronico ed esonico per il knock-in HDR CRISPR/Cas9. (A) Durante il targeting intronico, viene introdotta una rottura a doppio filamento in un introne del DNA. Il modello HDR è composto da LHA, sequenza di cDNA e RHA. Il targeting intronico richiede, inoltre, la presenza di un accettore di fette contenente il sito di giunzione 3', il punto di diramazione e il tratto polipirimidinico. Ciò consente una corretta giunzione. La casella tratteggiata verde rappresenta la regione corrispondente alla sequenza SA. La dimensione del SA è di 150 bp. (B) Il targeting esonico si basa sulla produzione di una rottura a doppio filamento direttamente nell'esone. Il modello HDR è composto da LHA, sequenza di cDNA e RHA. Le caselle tratteggiate arancioni indicano le regioni corrispondenti a LHA e RHA. La dimensione ideale degli HA è di 400 bp ciascuno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Promotori
Nome	Lunghezza	Descrizione
SFFV	492 punti base	Promotore del virus della milza che forma la milza. Forte promotore di mammiferi. Costitutivamente espresso
UBC	400 pb	Promotore derivato dal gene umano ubiquitina C. Costitutivamente espresso.
CMV	508 punti base	Promotore derivato dal citomegalovirus. Può contenere una regione enhancer. Costitutivamente espresso. Forte promotore di mammiferi. Può essere silenziato.
EF-1a	1182 pb	Promotore alfa del fattore di allungamento della traduzione eucariotica umana. Costitutivamente espresso. Forte promotore di mammiferi.
EFS	200-300 pb	EF-1 alfa senza introne forma abbreviata
CAG	584 punti base	Promotore ibrido di mammifero contenente il potenziatore precoce del CMV (C), il promotore della beta actina del pollo (A) e l'accettore di giunzione per il gene della beta-globina di coniglio (G). Costitutivamente espresso.
Segnali di poliadenilazione (PolyA)
Abbreviazione	Lunghezza	Descrizione
SV40 PolyA	82-122 punti base	Segnale di poliadenilazione del virus delle scimmie 40
bGH PolyA	224 punti base	Segnale di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino
rbGlob PolyA	56 punti base	Segnale di poliadenilazione della beta globina di coniglio

Tabella 1: Promotori e segnali di poliadenilazione.

Passo	Temperatura	Ore	Cicli
Attivazione enzimatica	95°C	10 minuti	1x
Denaturazione	94°C	30 secondi	42x
Ricottura	60°C	1 minuto
Estensione	72°C	30 secondi
Disattivazione enzimatica	98°C	10 minuti	1x
Tenere	4°C	∞

Tabella 2: Programma di PCR digitale a goccia.

