Articolo metodologico

Nuove prospettive metodologiche nello studio della biologia delle zanzare

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DOI:

10.3791/64602

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11 agosto 2022

 , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

In questo articolo

Abstract

ARTICOLI DISCUSSI:

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), E61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofeline geneticamente modificate. Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae . Giornale degli esperimenti visualizzati. (173), e62591(2021b).

Chen, T. Y. et al. Un protocollo di estrazione del DNA di zanzara basato su biglie magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione. Giornale degli esperimenti visualizzati. (170), E62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti . Giornale degli esperimenti visualizzati. (162), e61574 (2020).

Jensen, B. M. et al. Biotest per applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta. Giornale degli esperimenti visualizzati. (179), E63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Alimentazione e quantificazione di sangue di origine animale e pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti . Giornale degli esperimenti visualizzati. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Studio dell'attività dei neuropeptidi e di altri regolatori del sistema escretore nella zanzara adulta. Giornale degli esperimenti visualizzati. (174), e61849 (2021).

Liu, X. et al. Un test di alimentazione orale batterica con zanzare trattate con antibiotici. Giornale degli esperimenti visualizzati. (163), E61341 (2020).

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR/Cas9. Giornale degli esperimenti visualizzati. (163), E61651 (2020).

Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Coltura di gametociti di Plasmodium falciparum e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale a membrana. Giornale degli esperimenti visualizzati. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Miglioramento del test di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti (piastre EAgaL). Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), e61232 (2021).

Wang, X. et al. Espressione eterologa e analisi funzionale dei recettori odorosi di Aedes aegypti per gli odori umani negli ovociti di Xenopus . Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), e61813 (2021).

Editoriale

Gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare sono responsabili di milioni di infezioni umane ogni anno. Per combattere le malattie causate da questi agenti patogeni come la malaria e la dengue 1,2,3, i ricercatori stanno rafforzando la comprensione della biologia delle zanzare e sviluppando nuovi strumenti di controllo delle zanzare 4,5,6. Questa raccolta facilita nuove ricerche in queste aree attraverso progressi metodologici che coinvolgono la biologia delle zanzare, il controllo delle zanzare, l'infezione da agenti patogeni e la transgenesi delle zanzare.

Jensen et al.7 descrivono un saggio di attività insetticida nelle zanzare e nei moscerini della frutta che coinvolge l'applicazione topica diretta di insetticidi e una procedura di determinazione del dosaggio basata sulla massa dell'insetto. L'articolo copre la preparazione dello spazio di lavoro e le soluzioni chimiche, l'applicazione di insetticidi e il test di sopravvivenza degli insetti dopo l'esposizione. La metodologia di applicazione topica facilita l'esposizione costante a dosi definite di insetticida, riducendo la variabilità interspecifica e inter-dosaggio, che sarà di grande interesse per coloro che sono coinvolti nel controllo degli insetti nocivi o nello studio della resistenza agli insetticidi nelle popolazioni di zanzare.

Chen et al.8 evidenziano un protocollo di estrazione del DNA semplice, trattabile e ad alto rendimento di campioni di zanzara per il sequenziamento dell'intero genoma, utilizzando perle magnetiche che legano il DNA. Il protocollo include l'omogeneizzazione del campione e l'intero processo di estrazione. Questo approccio promuove un metodo di estrazione del DNA ad alto rendimento, ma altamente riproducibile, adatto a laboratori con risorse limitate. Interesserà coloro che lavorano con applicazioni di genomica delle zanzare, in particolare con preparati di DNA di zanzara sul campo.

