Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l'ecocardiografia fetale, la necroscopia e l'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).
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Articolo metodologico
Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie cardiache congenite (CHD) sono le principali cause di morte infantile negli Stati Uniti. Nel 1980 e prima, la maggior parte dei pazienti con CHD moderata o grave è morta prima dell'età adulta, con la massima mortalità durante la prima settimana di vita. Notevoli progressi nelle tecniche chirurgiche, negli approcci diagnostici e nella gestione medica hanno portato a notevoli miglioramenti nei risultati. Per affrontare le esigenze di ricerca critiche per comprendere i difetti cardiaci congeniti, i modelli murini hanno fornito una piattaforma di ricerca ideale, in quanto hanno un'anatomia cardiaca molto simile agli esseri umani e brevi tassi di gestazione. La combinazione di ingegneria genetica con strumenti di fenotipizzazione ad alto rendimento ha permesso la replicazione e la diagnosi di difetti cardiaci strutturali per chiarire ulteriormente i percorsi molecolari alla base delle malattie coronariche di CHD. L'uso dell'ecocardiografia fetale non invasiva per lo screening dei fenotipi cardiaci nei modelli murini insieme all'alta fedeltà dell'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando l'istopatologia della microscopia confocale episcopica (ECM) con ricostruzioni tridimensionali (3D) consente una visione dettagliata dell'anatomia di vari difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo di questi metodi per ottenere una diagnosi accurata dei difetti cardiaci congeniti murini. L'applicazione di questo protocollo di fenotipizzazione agli organismi modello consentirà una diagnosi accurata di CHD, fornendo informazioni sui meccanismi della CHD. Identificare i meccanismi alla base della CHD offre opportunità per potenziali terapie e interventi.
Introduzione
Le cardiopatie congenite (CHD) sono il difetto alla nascita neonatale più comune 1,2, che colpisce circa lo 0,8%-1,7% dei neonati e provoca una significativa mortalità e morbilità neonatale3. Un'eziologia genetica è fortemente indicata con CHDs 4,5. I modelli murini geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per comprendere la complessità delle malattie coronariche e i meccanismi che le causano a causa dei topi con cuori a quattro camere e sequenze di DNA dello sviluppo cardiaco comparabili nei feti di topo e uman....
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Protocollo
L'uso di topi per questi studi è necessario in quanto i topi hanno cuori a quattro camere che possono imitare i CHD umani. I topi sono stati forniti di cure veterinarie e ospitati nella struttura accreditata per la cura degli animali da laboratorio dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). Sono stati seguiti protocolli rigorosi per ridurre al minimo il disagio, lo stress, il dolore e le lesioni dei topi. I topi sono stati eutanizzati usando gas CO2 , che è accettabile per i piccoli roditori secondo le linee guida dell'American Veterinary Medical Association sull'eutanasia. Gli studi sui topi in....
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Risultati
Gli embrioni di topo con difetti emodinamici significativi sono stati notati per essere letali embrionali. Un'ampia varietà di CHD può essere identificata attraverso l'ecocardiogramma fetale non invasivo ad alto rendimento utilizzando diverse viste (Figura 1).
Difetti del setto: I CHD più comuni sono difetti del setto come un difetto del setto ventricolare (VSD), un difetto del setto atrioventricolare (AVSD) e un difetto del setto atriale (ASD)
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Discussione
Topi geneticamente modificati sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi patologici dei difetti cardiaci congeniti. I protocolli che forniamo in questo studio tentano di semplificare e standardizzare il processo di valutazione dei difetti cardiaci fetali murina. Tuttavia, ci sono passaggi critici da notare durante il protocollo. Gli embrioni di topo crescono in modo significativo durante ogni giorno di gestazione e il momento corretto per raccogliere un topo può essere determinato eseguendo accuratamente un ecoca.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse in questo manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1,5 mL Provette Eppendorf (o fiala preferita per la conservazione dei tessuti) | SealRite | 1615-5599 | |
| Soluzione di formalina fosfato tamponata al 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% etanolo | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldeide (PFA) fissativo | ThermoScientific | 28908 | 4% concentrazione di lavoro preparato al momento in 1x PBS a 4 gradi C |
| 50 mL provette | Falcon | 352070 | |
| 6– Piastra da 12 pozzetti o fiala da 20 mL per conservazione di embrioni | Falcon | 353046 | |
| Microscopio da dissezione | Leica | MDG36 | |
| Perni di dissezione (grado A1 o A2) | F.S.T | 26002-15 | |
| Piastra di dissezione | F.S.T | FB0875713 | Piastra di Petri con base di paraffina |
| Stampi per inclusione | Sakura | 4133 | |
| Forbici extra strette (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1– 2 paia |
| Fiji applicazione/Immagine J | NIH | Fiji.sc | |
| Punta fine (0,05 mm x 0,01 mm) Pinze da dissezione (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 paia |
| Pinze calde | F.S.T | 11252-00 | Per l'orientamento degli embrioni Marcatore |
| industriale per blocchi di cera | Sharpie | 2003898 | Formattato per uso di laboratorio |
| Jenoptik ProgRes C14plus Fotocamera per microscopio | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro software di acquisizione | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Bicchiere di vetro di grandi dimensioni | Fisher Scientific | S111053 | Per la fusione della paraffina |
| Microscopio binoculare Leica M165 FC (ottica zoom 16,5:1) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Versione 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Cera di paraffina per inclusione Paraplast | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Piccolo bicchiere di vetro | Fisher Scientific | S111045 | |
| Cucchiaio piccolo perforato (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Forbici Vannas dritte (4– 8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A coppia |
| di biomicroscopi a ultrasuoni ad altissima frequenza Vevo2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xilene | Fisher Chimico | UN1307 |
Riferimenti
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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Ristampe e permessi