3. Redazione di HSPC

1. Trasfezione e trasduzione delle HSPC
   1. Scongelare gli HSPC CD34⁺ e trasferire le cellule in 10 ml di RPMI preriscaldato integrato con 1% P/S. Centrifugare a 350 x g a RT per 10 min.
   2. Sospendere le cellule nel mezzo di ritenzione HSPC ad una concentrazione di 2,5 x 10 5 cellule/ml e incubare a 37 °C/⁵ % CO₂ per 48 ore - 72 ore.
   3. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Contare le celle e verificare la vitalità delle cellule mediante l'esclusione del blu tripano. Tra 2 x 10 5 e⁵ x 10⁶ cellule possono essere nucleofettate in una singola cuvetta. Preparare il numero appropriato di cuvette in base al numero di cellulare calcolato.
   4. Preparare il complesso RNP. In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 15 μg di Cas9 e 8 μg di sgRNA (rapporto molare 1:2,5) e incubare a 25 °C per 10 minuti in un blocco riscaldante.
   5. Mentre il complesso RNP è in incubazione, centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
   6. Sospendere le cellule in 100 μL di soluzione di nucleofezione. Mescolare le cellule con il complesso RNP e trasferirle nella cuvetta.
   7. Picchiettare delicatamente la cuvetta per rimuovere eventuali bolle d'aria residue che potrebbero essersi formate durante il trasferimento.
   8. Inserire la cuvetta nel supporto del sistema di trasfezione ed elettropolare le cellule come precedentemente descritto nella sezione di progettazione sgRNA.
   9. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 400 μL di mezzo di ritenzione HSPC preriscaldato senza P/S e trasferire le cellule con una pipetta di trasferimento fine in una piastra di coltura tissutale contenente 500 μL di terreno di ritenzione HSPC preriscaldato senza P/S. A seconda del numero di cellule, utilizzare una piastra di coltura appropriata (piastra da 24, 12 o 6 pozzetti) per raggiungere una densità compresa tra 0,25 x 10⁶ e 1 x 10⁶ cellule/ml. Trasferire la piastra nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂.
   10. Scongelare i flaconcini contenenti gli rAAV congelati su ghiaccio. Trasduci le cellule pipettando la quantità ottimale di ogni rAAV6 alla sospensione cellulare. Eseguire la trasduzione entro 20-30 minuti dopo l'elettroporazione per ottenere elevate efficienze di trasduzione.
       NOTA: La concentrazione ottimale di ciascun virus (un virus per il modello WT HDR e un altro virus separato per il modello HDR mutato) deve essere determinata sperimentalmente. Di solito, 5.000-10.000 GC / cellula (ad esempio, 5 x 10⁹ GC per 1 x 10⁶ cellule) provocano un'elevata trasduzione.
   11. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con la pipetta. Incubare le cellule trasdotte per 6-8 ore a 37 °C/5% CO₂. Dopo 6-8 ore, raccogliere le cellule in una provetta e centrifugare a 350 x g a RT per 5 minuti.
   12. Eliminare il vecchio mezzo e sostituirlo con un nuovo mezzo di ritenzione HSPC preriscaldato integrato con P/S.
   13. Sospendere le cellule ad una concentrazione compresa tra 2,5 x 10 5-5 x 10⁵ cellule/ml e trasferirle in una piastra di coltura cellulare trattata con tessuto (piastra da 24, 12 o 6 pozzetti). Incubare le cellule per 48 ore a 37 °C/5% CO₂ prima di procedere con la cernita.
2. Selezione a flusso delle HSPC ingegnerizzate portatrici della mutazione GOF eterozigote
   1. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 350 x g a RT per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, sospendere le cellule in 1 mL di DPBS contenente lo 0,1% di BSA e centrifugare nuovamente a 350 x g a RT per 5 minuti.
   2. Scartare il surnatante e sospendere le cellule in un volume appropriato di DPBS + 0,1% BSA a seconda del numero di cellule.
      NOTA: Si raccomanda di sospendere le cellule ad un volume minimo di 200 μL e di non superare 1 x 10⁷ cellule/ml per ridurre il rischio di intasamento dello smistatore.
   3. Trasferire le cellule in un tubo FACS sterile dotato di un cappuccio. Aggiungere 7-AAD o altro colorante di vitalità (a seconda della loro compatibilità con le proteine fluorescenti) alla sospensione cellulare per l'esclusione di cellule vive / morte.
   4. Ordinare le cellule vive che sono doppiamente positive per le proteine reporter fluorescenti in una provetta di raccolta contenente 200 μL di mezzo di ritenzione HSPC.
      NOTA: È necessario aggiungere controlli appropriati costituiti da celle trasdotte solo con AAV per garantire il corretto gating durante la procedura di selezione.
   5. Centrifugare le cellule selezionate a 350 x g a RT per 5 minuti e sospendere le cellule nel mezzo di ritenzione HSPC ad una concentrazione di 2,5 x 10⁵ cellule / ml per un'ulteriore espansione in coltura o utilizzare le cellule direttamente per saggi funzionali.

