Articolo metodologico

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

DOI:

10.3791/64580

⸱

11 ottobre 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopia a fluorescenza time-lapse ha rivoluzionato la comprensione degli eventi del ciclo cellulare meiotico fornendo dati temporali e spaziali che spesso non vengono visualizzati dalle cellule fisse di imaging. Il lievito in erba ha dimostrato di essere un importante organismo modello per studiare la segregazione cromosomica meiotica perché molti geni meiotici sono altamente conservati. La microscopia time-lapse della meiosi nel lievito in erba consente il monitoraggio di diversi mutanti meiotici per mostrare come la mutazione interrompe i processi meiotici. Tuttavia, molte proteine funzionano in più punti della meiosi. L'uso di mutanti nulli meiotici o con perdita di funzione può quindi interrompere un processo precoce, bloccando o disturbando il processo successivo e rendendo difficile determinare i fenotipi associati a ciascun singolo ruolo. Per aggirare questa sfida, questo protocollo descrive come le proteine possono essere impoverite condizionatamente dal nucleo in fasi specifiche della meiosi mentre monitorano gli eventi meiotici usando la microscopia time-lapse. In particolare, questo protocollo descrive come le cellule sono sincronizzate nella profase I, come la tecnica dell'ancoraggio viene utilizzata per esaurire le proteine dal nucleo in specifici stadi meiotici e come l'imaging time-lapse viene utilizzato per monitorare la segregazione cromosomica meiotica. Come esempio dell'utilità della tecnica, la proteina cinetocoora Ctf19 è stata impoverita dal nucleo in diversi punti temporali durante la meiosi e il numero di masse di cromatina è stato analizzato alla fine della meiosi II. Nel complesso, questo protocollo può essere adattato per esaurire diverse proteine nucleari dal nucleo mentre si monitorano le divisioni meiotiche.

Introduzione

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La microscopia a fluorescenza time-lapse è un valido strumento per studiare la dinamica della segregazione cromosomica meiotica nel lievito in erba 1,2. Le cellule di lievito in erba possono essere indotte a subire meiosi attraverso la fame di nutrienti chiave3. Durante la meiosi, le cellule subiscono un ciclo di segregazione cromosomica seguito da due divisioni per creare quattro prodotti meiotici che vengono confezionati in spore (Figura 1). Le singole cellule possono essere visualizzate durante ogni fase della meiosi, che genera dati spaziali e temporali che possono essere facilmente ignorati dall'imaging a cellule fisse. Questo protocollo mostra come la combinazione della microscopia a fluorescenza time-lapse con due metodi precedentemente stabiliti, il sistema inducibile NDT80 (NDT80-in) e la tecnica anchor away, può essere utilizzata per studiare la funzione di proteine specifiche in fasi meiotiche distinte.

Il sistema NDT80-in è un potente strumento per la sincronizzazione del ciclo cellulare meiotico che si basa sull'espressione inducibile del fattore di trascrizione della meiosi media NDT80 4,5. L'espressione di NDT80 è richiesta perl'uscita 6,7 della profase I. Con il sistema NDT80-in, NDT80 è sotto il controllo del promotore GAL1-10 nelle cellule che esprimono il fattore di trascrizione Gal4 fuso in un recettore degli estrogeni (Gal4-ER)4,5. Poiché Gal4-ER entra nel nucleo solo quando è legato al β-estradiolo, le cellule NDT80-in si arrestano nella profase I in assenza di β-estradiolo, che consente la sincronizzazione delle cellule nella profase I (Figura 1). β-estradiolo promuove la traslocazione del fattore di trascrizione Gal4-ER nel nucleo, dove lega GAL1-10 per guidare l'espressione di NDT80, portando all'ingresso sincrono nelle divisioni meiotiche. Sebbene la microscopia time-lapse possa essere eseguita senza sincronizzazione, il vantaggio di utilizzare la sincronizzazione è la possibilità di aggiungere un inibitore o un farmaco mentre le cellule si trovano in una fase specifica della meiosi.