Diversi articoli della collezione coprono i progressi metodologici legati allo studio della biologia delle zanzare. Jové et al.9 descrivono la quantificazione ad alto rendimento e basata sulla fluorescenza dei volumi dei pasti per le zanzare alimentate con dieta artificiale. Comprende la preparazione del pasto, l'aggiunta del colorante fluoresceina, la somministrazione del pasto su un sistema di alimentazione a basso costo, seguita dalla quantificazione del volume del pasto in campioni di zanzare alimentati. La metodologia descritta consente una valutazione efficace dell'alimentazione delle zanzare, con rilevanza per i saggi di alimentazione che coinvolgono diete artificiali, sangue, zucchero o nettare. Sarà prezioso per coloro che studiano il comportamento alimentare degli insetti. Tsujimoto e Adelman10 delineano una nuova tecnica per valutare la fecondità e la fertilità delle zanzare utilizzando piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti riempite di agarosio. Il protocollo descrive in dettaglio la preparazione della piastra, l'alimentazione delle zanzare, l'ovideposizione, l'imaging della piastra e l'acquisizione dei dati. Riduce il tempo, lo spazio e il lavoro rispetto alla metodologia convenzionale e interesserà i ricercatori che valutano l'idoneità delle zanzare o le basi molecolari della riproduzione delle zanzare. Lajevardi et al.11 utilizzano il saggio di Ramsay per studiare il trasporto ionico e la secrezione di liquidi nei tessuti escretori delle zanzare. Il protocollo adatta il test di Ramsay per l'uso con una piccola quantità di tessuto di insetti e discute anche la preparazione e la calibrazione degli elettrodi, la preparazione dei tessuti di zanzara per il test e la registrazione delle letture dai tubuli malpighiani e dai tessuti digestivi. Questo protocollo interesserà coloro che lavorano con i sistemi digestivi o escretori e la regolazione neuropeptidica/endocrina dei tessuti degli insetti. Wang et al.12 descrivono l'espressione eterologa dei recettori odorosi di Ae. aegypti negli ovociti di Xenopus per valutare la loro risposta agli odori umani. Copre la clonazione dei geni dei recettori degli odori, la sintesi del cRNA, la dissezione e l'isolamento degli ovociti di Xenopus , l'espressione eterologa dei geni e quindi la registrazione del singolo sensillum per misurare l'attività del recettore. Questo protocollo fornisce un sistema unico per valutare le basi genetiche e funzionali dell'olfatto delle zanzare, con potenziali applicazioni legate alla ricerca sul comportamento delle zanzare.

Quattro articoli della collezione discutono le zanzare geneticamente modificate e il processo di transgenesi. Carballar-Lejarazú et al.13 delineano procedure dettagliate per la produzione di zanzare transgeniche Anopheles gambiae tramite microiniezione embrionale, mentre Bui et al.14 dimostrano la microiniezione di embrioni di Culex quinquefasciatus per l'editing del genoma basato su CRISPR/Cas9. Il primo è un vettore chiave dei parassiti della malaria umana, mentre il secondo è un vettore chiave degli arbovirus, incluso il virus del Nilo occidentale, ed è poco studiato nel contesto della transgenesi. Questi protocolli coprono l'estrazione e il caricamento degli aghi, la preparazione e l'allineamento degli ovuli seguiti dall'iniezione, il recupero degli embrioni e lo screening per i fenotipi transgenici. Il protocollo An. gambiae descrive in dettaglio le procedure di ovideposizione e di raccolta degli ovuli e descrive visivamente le iniezioni riuscite. Il Cx. Il protocollo Quinquefasciatus delinea parametri specifici per l'estrazione dell'ago e punte per aumentare i tassi di mutagenesi. L'articolo di Meuti e Harrell15 fornisce un focus approfondito sulla transgenesi in Culex pipiens, in particolare sul processo di iniezione. Il video mostra l'intero processo di iniezione in modo molto approfondito; Descrive il riempimento e l'inserimento dell'ago, il posizionamento degli ovuli e l'iniettore, nonché le specifiche su come iniettare con successo. Fornisce istruzioni tecniche rigorose e risoluzione dei problemi sul processo di iniezione e offre suggerimenti per massimizzare il tasso di schiusa delle uova e l'idoneità larvale. Questi tre articoli interesseranno coloro che cercano di sviluppare nuove strategie di controllo dei vettori, così come coloro che studiano la genetica di Anopheles e Culex e le interazioni ospite-patogeno. Carballar-Lejarazú et al.16 descrivono il processo per l'esecuzione di prove su piccole gabbie per valutare se i sistemi di gene drive possono diffondere geni specifici in popolazioni di zanzare naïve in condizioni diverse. Il protocollo esamina i meccanismi delle prove di rilascio inondativo non-drive e delle prove di gene drive con generazioni di zanzare sovrapposte o non sovrapposte. Fornisce dettagli precisi sui rapporti di addizione wildtype-transgenico, sui processi di screening e sull'adattamento dei parametri sperimentali per includere saggi di fitness o per modellare la diffusione dell'allele gene drive. Questo protocollo andrà a beneficio dei ricercatori nel campo del controllo dei vettori che stanno sviluppando nuovi sistemi di gene drive ed esaminando l'efficacia del gene drive.