4. Conferma del successo dell'editing genetico

1. Estrazione del DNA genomico
   1. Prima di iniziare, impostare i blocchi riscaldanti a 65 °C e 98 °C. Raccogliere 2 x 10 5 cellule modificate dal genoma e smistate e centrifugare a 350 x g per⁵ min.
   2. Estrarre il gDNA come descritto in precedenza. Utilizzare la soluzione di DNA direttamente per la PCR o conservare a -20 °C.
2. In-Out PCR
   1. Progettare due primer per amplificare il sito di inserzione 5' (Figura 4A): primer forward 1 mira al locus genomico al di fuori del braccio di omologia sinistro; Primer Reverse 2 ha come target la sequenza integrata.
   2. Per la PCR in-out, preparare la seguente miscela PCR per reazione:
      10 μL di Master Mix PCR (2x; vedere Tabella dei materiali)
      1 μL di primer forward 1 (10 μM di stock)
      1 μL di primer reverse 2 (10 μM di stock)
      0,5-1,0 μL di DNA estratto
      H₂O privo di nucleasi fino ad un volume finale di 20 μL
      NOTA: per più di una reazione, è consigliabile preparare una miscela master che contenga una reazione aggiuntiva per tenere conto degli errori di pipettaggio. È importante includere un controllo non-modello e un modello di DNA da un campione trattato con simulazione.
   3. Eseguire le reazioni PCR con il programma di ciclo termico appropriato (vedere le istruzioni del produttore).
      NOTA: Si consiglia di testare prima la coppia di primer per la temperatura di ricottura ottimale. Questo può essere fatto calcolando il Tm e quindi eseguendo la PCR con un termociclatore in grado di eseguire una temperatura di gradiente.
   4. Eseguire i prodotti PCR con una scala di DNA su un gel di agarosio all'1,5% a 100 V per 45-60 minuti (Figura 4B). Posizionare il gel su una luce blu o transilluminatore UV. Eliminare le bande dal gel.
   5. Estrarre il DNA dalle bande utilizzando un kit di estrazione del gel di DNA. Inviare i campioni di PCR estratti con primer appropriati per il sequenziamento Sanger per confermare la corretta e senza soluzione di continuità integrazione del cDNA desiderato nel locus genico endogeno.

Figura 4: Validazione dell'integrazione genomica mediante PCR in-out. (A) Rappresentazione schematica della strategia in-out PCR. Nella strategia raffigurata, sono stati progettati due primer. Il primer forward 1 mira al locus genomico al di fuori dell'LHA e il primer reverse 2 mira alla sequenza ottimizzata per il codone. (B) Rappresentazione schematica di un'elettroforesi su gel di agarosio. Solo le cellule modificate con successo (RNP + AAV) genereranno un prodotto PCR durante la PCR in-out, mentre i campioni non modificati (solo AAV) non genereranno un prodotto PCR. Abbreviazione: NTC = controllo non-template. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Results

Applicando il protocollo sopra descritto, le mutazioni CALR eterozigoti di tipo 1 sono state introdotte in modo riproducibile nelle HSPC derivate dal sangue del cordone ombelicale. Questa mutazione consiste in una delezione di 52 bp nell'esone 9 (l'ultimo esone di CALR), che si traduce in un frameshift +1, portando alla traduzione di un nuovo dominio C-terminale caricato positivamente^26,33. Per introdurre la mutazione CALR nel locus genico endogeno, è stata adottata una strategia di targeting intronico a monte dell'esone 9, poiché ciò eviterebbe qualsiasi cambiamento indesiderato nella sequenza codificante nei casi in cui il DSB indotto da Cas9 non fosse riparato tramite il meccanismo HDR. In questo caso specifico, è stato progettato uno sgRNA per l'introne 7 a causa della disponibilità di sequenze alte on-target e basse off-target in combinazione con bracci di omologia favorevole (mancanza di ripetizioni di sequenza; Figura 5A).