La tecnica dell'ancoraggio è un sistema inducibile mediante il quale una proteina può essere impoverita dal nucleo con l'aggiunta di rapamicina8. Questa tecnica è ideale per studiare le proteine nucleari durante la divisione cellulare nel lievito in erba perché le cellule di lievito subiscono mitosi chiusa e meiosi, in cui l'involucro nucleare non si rompe. Inoltre, questa tecnica è molto utile per le proteine che hanno molteplici funzioni durante la meiosi. A differenza delle delezioni, degli alleli mutanti o degli alleli meiotici nulli, la rimozione di una proteina bersaglio dal nucleo in uno stadio specifico non compromette l'attività della proteina bersaglio nelle fasi precedenti, consentendo un'interpretazione più accurata dei risultati. Il sistema di ancoraggio utilizza la spola delle subunità ribosomiali tra il nucleo e il citoplasma che si verifica alla maturazione ribosomiale8. Per esaurire la proteina bersaglio dal nucleo, la proteina bersaglio viene marcata con il dominio di legame della rapamicina FKBP12 (FRB) in un ceppo in cui la subunità ribosomiale Rpl13A è marcata con FKBP12. Senza rapamicina, FRB e FKBP12 non interagiscono e la proteina marcata con FRB rimane nel nucleo. Dopo l'aggiunta di rapamicina, la rapamicina forma un complesso stabile con FKBP12 e FRB, e il complesso viene espulso dal nucleo a causa dell'interazione con Rpl13A (Figura 1). Per prevenire la morte cellulare dopo l'aggiunta di rapamicina, le cellule ospitano la mutazione tor1-1 del gene TOR1 . Inoltre, queste cellule contengono fpr1Δ , un allele nullo della proteina FKBP12 di S. cerevisiae , che impedisce a Fpr1 endogeno di superare Rpl13A-FKBP12 per il legame con FRB e rapamicina. Le mutazioni di fondo di ancoraggio, tor1-1 e fpr1Δ, non influenzano i tempi meiotici o la segregazione cromosomica2.

Per dimostrare l'utilità di questa tecnica, la proteina cinetocoro Ctf19 è stata esaurita in diversi punti temporali durante la meiosi. Ctf19 è un componente del cinetocore che è superfluo nella mitosi ma richiesto per una corretta segregazione cromosomica nella meiosi 9,10,11,12,13. Nella meiosi, il cinetocoro viene eliminato nella profase I e Ctf19 è importante per il riassemblaggio dei cinetochi 9,14. Per questo protocollo, le cellule con il sistema NDT80-in sono state sincronizzate e la tecnica dell'ancoraggio è stata utilizzata per esaurire la proteina bersaglio Ctf19 dal nucleo prima e dopo il rilascio dalla profase I e dopo la segregazione cromosomica della meiosi I (Figura 1). Questo protocollo può essere adattato per esaurire altre proteine di interesse in qualsiasi fase della meiosi e della mitosi.

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Protocollo

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1. Preparazione dei materiali necessari

