In questo lavoro, viene descritto un metodo robusto per la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento nel lievito Saccharomyces cerevisiae . Questo metodo è particolarmente utile per la quantificazione delle barriere prezigotiche negli studi di speciazione.
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Articolo metodologico
Determinazione dell'efficienza di accoppiamento degli aploidi in Saccharomyces cerevisiae
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Saccharomyces cerevisiae è un organismo modello ampiamente utilizzato in genetica, evoluzione e biologia molecolare. Negli ultimi anni, è diventato anche un organismo modello popolare per studiare i problemi legati alla speciazione. Il ciclo di vita del lievito coinvolge sia le fasi riproduttive asessuate che sessuali. La facilità di eseguire esperimenti di evoluzione e il breve tempo di generazione dell'organismo consentono lo studio dell'evoluzione delle barriere riproduttive. L'efficienza con cui i due tipi di accoppiamento (a e α) si accoppiano per formare il diploide a/α è indicata come efficienza di accoppiamento. Qualsiasi diminuzione dell'efficienza di accoppiamento tra aploidi indica una barriera pre-zigotica. Pertanto, per quantificare l'entità dell'isolamento riproduttivo tra due aploidi, è necessario un metodo robusto per quantificare l'efficienza di accoppiamento. A tal fine, viene presentato qui un protocollo semplice e altamente riproducibile. Il protocollo prevede quattro fasi principali, che includono la rattoppo degli aploidi su una piastra YPD, la miscelazione degli aploidi in numero uguale, la diluizione e la placcatura per singole colonie e, infine, il calcolo dell'efficienza in base al numero di colonie su una piastra drop-out. I marcatori auxotrofi sono impiegati per fare chiaramente la distinzione tra aploidi e diploidi.
Introduzione
Saccharomyces cerevisiae, comunemente chiamato lievito in erba, è un eucariota unicellulare. Ha due tipi di accoppiamento, uno e α, e presenta cicli riproduttivi sia asessuati che sessuali. I tipi di accoppiamento a e α sono aploidi e possono dividersi mitoticamente in assenza dell'altro tipo di accoppiamento nell'ambiente circostante, che rappresenta il ciclo asessuato del lievito. Quando i due tipi di accoppiamento sono nelle immediate vicinanze, smettono di dividersi mitoticamente e si fondono per formare una cellula diploide. Il lievito diploide può dividersi mitoticamente quando sono pre....
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Protocollo
NOTA: Il protocollo prevede in generale le seguenti fasi: (1) rattoppare gli aploidi nelle griglie di efficienza di accoppiamento su una piastra YPD, (2) mescolare gli aploidi in numero uguale dopo 24 ore di incubazione e dare agli aploidi misti alcune ore per accoppiarsi (7 ore in questo studio), (3) placcare le cellule miste su YPD per isolare singole colonie dopo 7 ore a 30 °C, e infine, (4) determinare il numero di diploidi formati utilizzando i marcatori auxotrofi. Questi passaggi sono discussi in dettaglio di seguito (vedere anche la Figura 2).
1. Rattoppo degli aploidi nelle griglie di efficienza ....
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Risultati
Quantificazione dell'efficienza di accoppiamento dei due tipi di accoppiamento
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per quantificare l'efficienza di accoppiamento tra due ceppi di lievito: tra SK1AM a e SK1AM α e tra ScAMa e ScAMα (Figura 3A). In questi esperimenti, l'accoppiamento tra i due aploidi è stato ripetuto almeno 12 volte. In ciascuna delle ripetizioni dell'esperimento, almeno 100 col.......
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Discussione
La quantificazione dell'efficienza di accoppiamento in S. cerevisiae è essenziale per effettuare studi relativi ai geni coinvolti nelle vie di accoppiamento o studiare l'influenza dell'ambiente esterno sul comportamento di accoppiamento. Negli ultimi due decenni, S. cerevisiae è diventato anche un modello popolare per affrontare le questioni relative alla speciazione14,36,37,38
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti in questo lavoro. Gli autori sono felici di condividere i ceppi derivati da SK1 per tutti gli usi senza scopo di lucro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione DBT / Wellcome Trust (India Alliance) (IA / S / 19/2 / 504632) a S.S. P.N. è un ricercatore supportato da una sovvenzione DBT / Wellcome Trust (India Alliance) (IA / S / 19/2 / 504632). A.M. è supportato dal Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Government of India, come Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). Gli autori ringraziano Paike Jayadeva Bhat per le discussioni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenina | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Polvere grado regolare per batteriologia | SRL | 19661 (0140186) | |
| Solfato di ammonio, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma Life Science | G8270 | |
| Piastre di Petri in vetro | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm di dimensione |
| L-Arginina | Sigma Life Science | A8094 | |
| Acido L-Aspartico | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Istidina monocloruro monoidrato | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucina | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucina | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lisina | Aldrich | 62840 | |
| L-Metionina | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Fenilalanina | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Treonina | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tirosina | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valina | Sigma Life Science | V0513 | |
| Accoppiamento griglia di efficienza | 1 cm x 1,5 cm griglia rettangolare disegnata sulla piastra di Petri | ||
| BD Difco | 233520 |
Riferimenti
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics.
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Ristampe e permessi