Due modelli di donatori sono stati quindi progettati e confezionati in vettori AAV6. Al fine di consentire il corretto splicing dagli esoni endogeni al cDNA integrato, i modelli di donatori contengono (i) una sequenza SA che include il sito di giunzione 3', il punto di diramazione e il tratto polipirimidinico, (ii) la sequenza di cDNA ottimizzata per il codone degli esoni 8-9, contenente il WT (CALR ^WT) o la sequenza mutata (CALR^DEL) ) comprendente un codone di stop, iii) un segnale poliA del virus delle scimmie 40 (SV40), iv) una sequenza che codifica per una proteina fluorescente sotto il controllo del promotore interno separato, il promotore del virus SFFV (spleen focus-forming virus), seguito da v) un segnale polyA dell'ormone della crescita bovino (bGH). Il modello di donatore contenente il cDNA CALR ^WT è stato progettato per contenere una cassetta GFP, mentre il modello di donatore contenente la sequenza di cDNA CALR^DEL è stato progettato per contenere una cassetta BFP. L'intero costrutto è stato affiancato da un HA sinistro e destro (Figura 5A).

Due giorni dopo la trasfezione con il complesso RNP e la trasduzione con i virus rAAV6, le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso. Quattro popolazioni principali potrebbero essere rilevate: (i) cellule che non esprimono né la GFP né la BFP, che rappresentano cellule senza editing del genoma basato su HDR, (ii) cellule positive solo per GFP, che rappresentano quelle che avevano integrato solo il costrutto WT, (iii) cellule positive solo per BFP, che rappresentano quelle che avevano integrato solo il costrutto mutato, e (iv) cellule doppie positive GFP e BFP, rappresentando le cellule che avevano integrato sia la WT che le sequenze mutate (Figura 5B). Al fine di ottenere popolazioni pure di HSPC portatrici della mutazione CALR eterozigote di tipo 1, le cellule doppie positive sono state ordinate mediante citometria a flusso. Gli HSPC in cui sono state eliminate due sequenze WT sono stati utilizzati come celle di controllo (GFP+ mCherry+; Figura 5B). Una valida alternativa da utilizzare come cellule di controllo sarebbero le HSPC con un'integrazione biallelica delle proteine fluorescenti in un locus safe harbor (cioè AAVS1; non mostrato). Il conteggio delle cellule mediante esclusione del blu tripano eseguito sugli HSPC ordinati ha indicato che oltre il 90% delle cellule era vitale.

La perfetta integrazione on-target dei costrutti è stata confermata applicando la strategia in-out PCR (Figura 6A). In questo caso specifico, abbiamo eseguito due PCR in-out separate, una per la sequenza CALR^WT knocked-in (corsia 1 dell'elettroforesi su gel in Figura 6A) e una per la sequenza CALR^DEL knocked-in (corsia 2 dell'elettroforesi su gel della Figura 6A). Il sequenziamento con metodo Sanger eseguito sul DNA estratto dalle bande di gel ha confermato il corretto inserimento delle sequenze WT e mutate nelle CALR^DEL/WT HSPCs (Figura 6B).

Figura 5: Generazione di HSPC portatori della mutazione CALR eterozigote. (A) Schema rappresentativo che illustra la strategia di editing per l'inserimento della mutazione CALR eterozigote. Il complesso RNP prende di mira l'introne tra l'esone 7 e l'esone 8 del gene CALR. Due AAV, uno contenente gli esoni mutati 8-9 e un BFP e l'altro contenente gli esoni WT 8-9 e un GFP, serviranno come modelli di riparazione del donatore e promuoveranno l'integrazione della sequenza mutata in un allele e l'integrazione della sequenza WT nell'allele rimanente. (B) Grafici rappresentativi di citometria a flusso raffiguranti l'espressione di GFP e BFP o GFP e mCherry 48 h dopo la trasfezione e la trasduzione delle HSPC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Validazione della mutazione CALR eterozigote riuscita nelle HSPC . (A) Elettroforesi su gel dai prodotti della PCR in-out eseguita su DNA genomico estratto da controlli AAV, CALR WT^/WT e CALR^DEL/WT. È stata utilizzata una scala di DNA da 100 bp. Abbreviazione: NTC = controllo non-template. (B) Risultati del sequenziamento con metodo Sanger ottenuti dalle PCR in-out eseguite su CALR DEL/WT confermando il successo dell'integrazione delle sequenze^WT e mutate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

La manipolazione genetica efficiente e precisa delle HSPC primarie umane rappresenta una grande opportunità per esplorare e comprendere i processi che influenzano la normale emopoiesi e, soprattutto, la trasformazione leucemica delle cellule ematopoietiche.

