I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.
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Articolo metodologico
Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo bruno (BAT) è presente solo nei mammiferi e ha una funzione termogenica. Gli adipociti bruni sono caratterizzati da un citoplasma multiloculare con goccioline lipidiche multiple, un nucleo centrale, un alto contenuto mitocondriale e l'espressione della proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1). Il BAT è stato proposto come potenziale bersaglio terapeutico per l'obesità e i disturbi metabolici ad essa associati, grazie alla sua capacità di dissipare l'energia metabolica sotto forma di calore. Per studiare la funzione e la regolazione dei BAT, è indispensabile la coltura degli adipociti bruni. Il presente protocollo ottimizza l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti bruni da topi neonati. Inoltre, vengono mostrate le procedure per l'imaging di adipociti differenziati sia con immunofluorescenza confocale che con microscopia elettronica a trasmissione. Negli adipociti bruni differenziati con le tecniche qui descritte, vengono preservate le principali caratteristiche distintive della BAT classica, tra cui alti livelli di UCP1, aumento della massa mitocondriale e contatto fisico molto stretto tra le goccioline lipidiche e i mitocondri, rendendo questo metodo uno strumento prezioso per gli studi sulla BAT.
Introduzione
Il tessuto adiposo bianco e bruno differiscono per la posizione anatomica, l'origine cellulare, la funzione, la morfologia e la massa totale. Il tessuto adiposo bianco (WAT) è il principale serbatoio di energia fisiologica del corpo e immagazzina grandi quantità di triacilglicerolo (TAG) in cellule altamente specializzate che hanno una singola gocciolina lipidica gigante che occupa la maggior parte del loro volume cellulare1. La lipolisi TAG rilascia acidi grassi liberi, che entrano nella circolazione sistemica per soddisfare le richieste di energia durante il digiuno o altri stati di bilancio energetico negativo. Inoltre, il WAT secerne prodot....
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Protocollo
Le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Pontificia Universidad Católica de Chile. Per questo studio sono stati utilizzati topi neonati P0.5 di entrambi i sessi, derivati da un background misto di ceppi C57BL/6J e 129J.
1. Estrazione dei tessuti
- Pulire e disinfettare il banco di lavoro con una soluzione di etanolo al 70% e utilizzare materiale chirurgico sterile.
- Eutanasia dei cuccioli appena nati P0.5 mediante decapitazione con forbici chirurgiche seguendo il protocollo approvato istituzionalmente.
- Posiziona il mouse i....
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Risultati
L'adipogenesi è regolata da una rete di fattori di trascrizione che sono responsabili sia dell'espressione di proteine chiave che inducono la formazione e il funzionamento degli adipociti bruni22, inclusi i regolatori adipogenici classici come PPARγ e C/EBPα 23,24,25, sia i marcatori degli adipociti maturi 26,27. Attraverso l'analisi delle diverse.......