  1. Preparare i reagenti per la crescita e la sporulazione delle cellule di lievito.
    NOTA: Se i ceppi di lievito in erba sono ade2- e trp1-, integrare tutti i terreni nei punti 1.1.1-1.1.3 con una concentrazione finale dello 0,01% di adenina e dello 0,01% di triptofano dall'1% di stock. Se i mezzi di sterilizzazione in autoclave, aggiungere questi aminoacidi solo dopo che i reagenti sono stati autoclavati e lasciati raffreddare a temperatura ambiente.
    1. Per la crescita vegetativa, preparare 2x mezzo completo + destrosio sintetico (2XSC) sciogliendo 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi, 2 g di miscela completa di aminoacidi e 20 g di destrosio in 500 ml di acqua. Sterilizzare la miscela in autoclave per 20 minuti a 121 °C o filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
    2. Per la prima fase della sporulazione, preparare 2x mezzo completo sintetico + acetato (2XSCA) sciogliendo 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi, 2 g di miscela completa di aminoacidi e 20 g di acetato di potassio in 500 ml di acqua. Sterilizzare la miscela in autoclave per 20 minuti a 121 °C o filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
    3. Per la fase finale della sporulazione, preparare l'1% di acetato di potassio (1% KAc) sciogliendo 5 g di KAc in 500 ml di acqua. Sterilizzare la miscela in autoclave per 20 minuti a 121 °C o filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
  2. Preparare farmaci e reagenti per la microscopia, la sincronizzazione e l'ancoraggio.
    1. Per far aderire le cellule al vetrino durante l'imaging time-lapse, produrre 1 mg/ml di concanavalina A (ConA) in 1x PBS. Sterilizzare il filtro con un filtro da 0,2 μm e conservare piccole aliquote (~10 μL) a -20 °C.
    2. Per utilizzare il sistema NDT80-in, produrre 2 ml di 1 mM di β-estradiolo disciolto in etanolo. Sterilizzare il filtro con un filtro da 0,2 μm e conservare le aliquote (~500 μL) a -20 °C.
    3. Per il sistema di ancoraggio, produrre 1 mg / ml di rapamicina sciolta in DMSO. Sterilizzare il filtro con un filtro da 0,2 μm e conservare piccole aliquote (~10 μL) a -20 °C.
      NOTA: Preparare piccole aliquote di rapamicina per evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento del farmaco.
  3. Generare ceppi di lievito contenenti il sistema NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) e una proteina bersaglio marcata con FRB nel background genetico di ancoraggio (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Per questo studio è stato utilizzato Ctf19-FRB. Inoltre, una copia della proteina istonica Htb2 è stata etichettata con mCherry per consentire il monitoraggio della progressione meiotica e della segregazione della cromatina.
  4. Preparare una camera per l'imaging time-lapse
    1. Iniziare a preparare la camera 6 h-24 h prima dell'imaging (Figura 2). Tagliare una camera da 18 x 18 mm dall'inserto della scatola della punta della pipetta usando un bisturi riscaldato o un'altra lama affilata.
    2. Utilizzare una punta di pipetta di plastica per stendere un sottile strato di sigillante siliconico attorno ai bordi inferiori della camera che aderirà al vetrino. Aggiungere abbastanza sigillante in modo che i bordi della camera siano completamente coperti (vedere Figura 2).
    3. Far aderire la camera a un coprivetro di 24 mm x 50 mm posizionando delicatamente la camera, con il sigillante rivolto verso il basso, sul vetrino di copertura. Assicurarsi che non vi siano spazi vuoti nel sigillante in modo che la camera non perda.
    4. Stendere 8-10 μL di ConA sul vetrino. Erogare ConA al centro del vetrino e utilizzare una punta di pipetta per distribuire il ConA in uno strato sottile in modo da coprire la maggior parte del vetrino circondato dalla camera.
      NOTA: Le camere in plastica possono essere riutilizzate all'infinito. Dopo aver completato l'imaging time-lapse, rimuovere la camera dal coprislip usando un rasoio, pulire il sigillante siliconico dalla camera e mantenere le camere immerse in etanolo al 95% per un uso futuro.

2. Sporulazione delle cellule di lievito

  1. Eseguire i seguenti passaggi per la fame delle cellule di lievito per indurre il programma meiotico.
    NOTA: Questi passaggi sono per la sporulazione del ceppo di lievito W303. Altri ceppi possono richiedere protocolli diversi15. L'efficienza di sporulazione è altamente variabile tra i ceppi di laboratorio, con W303 che mostra un'efficienza di sporulazione di ~60%16,17,18.
    1. Prelevare una singola colonia del ceppo di lievito diploide appropriato da una piastra e inoculare 2 ml di 2XSC e lasciare crescere a 30 °C su un tamburo a rulli per 12-24 ore fino alla saturazione.
    2. Diluire la coltura satura in 2XSCA aggiungendo 80 μL della coltura dal punto 2.1.1 a 2 mL di 2XSCA. Lasciarlo crescere a 30 °C su un tamburo a rulli per 12-16 ore. Non lasciare in 2XSCA per più di 16 ore perché le cellule possono ammalarsi o auto-fluorescenti.
    3. Eseguire due lavaggi facendo girare la coltura a 800 x g a temperatura ambiente (25 °C) per 1 minuto, scartando il liquido e risospendendo il pellet in 2 ml di acqua distillata sterile.
    4. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere il liquido e risospendere il pellet in 2 ml di KAc all'1% e lasciarlo crescere a 25 °C su un tamburo a rulli per 8-12 ore. Le cellule che sono entrate nella meiosi si arresteranno nel pachitene della profase I.
  2. Sistema di rilascio Prophase I
    1. Aggiungere β-estradiolo direttamente alla coltura di sporulazione fino a una concentrazione finale di 1 μM e vortice rapidamente il tubo di coltura. Il β-estradiolo rilascerà cellule dalla profase I.