In questo protocollo, è stata descritta una strategia efficiente per ingegnerizzare HSPC umani per esprimere mutazioni GOF eterozigoti ricorrenti. Questa procedura ha sfruttato la tecnologia CRISPR / Cas9 e i vettori rAAV6 come donatori per i modelli di DNA per inserire con precisione WT e sequenze di DNA mutante nei loro loci genici endogeni. L'accoppiamento dei cDNA ingegnerizzati (WT e mutanti) con proteine reporter fluorescenti separate consente l'arricchimento e il tracciamento di cellule con uno stato eterozigote definitivo.

Questa strategia presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi basati su lentivirali (LV) frequentemente utilizzati. Uno dei principali vantaggi è che il sistema basato su CRISPR / Cas9 consente un editing preciso nei loci endogeni, con conseguente conservazione dei promotori endogeni e degli elementi regolatori. Ciò porta all'omogeneità nell'espressione del gene modificato nelle cellule, un obiettivo difficilmente raggiungibile quando viene utilizzato un metodo basato su LV. Il trasferimento genico con vettori LV porta all'integrazione semi-casuale del gene con preferenza per i siti trascrizionalmente attivi³⁴. Ciò può tradursi in sovraespressione del gene trasferito ed eterogeneità tra le cellule modificate, con conseguenti difficoltà a studiare e analizzare il ruolo delle mutazioni e delle interazioni geniche. Un secondo vantaggio è che il sistema descritto, essendo un sistema di editing sito-specifico, elimina i rischi di mutagenesi inserzionale³⁵.

La strategia del reporter fluorescente consente l'arricchimento e il tracciamento precisi delle cellule che sono state modificate con successo su entrambi gli alleli, con un allele che integra il cDNA WT e l'altro allele che integra le sequenze di cDNA mutate. Le celle che esprimono solo un singolo reporter rappresentano solo l'integrazione monoallelica o l'integrazione biallelica di modelli HDR con lo stesso reporter fluorescente. Entrambi gli scenari possono essere distinti con precisione solo se vengono prodotti cloni derivati da singole cellule e analizzati individualmente. Tuttavia, le HSPC hanno solo una limitata capacità proliferativa in vitro e, se mantenute in coltura per lunghi periodi di tempo, le HSPC iniziano a differenziarsi in progenie più matura e perdono la loro capacità di auto-rinnovamento e attecchimento. Ciò rende impossibile selezionare ed espandere cloni unicellulari che ospitano la mutazione eterozigote desiderata. L'applicazione della strategia della doppia proteina fluorescente e l'arricchimento mediante citometria a flusso per cellule portatrici della mutazione eterozigote consente di bypassare i problemi indotti dalla coltura estesa in vitro .

In questo esempio specifico, è stato dimostrato con successo che le HSPC possono essere ingegnerizzate e ordinate in modo efficiente al fine di ottenere popolazioni pure di HSPC portatrici della mutazione eterozigote CALR^DEL/WT.

Tuttavia, questo sistema non si limita a ingegnerizzare mutazioni frameshift eterozigoti, ma può anche essere facilmente adottato per creare altri tipi di mutazioni, comprese le mutazioni missenso e nonsenso. Applicando diverse combinazioni di AAV contenenti WT o sequenze mutate con diverse proteine reporter fluorescenti, questo sistema può anche essere utilizzato per l'introduzione di mutazioni omozigoti (trasduzione simultanea con due rAAV entrambi portatori di cDNA mutante ma diversi reporter fluorescenti) o anche la correzione di mutazioni (trasduzione simultanea con due AAV entrambi portatori di cDNA WT ma diversi reporter fluorescenti). Inoltre, è importante ricordare che questa strategia non si limita all'introduzione di mutazioni oncogeniche del GOF. Infatti, il protocollo descritto può essere utilizzato per molteplici strategie alternative tra cui il gene knock-out, la sostituzione genica 36,37, il knock-in mirato dei transgeni (cioè i recettori dell'antigene chimerico)38 e persino per la correzione delle mutazioni che causano la malattia^11,39.