Gli ultimi tre articoli della raccolta discutono la coltura e l'esposizione agli agenti patogeni. Liu et al.17 dimostrano il protocollo per la reintroduzione dei batteri nelle zanzare adulte dopo il trattamento antibiotico, al fine di aiutare a comprendere i ruoli biologici svolti dal microbiota. Copre la coltura e l'isolamento dei batteri, il trattamento antibiotico e i saggi di alimentazione batterica. Il protocollo fornisce una buona sintesi di una procedura complessa e sfaccettata. Sarà utile per chi è interessato allo studio del microbiota delle zanzare o allo sviluppo di zanzare gnotobiotiche adulte. Grigsby et al.18 evidenziano il protocollo per l'integrazione della coltura del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nell'allevamento standard di Aedes aegypti . Descrive in dettaglio l'isolamento, l'identificazione e l'enumerazione delle spore infettive, prima della reinfezione delle zanzare e del mantenimento delle uova di zanzara infette. Fornisce consigli per la risoluzione dei problemi su come rilevare le spore e coordinare la schiusa delle zanzare con la preparazione delle spore. Questo protocollo interesserà coloro che cercano di coltivare parassiti microsporidi a scopo sperimentale e coloro che esaminano l'impatto dell'infezione da parassiti sull'immunità delle zanzare o sulla capacità vettoriale. Tripathi et al.19 descrivono in dettaglio il protocollo per la coltura dei gametociti di Plasmodium falciparum , l'esecuzione di infezioni delle zanzare Anopheles attraverso il sistema di alimentazione membrana-vetro e il conteggio di oocisti e sporozoiti. Si tratta di un protocollo essenziale per la coltura di P. falciparum , che può essere difficile da realizzare. Il protocollo sarà molto prezioso per coloro che studiano l'infezione e la trasmissione da Plasmodium nelle zanzare, per coloro che cercano di sviluppare strategie antimalariche, compresi gli strumenti di blocco della trasmissione, e per coloro che esaminano la competenza vettoriale delle popolazioni di An. gambiae , comprese le linee transgeniche e le strategie di gene drive.

La raccolta di articoli affronta molti argomenti di ricerca importanti per il futuro del controllo delle zanzare e dei patogeni trasmessi dalle zanzare. Comprendere la resistenza delle zanzare ai pesticidi è fondamentale in quanto riflette il successo degli attuali programmi di controllo; Inoltre, il rilevamento della resistenza può essere un segnale che sono necessari cambiamenti nelle strategie di controllo. Le tecnologie di ingegneria genetica, tra cui la transgenesi delle zanzare, l'editing del genoma e il gene drive, svolgeranno probabilmente un ruolo chiave nel controllo delle zanzare nel prossimo decennio e oltre grazie alla loro elevata trattabilità e adattabilità. Una migliore conoscenza della biologia delle zanzare, in particolare nei temi della genomica delle popolazioni, delle interazioni ospite-patogeno, del comportamento delle zanzare e delle basi molecolari dei principali tratti biologici, fornirà preziose informazioni che possono essere utilizzate per sviluppare nuovi strumenti di controllo. Ad esempio, l'identificazione dei geni coinvolti nell'olfatto potrebbe aiutare i ricercatori a sviluppare nuovi repellenti, mentre l'identificazione dei geni coinvolti nelle interazioni ospite-patogeno potrebbe portare allo sviluppo di zanzare transgeniche portatrici di effettori antipatogeni. Questa raccolta tocca tutti questi argomenti e, nelle mani di biologi vettori di tutto il mondo, i metodi qui descritti aiuteranno a facilitare nuove e uniche intuizioni su molti aspetti della biologia delle zanzare. Una sfida chiave per il futuro sarà quella di sfruttare le conoscenze generate in queste aree tematiche per produrre nuove strategie di controllo o per integrare o ottimizzare le strategie attuali.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa pubblicazione è stata supportata dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1026692 all'EPC.

Riferimenti

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  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

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