3. Deplezione della proteina bersaglio dal nucleo utilizzando la tecnica dell'anchor away

  1. Aggiungere rapamicina alle cellule per esaurire la proteina marcata FRB dal nucleo in una fase particolare.
    1. Per esaurire le proteine dal nucleo all'uscita della profase I, aggiungere rapamicina a una concentrazione finale di 1 μg / ml alla provetta di coltura di sporulazione contemporaneamente all'aggiunta di β-estradiolo.
    2. Per esaurire le proteine dal nucleo in una particolare fase della meiosi, monitorare la fase del ciclo cellulare a partire da 60 minuti dopo l'aggiunta di β-estradiolo. Ogni 20 minuti, pipettare 5 μL di coltura su un coprivetrino di 24 mm x 40 mm e coprire le cellule con un coprivetrino di 18 mm x 18 mm. Mantenere le colture che ruotano sul tamburo a rulli a 25 °C tra i punti temporali.
    3. Immagini delle cellule utilizzando il filtro A594/mCherry e l'obiettivo 60x di un microscopio a fluorescenza. Impostare la trasmittanza percentuale su 2% e il tempo di esposizione su 250 ms. La presenza di una, due o quattro masse di DNA indicherà lo stadio meiotico in cui le cellule sono progredite. Aggiungere la rapamicina ad una concentrazione finale di 1 μg/mL nella fase meiotica di interesse.
  2. Mantenere le celle che ruotano sul tamburo a rulli a 25 °C fino a quando non sono pronte per l'imaging. L'esaurimento nucleare di una proteina bersaglio si verifica 30-45 minuti dopo l'aggiunta di rapamicina 2,8.