La strategia di combinare CRISPR / Cas9 e AAV6 con più reporter fluorescenti ha anche dimostrato di essere applicabile in molti altri tipi di cellule tra cui cellule T, cellule dendritiche plasmacitoidi, cellule staminali pluripotenti indotte, cellule staminali neuronali e cellule staminali delle vie aeree 24,38,40,41,42,43,44 . Questa strategia può essere implementata per la produzione di cellule T superiori del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Ad esempio, è stato recentemente pubblicato che il knock-out mediato da CRISPR / Cas9 del gene TGFBR2 nelle cellule T CAR aumenta notevolmente la loro funzione nel microambiente tumorale soppressivo ricco di TGF-β⁴⁵. Tale approccio potrebbe fornire un protocollo in un'unica fase sia per ingegnerizzare le cellule T per esprimere la CAR sia per eliminare il gene TGFBR2 inserendo specificamente il CAR in entrambi gli alleli del gene TGFBR2. Inoltre, questo approccio potrebbe anche essere utile per generare cellule T CAR universali integrando la CAR nel gene^46,47 del recettore alfa costante del recettore delle cellule T (TRAC).

Per aumentare la riproducibilità e garantire un editing efficiente delle celle, è necessario tenere conto di alcune importanti considerazioni. I principali punti critici per garantire il successo dell'editing delle cellule risiedono in (i) la selezione dell'sgRNA, (ii) il design del template HDR e (iii) la produzione di rAAV6.

La selezione di un sgRNA ad alte prestazioni è cruciale in quanto determinerà il numero massimo di alleli in cui il modello HDR può essere integrato. Grazie ai numerosi software ora disponibili, la ricerca di sgRNA candidati è stata semplificata. Selezionando la regione di interesse, il software può proporre una serie di sgRNA con un punteggio on-target e un off-target score che indicano le possibilità di editing rispettivamente nel locus desiderato e nei loci indesiderati. Questi punteggi sono calcolati sulla base di modelli di punteggio precedentemente pubblicati^48,49. Sebbene questo sia un buon punto di partenza per selezionare uno sgRNA ad alte prestazioni, le prestazioni dell'sgRNA devono essere confermate poiché le sue prestazioni previste in silico non sempre corrispondono a un efficiente sgRNA in vitro. Pertanto, si consiglia vivamente di progettare e testare almeno tre sgRNA per aumentare le possibilità di trovare il miglior sgRNA. Una volta identificato un vero sgRNA dalle buone prestazioni, si suggerisce di procedere con la progettazione del template HDR.

Le precauzioni devono essere prese in considerazione quando si progetta il modello HDR. I bracci di omologia sinistro e destro (LHA e RHA, rispettivamente) dovrebbero estendersi ciascuno su 400 bp a monte e a valle del sito di taglio dell'sgRNA, rispettivamente, poiché HA più brevi potrebbero comportare una riduzione delle frequenze HDR. La dimensione del cDNA che può essere introdotto tramite HDR dipende dalle capacità di confezionamento degli AAV, che è di circa 4,7 kb. A causa dei numerosi elementi obbligatori all'interno del modello HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, promotore e sequenza reporter fluorescente), lo spazio rimanente per il cDNA mutato o WT è limitato. Questo non è problematico se la mutazione desiderata si trova vicino all'estremità 3' di un gene o in geni con un CDS corto complessivo. Tuttavia, nei casi in cui la mutazione si trova vicino al lato iniziale trascrizionale (TSS) dei geni con un CDS lungo (superiore allo spazio di impacchettamento rimanente dell'AAV), questo approccio descritto potrebbe non essere fattibile. Per aggirare questo problema, una strategia che si basa sulla divisione del modello HDR in due AAV è stata recentemente sviluppata da Bak e colleghi. Questa strategia si basa su due integrazioni separate mediate da HDR per ottenere l'integrazione finale senza soluzione di continuità di un grande gene⁵⁰.

