Determinazione dell'efficienza di accoppiamento degli aploidi in Saccharomyces cerevisiae

Summary

In questo lavoro, viene descritto un metodo robusto per la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento nel lievito Saccharomyces cerevisiae . Questo metodo è particolarmente utile per la quantificazione delle barriere prezigotiche negli studi di speciazione.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae è un organismo modello ampiamente utilizzato in genetica, evoluzione e biologia molecolare. Negli ultimi anni, è diventato anche un organismo modello popolare per studiare i problemi legati alla speciazione. Il ciclo di vita del lievito coinvolge sia le fasi riproduttive asessuate che sessuali. La facilità di eseguire esperimenti di evoluzione e il breve tempo di generazione dell'organismo consentono lo studio dell'evoluzione delle barriere riproduttive. L'efficienza con cui i due tipi di accoppiamento (a e α) si accoppiano per formare il diploide a/α è indicata come efficienza di accoppiamento. Qualsiasi diminuzione dell'efficienza di accoppiamento tra aploidi indica una barriera pre-zigotica. Pertanto, per quantificare l'entità dell'isolamento riproduttivo tra due aploidi, è necessario un metodo robusto per quantificare l'efficienza di accoppiamento. A tal fine, viene presentato qui un protocollo semplice e altamente riproducibile. Il protocollo prevede quattro fasi principali, che includono la rattoppo degli aploidi su una piastra YPD, la miscelazione degli aploidi in numero uguale, la diluizione e la placcatura per singole colonie e, infine, il calcolo dell'efficienza in base al numero di colonie su una piastra drop-out. I marcatori auxotrofi sono impiegati per fare chiaramente la distinzione tra aploidi e diploidi.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, comunemente chiamato lievito in erba, è un eucariota unicellulare. Ha due tipi di accoppiamento, uno e α, e presenta cicli riproduttivi sia asessuati che sessuali. I tipi di accoppiamento a e α sono aploidi e possono dividersi mitoticamente in assenza dell'altro tipo di accoppiamento nell'ambiente circostante, che rappresenta il ciclo asessuato del lievito. Quando i due tipi di accoppiamento sono nelle immediate vicinanze, smettono di dividersi mitoticamente e si fondono per formare una cellula diploide. Il lievito diploide può dividersi mitoticamente quando sono pre....

Protocol

NOTA: Il protocollo prevede in generale le seguenti fasi: (1) rattoppare gli aploidi nelle griglie di efficienza di accoppiamento su una piastra YPD, (2) mescolare gli aploidi in numero uguale dopo 24 ore di incubazione e dare agli aploidi misti alcune ore per accoppiarsi (7 ore in questo studio), (3) placcare le cellule miste su YPD per isolare singole colonie dopo 7 ore a 30 °C, e infine, (4) determinare il numero di diploidi formati utilizzando i marcatori auxotrofi. Questi passaggi sono discussi in dettaglio di seguito (vedere anche la Figura 2).

1. Rattoppo degli aploidi nelle griglie di efficienza ....

Results

Quantificazione dell'efficienza di accoppiamento dei due tipi di accoppiamento
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per quantificare l'efficienza di accoppiamento tra due ceppi di lievito: tra SK1AM a e SK1AM α e tra ScAMa e ScAMα (Figura 3A). In questi esperimenti, l'accoppiamento tra i due aploidi è stato ripetuto almeno 12 volte. In ciascuna delle ripetizioni dell'esperimento, almeno 100 col.......

Discussion

La quantificazione dell'efficienza di accoppiamento in S. cerevisiae è essenziale per effettuare studi relativi ai geni coinvolti nelle vie di accoppiamento o studiare l'influenza dell'ambiente esterno sul comportamento di accoppiamento. Negli ultimi due decenni, S. cerevisiae è diventato anche un modello popolare per affrontare le questioni relative alla speciazione^14,36,37,38

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenina	Sigma Life Science	A8626
Agar Polvere grado regolare per batteriologia	SRL	19661 (0140186)
Solfato di ammonio, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucosio	Sigma Life Science	G8270
Piastre di Petri in vetro	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm di dimensione
L-Arginina	Sigma Life Science	A8094
Acido L-Aspartico	Sigma Life Science	A7219
L-Istidina monocloruro monoidrato	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucina	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucina	Sigma Life Science	L8912
L-Lisina	Aldrich	62840
L-Metionina	Sigma Life Science	M5308
L-Fenilalanina	Sigma Life Science	P5482
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tirosina	Sigma Life Science	T8566
L-Valina	Sigma Life Science	V0513
Accoppiamento griglia di efficienza	1 cm x 1,5 cm griglia rettangolare disegnata sulla piastra di Petri
	BD Difco	233520