4. Microscopia a fluorescenza time-lapse

  1. Crea un cuscinetto di agar che verrà utilizzato per creare un monostrato di cellule per l'imaging (vedi passo 4.2).
    1. Tagliare e scartare il tappo e il fondo 1/3 di un tubo di microfuge da 1,5 ml per creare un cilindro. Il cilindro servirà da stampo per il cuscinetto di agar. Fai due cilindri per avere un extra nel caso in cui l'agar non polimerizzi correttamente nel primo.
    2. Posizionare il cilindro del tubo di microfuge tagliato su un vetrino pulito con la parte superiore del tubo capovolta seduta sul vetrino.
    3. Preparare 6 mL di una soluzione di agar al 5% (usare KAc all'1% come solvente) in un becher da 50 mL e cuocerlo nel microonde fino a quando l'agar non è completamente sciolto.
      NOTA: L'agar bollirà facilmente nel microonde; Guarda l'agar e avvia e ferma il microonde quando l'agar inizia a bollire e ruotare il becher. Avviare e arrestare il microonde più volte per sciogliere completamente l'agar. La soluzione di agar viene prodotta in eccesso rispetto alla quantità necessaria per garantire che l'agar si dissolva completamente.
    4. Tagliare la punta del pipet per creare un'apertura più grande e pipettare ~ 500 μL di agar fuso in ciascun cilindro del tubo microfuge. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino a quando l'agar si solidifica (~10-12 min).
  2. Preparazione delle cellule di lievito per l'imaging
    1. Centrifugare 200 μL della coltura di sporulazione dal punto 3.2 a 800 x g per 2 minuti in provette da microcentrifuga da 1 ml. Rimuovere ed eliminare 180 μL di surnatante. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente ruotando e facendo scorrere il tubo.
    2. Pipet 6 μL delle cellule concentrate sul vetrino di copertura al centro della camera realizzato al punto 1.4.
    3. Tenere il cilindro con il cuscinetto di agar realizzato al punto 4.1 e farlo scorrere con cautela dal vetrino. Assicurarsi che l'agar sia completamente piatto nella parte inferiore e, utilizzando il fondo della punta di una pipetta, applicare una leggera pressione allo stampo microfuge in modo che il tampone di agar venga spinto leggermente al di sopra del bordo del tubo.
    4. Capovolgere lo stampo in modo che il cuscinetto di agar sia rivolto verso il basso verso la camera.
    5. Usando una pinza, posizionare delicatamente il cuscinetto di agar (ancora nello stampo del tubo di microfuge) sopra le celle. Utilizzare una punta per pipetta per far scorrere delicatamente il cuscinetto di agar intorno alla camera 10-20 volte per creare un monostrato di celle sul vetrino.
    6. Lasciare l'agar pad nella camera per 12-15 minuti. Questo passaggio consentirà alle celle di aderire al ConA sul coprifoglio.
    7. Trasferire 2 ml di coltura di sporulazione dal punto 3.2 a due provette da microcentrifuga e centrifugare a 15.700 x g per 2 minuti. Trasferire il surnatante in tubi di microfuge puliti e ruotare nuovamente a 15.700 x g per 2 minuti. Trasferire il surnatante in provette di microcentrifuga pulite da utilizzare nella fase successiva.
      NOTA: È importante utilizzare il surnatante KAc precondizionato con il β-estradiolo e la rapamicina per garantire una sporulazione efficiente e un esaurimento continuo della proteina di interesse.
    8. Dopo che il pad di agar è rimasto nella camera per 12-15 minuti, galleggiare e rimuovere il pad di agar prima di immaginare. A tal fine, aggiungere 2 mL di surnatante dal punto 4.2.7 goccia nella camera. Una volta che il liquido ha raggiunto la parte superiore della camera, il cuscinetto di agar molto probabilmente galleggerà.
      NOTA: Se l'agar pad non galleggia automaticamente, attendere 1-2 minuti. Se il cuscinetto di agar continua a non galleggiare, rimuoverlo delicatamente con una pinza. Idealmente, il cuscinetto di agar galleggerebbe da solo perché rimuoverlo prima di galleggiare potrebbe portare alla rimozione delle cellule.
    9. Dopo che il cuscinetto di agar ha galleggiato, rimuoverlo delicatamente con una pinza e scartarlo. Posizionare un coprislip da 24 x 50 mm sulla parte superiore della camera per evitare l'evaporazione durante l'imaging.
  3. Impostazione di un filmato al microscopio
    NOTA: Le istruzioni riportate di seguito si riferiscono a un microscopio invertito dotato di un supporto per vetrino che ospita il coprivetrino da 24 x 50 mm (vedere la tabella dei materiali per i dettagli di microscopio, fotocamera e software). Per l'acquisizione delle immagini viene utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 60x. Potrebbe essere necessario modificare questo protocollo quando si utilizzano altri microscopi o altri supporti per vetrini. I passaggi esatti per l'esecuzione dal punto 4.3.2 al passaggio 4.3.16 variano a seconda del microscopio e del software di imaging utilizzati. Vedere paragrafo 4.4 per le istruzioni per un microscopio diverso.
    1. Inserire la copertina all'interno del portavetrina. Far aderire l'argilla di stampaggio sul lato del coprislip per tenerlo saldamente nel supporto della slitta.
    2. Aprire il software di acquisizione delle immagini. Utilizzare manopole di regolazione del percorso e della regolazione fine per mettere a fuoco le celle utilizzando DIC o campo luminoso.
    3. Nel menu principale del software di acquisizione immagini, fare clic su File > Acquisisci (Risolvi 3D). Verranno visualizzate tre finestre.
    4. Nella finestra denominata Resolve 3D, fare clic sull'icona Erlenmeyer Flask . Si aprirà una finestra denominata Design/Run Experiment, che contiene i controlli per impostare un esperimento per impostare un filmato time-lapse.