La qualità del virus e il suo titolo sono fattori aggiuntivi che possono creare o distruggere l'ingegneria genomica di successo delle cellule. Per una resa ottimale, è importante non lasciare che l'HEK293T raggiunga la piena confluenza mentre viene mantenuto in coltura. Idealmente, le cellule HEK293T dovrebbero essere divise quando viene raggiunta la confluenza del 70% -80%. Inoltre, l'HEK293T non deve essere coltivato per lunghi periodi di tempo in quanto ciò può ridurre la loro capacità di produrre virus. Le nuove cellule HEK293T devono essere scongelate dopo 20 passaggi. Ottenere titoli virali elevati è importante per aumentare l'efficienza e la riproducibilità degli esperimenti. Bassi titoli virali si tradurranno in grandi volumi di soluzione rAAV necessaria per la trasduzione delle HSPC. Come regola generale, la soluzione rAAV aggiunta alle cellule nucleofettate non deve superare il 20% del volume totale del mezzo di ritenzione HSPC. Volumi più elevati di soluzione AAV possono portare ad un aumento della morte cellulare, a una minore proliferazione e a una ridotta efficienza di trasduzione. In caso di titoli virali bassi, si raccomanda pertanto di concentrare ulteriormente il virus.

In sintesi, questo protocollo offre un approccio riproducibile per manipolare gli HSPC umani in modo preciso ed efficiente attraverso l'uso simultaneo di modelli di donatori CRIPSR/Cas9 e rAAV6 con ulteriori reporter fluorescenti doppi. Questo approccio ha dimostrato di essere un ottimo strumento per studiare la normale biologia delle cellule staminali ematopoietiche e i contributi che le mutazioni apportano alla leucemogenesi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pallone per colture cellulari da 175 cm2, tappo di sfiato, trattato	TC Corning	431080
piastre da 150 mm x 25 mm	Corning	430599
293T	DSMZ	ACC 635	https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit	Lonza-Per		la nucleofezione di HSPC umani utilizzare il programma DZ-100.
4D Nucleofector X Unit	Lonza-500
ml Tubo da centrifuga	Corning	431123
7-AAD	BD Biosciences	559925
Kit di purificazione AAVpro	Takara	6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies (IDT)	1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuga	Beckman Strumento
	Strumento online per la progettazione di sgRNA: http://www.benchling.com/crispr
			Sito web: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequenza per l'sgRNA che ha come bersaglio l'introne 7 di CALR: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3'                 Uno scaffold SpCas9 da 80 nucleotidi viene aggiunto alla sequenza di RNA a 20 nucleotidi per completare l'sgRNA. Le modifiche chimiche del 2'-O-metile vengono aggiunte alle prime e alle ultime 3 basi e i legami fosforotioato 3' vengono aggiunti nelle prime 3 e nelle ultime 2 basi.       *In alternativa, gli sgRNA sintetici chimicamente modificati possono essere acquisiti da IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) e Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool			Strumento online per la progettazione di sgRNA: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Well Plates	Corning	3526
CRISPick sgRNA design tool			Strumento online per la progettazione di sgRNA: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
strumento di progettazione			Strumento online per la progettazione di sgRNA: piastre http://crispor.tefor.net
ddPCR a 96 pozzetti	Bio-Rad	12001925
ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)	Bio-Rad	1863024
DG8 per generatore di gocce QX200/QX100	Bio-Rad	1864008
DG8 per generatore di gocce QX200/QX100	Bio-Rad	1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Olio per Generazione di Goccioline per Sonde	Bio-Rad	1863005
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
FACSAria Fusion	BD Biosciences-Falcon
5 mL Round Bottom Corning		352054
Siero fetale bovino (FBS) Good Forte (inattivato a caldo), 500 ml	Pan Biotech	P40-47500
FlowJo 10.8.0	BD Biosciences	-
GenAgarose L.E.	Inno-train	GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs Inc. (NEB)	E2611L
HEK293T