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Discussione
Il presente protocollo è una procedura di differenziamento a due fasi semplice e replicabile (Figura 2) per generare cellule con le caratteristiche molecolari e morfologiche degli adipociti bruni maturi. Il prelievo chirurgico dell'iBAT è il primo passo critico perché la lacerazione dei tessuti limita fortemente la vitalità del materiale di partenza. Anche il processamento dei tessuti è fondamentale perché una sospensione cellulare omogenea e priva di detriti aumenta notevolmente la quantità.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
I finanziamenti sono stati forniti da FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) a VC e borse di dottorato ANID 21171743 ad AMF e ANID 21150665 a FS. Ringraziamo Alejandro Munizaga per l'aiuto nell'elaborazione dei campioni e per la consulenza tecnica per la microscopia elettronica a trasmissione. Le illustrazioni sono state prodotte utilizzando BioRender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x tampone Tris/glicina | BioRad | 1610734 | |
| soluzione acquosa di paraformaldeide al 16% | Scienze di microscopia elettronica | 15710 | |
| colture cellulari stile Easy-Grip trattato TC da 35 mm Falcon | 353001 | ||
| 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX) | Calbiochem | 410957 | |
| soluzione di acrilammide/bis al 40%, 37,5:1 | Piastra a | 6 | |
| SPL Scienze della vita | - | ||
| 96 pozzetti ottici neri con coperchio coltura cellulare sterile | Thermo Scientific | 165305 | |
| AccuRuler RGB Plus Scala proteica pre-colorata | Maestrogeno | 02102-250 | |
| ACK tampone di lisi | Gibco | A10492-01 | |
| Persolfato di ammonio | BioRad | 1610700 | |
| Gibco antibiotico-antimicotico | |||
| IgG anti-topo, segnalazione cellulare anticorpale legata a HRP | 7076 | ||
| IgG anti-coniglio, anticorpo legato a HRP | Cell Signaling | 7074 | |
| Bloccante di grado blotting | BioRad | 170-6404 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| C/EBP&alfa; anticorpo | Segnalazione cellulare | 2295 | |
| CaCl2 | Calbiochem | ||
| CD36 anticorpo | Invitrogen | PA1-16813 | |
| Filtro cellulare 100 &; m, nylon | Falcon | 352360 | |
| Filtro cellulare 40 µ m, nylon | Falcon | 352340 | |
| Collagenasi tipo II | Gibco | 17101-015 | |
| Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodale | Biotek | ||
| Desametasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM/F-12, polvere | Gibco | 12500062 | |
| EMBed-812 EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon) | Microscopia elettronica Scienze | 14120 | |
| Etanolo assoluto | Merck | 100983 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Gelatina da pelle di pesce d'acqua fredda | Sigma | G7041 | |
| Glucosio | Gibco | 15023-021 | |
| Glucotaraldeide 25% Soluzione acquosa | Microscopia elettronica Scienze | 16210 | |
| Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11012 | |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi Halt 100X | Thermo Scientific | 78427 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi Halt 100X | Thermo Scientific | 78429 | |
| Hoechst 33258 | Membrana | H1398 | |
| BioRad | 1620177 | ||
| indometacina | Sigma | I7378 | |
| Insulina | Sigma | I3536 | |
| KCl | Calbiochem | ||
| KH2PO4 | Calbiochem | 529568 | |
| KHCO3 | Sigma | 60339 | |
| Tampone di riduzione del campione per marcatore di corsia | Thermo Scientific | 39000 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| MilliQ acqua sterile | - | - | |
| Mitoprofile Total OXPHOS Roditore WB anticorpo Cocktail | Abcam | MS604 | |
| NaCl | Merck | ||
| OmniPur 10x PBS Concentrato Liquido | Calbiochem | 6505-OP | |
| Tetrossido di Osmio | Scienze della microscopia elettronica | 19100 | |
| Perilipina 1 anticorpo | Segnalazione cellulare | 9349 | |
| PPARγ (81B8) anticorpo | Segnalazione cellulare | 2443 | |
| lisi tampone RIPA | Thermo Scientific | 89901 | |
| Rosiglitazone | Merck | 557366 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| Scienze di microscopia elettronica | con cacpdilato di sodio | 12300 | |
| Dodecil solfato di sodio | BioRad | 1610301 | |
| T3 | Sigma | T6397 | |
| Talos F200C G2 | Thermo Scientific | ||
| TEMED | BioRad | 1610800 | |
| TOM20 anticorpo | Segnalazione cellulare | 42406 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Segnalazione cellulare | 12498 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tween 20, Grado di Biologia Molecolare Promega | H5152 | ||
| UCP1 anticorpo | Segnalazione cellulare | 14670 | |
| Ultracut R | Leica | ||
| Scienze della microscopia elettronica | dell'acetato di uranile | 22400 | |
| Westar Sun | Cyanagen | XLS063 | |
| Westar Supernova | Cyanagen | XLS3 |
Riferimenti
- Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
- Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.
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Ristampe e permessi