    5. Nella scheda Progettazione , passare alla scheda Sezionamento. Selezionare la casella accanto a Sezionamento Z. Impostare le pile z come segue: Distanza tra le sezioni ottiche = 1 μm, Numero di sezioni ottiche = 5, Spessore campione = 5,0 μm.
    6. Nella scheda Canali , fai clic sull'icona + in modo che venga visualizzata un'opzione di canale. Selezionare il canale appropriato. Per questo esperimento, selezioniamo A594, che viene utilizzato per visualizzare l'immagine di mCherry. Selezionare la casella accanto a Immagine di riferimento e impostare la posizione Z al centro del campione dal menu a discesa.
    7. Selezionare un valore dal menu a discesa adiacente a %T ed Exp. per impostare rispettivamente la percentuale di trasmissione e il tempo di esposizione. Per questo esperimento, nel canale A594 vengono utilizzati il 2% di trasmittanza e il tempo di esposizione di 250 ms e il 10% di trasmittanza e il tempo di esposizione di 500 ms vengono utilizzati per il campo luminoso.
      NOTA: Il tempo di esposizione e la percentuale di trasmittanza variano con i diversi microscopi. Per evitare la sovraesposizione, utilizzare la più bassa percentuale di trasmittanza e il tempo di esposizione più breve possibile che consenta una corretta visualizzazione della proteina di interesse.
    8. Nella scheda Time-lapse, seleziona la casella accanto a Time-lapse. Nella tabella visualizzata, immettere 10 sotto la colonna min nella riga time-lapse e 10 sotto la colonna ore nella riga del tempo totale. Questo eseguirà un corso di tempo prendendo immagini ogni 10 minuti per 10 ore.
    9. Seleziona la casella accanto a Mantieni la messa a fuoco con la massima messa a fuoco per evitare la deviazione dello stage durante il filmato. Nella scheda Punti selezionare la casella accanto a Elenco punti visita.
    10. Nel menu principale, fare clic su Visualizza > elenco punti. Apparirà una finestra chiamata elenco di punti. Spostare lo stage in un'area della camera che mostra un monostrato di celle. Fare clic su Segno di punto nella finestra dell'elenco dei punti.
    11. Sposta lo stage per selezionare 25-30 punti senza sovrapposizioni per evitare di sovraesporre le celle. Ogni campo verrà visualizzato durante ogni corso di tempo.
    12. Nella finestra Elenco punti, selezionate Calibra tutto per impostare lo stato attivo finale per ciascun punto. Nella scheda Progettazione della finestra Desgin/Esegui esperimento , immettere l'intervallo di valori dei punti (ottenuti dalla finestra Elenco punti) nella casella accanto a Elenco punti visita. Nella scheda Esegui salvare il file nella destinazione appropriata nel computer. Nella finestra Progetta/Esegui esperimento , seleziona il pulsante Riproduci (icona a forma di triangolo verde) per avviare il filmato.
  4. Metodo opzionale: impostazione di un filmato al microscopio
    NOTA: Queste istruzioni sono per un microscopio invertito dotato di un supporto per vetrino che può ospitare un coprivetrino da 24 x 50 mm. Vedere la tabella dei materiali per le specifiche relative al microscopio, alla fotocamera e al software di imaging utilizzati. Per l'acquisizione delle immagini viene utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 60x.
    1. Inserire la copertina all'interno del portavetrina. Aprire il software di acquisizione delle immagini. Utilizzare manopole di regolazione del percorso e della precisione per mettere a fuoco le celle utilizzando DIC o campo chiaro. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra aperta del software. Apparirà un menu a discesa.
    2. Fare clic su Acquisizione controlla > acquisizione. Fare clic su Applicazione > definire/eseguire esperimento. Si aprirà una finestra denominata ND Acquisition.
    3. Nella finestra che si apre, seleziona la casella accanto a XY. Spostate lo stage nella posizione desiderata e fate clic sulla casella sotto Nome punto per selezionare tale posizione come punto. Ripetere l'operazione fino a selezionare 25-30 punti senza sovrapposizioni per evitare di sovraesporre le celle. Ogni campo verrà visualizzato durante ogni corso di tempo.
    4. Impostare la trasmittanza percentuale per ciascun canale fluorescente. Poiché i ceppi producono Htb2-mCherry, qui viene utilizzato il filtro mCherry. Nella finestra Acquisizione aperta al passaggio 4.3.3, passare al pulsante 555 nm. Impostare la trasmittanza percentuale su 5% regolando la scala mobile sotto il pulsante 555 nm fino a quando non viene visualizzato il 5%.
    5. Impostare il tempo di esposizione per ciascun canale fluorescente. Nella finestra Acquisizione , selezionare 200 ms dal menu a discesa Esposizione.
      NOTA: Il tempo di esposizione e la percentuale di trasmittanza variano con i diversi microscopi. Per evitare la sovraesposizione, utilizzare la più bassa percentuale di trasmittanza e il tempo di esposizione più breve possibile che consenta una corretta visualizzazione della proteina di interesse.
    6. Fare clic sulla casella accanto a Z nella finestra Acquisizione ND . Impostare cinque z-stack delle cellule di lievito che sono 1,2 μM di distanza.
    7. Fare clic sulla casella accanto a λ. Selezionare i canali appropriati da utilizzare per l'esperimento. Per DIC, assicurarsi che Home sia selezionato dal menu a discesa sotto Z pos. Per mCherry, assicurati che All sia selezionato dal menu a discesa sotto Z pos. Ciò garantisce che solo una singola sezione (al centro dello z-stack) venga presa per DIC.
    8. Selezionare la casella accanto a Ora nella finestra Acquisizione ND . Selezionare la casella sotto Fase. Nel menu a discesa sotto Intervallo, selezionare 10 min. In Durata, seleziona 10 ore. Questo eseguirà il tempo in modo tale che le immagini vengano scattate ogni 10 minuti per 10 ore.