soluzione HEPES	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
ICE	Synthego		https://ice.synthego.com
Strumento di ottimizzazione del codone IDT	IDT		https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA Strumento			online per la progettazione di sgRNA: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Brodo (Lennox) EZMix in polvere terreno di crescita microbica	Sigma-Aldrich	L7658-1KG
LB Brodo con agar (Lennox) EZMix in polvere terreno di coltura microbico	Sigma-Aldrich	L7533-1KG
Midori Green Advance	Nippon Genetics	MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit	NEB	T1020L
NEB 5-alfa E. coli competente (alta efficienza)	NEB	C2987U
Acqua senza nucleasi, 5X100 ml	Ambion	AM9939
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410
Opti-MEM, terreno di coltura sierologico, 500 ml	Gibco	31985070
cellula primaria P3 4D-Nucleofetor  X Kit L	Lonza	V4XP-3024	La soluzione primaria P3 di Lonza viene fornita sotto forma di soluzione di nucleolettore di cellule primarie P3 da 2,25 mL e di integratore 1 da 0,5 mL. Per ricostituire, aggiungere l'integratore 1 alla soluzione di nucleolettore della cellula primaria P3 e mescolare.
pAAV-MCS2	Addgene	46954
Lamina termosaldante per piastra PCR, perforabile	Bio-Rad	1814040
pDGM6	Addgene	110660
Penicillina-Streptomicina (P/S)	Gibco	15140122
Polietilenimmina (PEI)	Polysciences	23966	Aggiungere 50 mL di PBS 4.5 pH (a base di HCl) a 50 mg di PEI in una provetta. Sciogliere posizionando il tubo in un 70° C bagnomaria e vortice ogni 10 minuti fino a quando la soluzione non si è sciolta. Dopo che la soluzione ha raggiunto RT, filtrare sterilizzare attraverso un 0,22 μ filtro m, fare 1120 μ L aliquote, e conservare a -80°C.
Provetta in polistirene, con primer con tappo
	Gli Eurofins-Primers		sono stati ordinati da Eurofins (eurofinsgenomics.eu) come oligo personalizzati senza sale non modificati. I primer sono stati progettati utilizzando PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                                                                        Primer 1 Fwd:      AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                               Primer 2 Rev CALR WT specifico: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                                         Primer 2 Rev CALR DEL specifico: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay	IDT-PrimeTime		qPCR Probe Assays (1 sonda/2 primer)  ordinabile da IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scala: Saggio Std - qPCR 500 reazioni; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Innesco 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Sonda (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Tintura/3' Dissetatore: FAM/ZEN/IBFQ; Rapporto tra primer e sonda: 3,6
PX1 Sigillante per piastre PCR	Bio-Rad	1814000
QuantaSoft Software	Bio-Rad
Quick Extract Soluzione di estrazione del DNA	Lucigen	QE0905T
Generatore di gocce QX200	Bio-Rad	1864002
QX200 Lettore di gocce	Bio-Rad
Flt3-ligando umano ricombinante	Peprotech	300-19
IL-6 umano ricombinante	Peprotech	200-06
SCF umano ricombinante	Peprotech	300-07
TPO umano ricombinante	Peprotech	300-18
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758-6X500ML
SnapGene	Dotmatics		Software di clonaggio molecolare https://www.snapgene.com *In alternativa è possibile utilizzare anche Benchling (https://www.benchling.com) e Geneious (https://www.geneious.com).
Mezzo di crescita Soc	NEB	B9020S
Sodio-butirrato	Sigma-Aldrich	B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1)	Biogems	1224999
StemSpan SFEM II	STEMCELL Technologies	9655
TAE Buffer (Tris-acetato-EDTA) 50X	Thermo Scientific	B49
TIDE			http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0,4%	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
TrypLE (con rosso fenolo), 500 ml	Thermo Scientific	16605-028
UltraPure 0,5: EDTA, pH 8,0, 100 ml	Thermo Scientific	15575-038
UM171	STEMCELL Technologies	72914
Strumento di ottimizzazione del codone Vector Builder	Vector Builder		https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html