5. Analisi della segregazione della cromatina

  1. Apri il software Fiji. Apri un campo visivo alla volta: per ogni campo, apri i canali DIC e mCherry.
  2. Prendi la proiezione di massima intensità del canale mCherry per ottenere una singola immagine: clicca su Image > Stacks > Z Project, seleziona Max Intensity dal menu a tendina.
  3. Unisci i canali DIC e mCherry in un'unica immagine: fai clic su Immagine > Colore > Unisci canali.
  4. Seguire una singola cellula attraverso la meiosi. Dopo il completamento della meiosi II, registrare il numero di masse di DNA.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per monitorare la segregazione della cromatina, la proteina istonica Htb2 è stata etichettata con mCherry. Nella profase I, la cromatina appare come una singola massa di Htb2. Dopo che i cromosomi omologhi si segregano nella prima divisione meiotica, la cromatina appare come due masse distinte (Figura 3A). Dopo che i cromatidi fratelli si separano, la cromatina appare come quattro masse. Se alcuni cromosomi non riescono ad attaccarsi ai microtubuli del fuso, si possono vedere masse aggiuntiv...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo combina il sistema NDT80-in per sincronizzare le cellule, la tecnica di ancoraggio per esaurire le proteine dal nucleo e la microscopia time-lapse a fluorescenza per visualizzare le cellule di lievito in erba durante la meiosi. Il sistema NDT80-in è un metodo per la sincronizzazione del ciclo cellulare meiotico che utilizza un arresto e rilascio di profase I 4,8. Sebbene le singole cellule varino leggermente nella quantità di t...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Light Microscopy Imaging Center dell'Università dell'Indiana. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (GM105755).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
β-estradioloMillipore SigmaE8875Produci 1 mM di azioni in 95% EtOH
0,22 uM Filtro filettato per bottiglieMillipore SigmaS2GPT02RE
100% EtOHFisher Scientific22-032-601
10X PBSFisher ScientificBP399500Diluire 1:10 da utilizzare come solvente per
ConA 24 mm x 50 mm vetrino coprioggetti n. 1,5VWR Vetriniper
nordamericani 25 mm x 75 mmVWR Nord America48300-026
Sale di adenina emisolfatoMillipore SigmaA9126Per integrare SC, SCA e 1% Kac
Bacto AgarBD214030
Concanavialina AMllipore SigmaC2010Fare come 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD cameraFotometriautilizzata nella sezione 4.3
D-glucosioFisher ScientificD16-10
Difco Lievito Base azotata senza aminoacidiBD291920
Dimetil solfossido (DMSO)Millipore SigmaD5879
Eclipse Ti2 microscopio a obiettivo invertitoNikonUtilizzato nella sezione 4.4
FijiNIHScarica da https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision MicroscopeApplied PrecisionUsed in Section 4.3
L-Tryptophen Millipore SigmaT0254Per integrare SC, SCA e 1% Kac
Modeling ClayCrayola  2302880000Per fissare il vetrino coprioggetti nel supporto per vetrini
NIS-Elements AR 5.30.04 Software di imagingNikonUtilizzato nella sezione 4.4
ORCA-Fustion BT CameraHamamatsuC15440-20UPUtilizzato nella sezione 4.4
Supporto per puntali per pipette in plasticaDot ScientificLTS1000-HRTagliare una sezione di 4 quadrati x 4 quadrati della parte del rack di questo prodotto.
Acetato di PottassioFisher ScientificBP264
RapamicinaFisher ScientificBP29631Produce scorte da 1 mg/mL in DMSO
Sigillante siliconicoAqueon100165001Conosciuto anche come colla per acquari.
SoftWorx7.0.0  Software di imagingapplicato di precisioneutilizzato nella sezione 4.3
Miscela completa sintetica (Kaiser) Per olio da immersione di tipo N a medioDSCK2500
NikonMXA22166
microscopio 48393241

Riferimenti

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