Articolo metodologico

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 febbraio 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è presente solo nei mammiferi e ha una funzione termogenica. Gli adipociti bruni sono caratterizzati da un citoplasma multiloculare con goccioline lipidiche multiple, un nucleo centrale, un alto contenuto mitocondriale e l'espressione della proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1). Il BAT è stato proposto come potenziale bersaglio terapeutico per l'obesità e i disturbi metabolici ad essa associati, grazie alla sua capacità di dissipare l'energia metabolica sotto forma di calore. Per studiare la funzione e la regolazione dei BAT, è indispensabile la coltura degli adipociti bruni. Il presente protocollo ottimizza l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti bruni da topi neonati. Inoltre, vengono mostrate le procedure per l'imaging di adipociti differenziati sia con immunofluorescenza confocale che con microscopia elettronica a trasmissione. Negli adipociti bruni differenziati con le tecniche qui descritte, vengono preservate le principali caratteristiche distintive della BAT classica, tra cui alti livelli di UCP1, aumento della massa mitocondriale e contatto fisico molto stretto tra le goccioline lipidiche e i mitocondri, rendendo questo metodo uno strumento prezioso per gli studi sulla BAT.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto adiposo bianco e bruno differiscono per la posizione anatomica, l'origine cellulare, la funzione, la morfologia e la massa totale. Il tessuto adiposo bianco (WAT) è il principale serbatoio di energia fisiologica del corpo e immagazzina grandi quantità di triacilglicerolo (TAG) in cellule altamente specializzate che hanno una singola gocciolina lipidica gigante che occupa la maggior parte del loro volume cellulare1. La lipolisi TAG rilascia acidi grassi liberi, che entrano nella circolazione sistemica per soddisfare le richieste di energia durante il digiuno o altri stati di bilancio energetico negativo. Inoltre, il WAT secerne prodotti proteici e lipidici, chiamati rispettivamente adipochine e lipochine, che hanno funzioni metaboliche, immunitarie e regolatorie riproduttive, rendendo così il WAT il più grande tessuto endocrino del corpo2.

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un organo molto più piccolo la cui principale funzione fisiologica è la termogenesi non tremante per prevenire l'ipotermia. Nei topi e negli esseri umani appena nati, il BAT è un organo ben definito situato nello spazio interscapolare. Gli esseri umani adulti mancano di BAT interscapolare (iBAT); ciononostante, sviluppano gruppi di cellule brune simili agli adipociti integrati in depositi che altrimenti comprendono principalmente WAT. Questi adipociti "bruno-in-bianco" (brite) condividono caratteristiche morfologiche e molecolari con i classici adipociti iBAT, ma hanno un'origine cellulare diversa 3,4.

A differenza degli adipociti bianchi, gli adipociti bruni hanno più piccole goccioline lipidiche e abbondanti mitocondri5. La proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1, nota anche come termogenina) è espressa in modo univoco dagli adipociti bruni e brite e media la perdita di protoni nella membrana mitocondriale interna (IMM), disaccoppiando così il trasporto di elettroni dalla sintesi di ATP e generando calore. La termogenesi non da brividi nel BAT è attivata dalla noradrenalina (NE), che viene rilasciata dai terminali simpatici nel BAT in risposta alla stimolazione del freddo6. NE si lega ai beta-adrenergici (per lo più beta 3) sulla superficie degli adipociti bruni e innesca una cascata di segnalazione intracellulare mediata da cAMP. Ciò si traduce in lipolisi TAG, beta-ossidazione degli acidi grassi mitocondriali e generazione di calore dopo l'attivazione diUCP1 3. La stretta relazione funzionale tra goccioline lipidiche e mitocondri negli adipociti bruni ha parallelismi strutturali, come l'interazione tra questi organelli in aree che sono grandi e hanno un contatto fisico molto stretto 7,8.

iBAT ha abbondanti vasi sanguigni e terminali simpatici9. Queste strutture, insieme ai preadipociti, alle cellule immunitarie, ai fibroblasti e alle molecole della matrice extracellulare, compongono la frazione vascolare stromale adiposa (SVF)10. È stato riportato che molti protocolli generano adipociti maturi dai preadipociti 11,12,13,14,15 (Tabella supplementare 1); Tuttavia, mostrano variazioni estreme nel trattamento dei tessuti e nella composizione dei terreni di coltura differenziata. Il protocollo qui descritto consente la differenziazione efficiente e riproducibile di adipociti bruni che (1) esprimono i fattori chiave di trascrizione adipogenica del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi gamma (PPARγ) e la proteina alfa legante CCAAT/enhancer (C/EBPα), (2) esprimono i marcatori adipocitari maturi perilipina1 (PLIN1) e cluster determinant 36 (CD36), (3) accumulano abbondanti goccioline lipidiche, (4) hanno un'elevata massa mitocondriale e un'elevata abbondanza di complessi OXPHOS, (5) hanno un potenziale termogenico, come determinato da alti livelli di UCP1, e (6) hanno cambiamenti morfologici mitocondriali associati al fenotipo degli adipociti bruni maturi. Questa metodologia è utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della lipodistrofia generalizzata 15,16,17.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Pontificia Universidad Católica de Chile. Per questo studio sono stati utilizzati topi neonati P0.5 di entrambi i sessi, derivati da un background misto di ceppi C57BL/6J e 129J.

1. Estrazione dei tessuti

  1. Pulire e disinfettare il banco di lavoro con una soluzione di etanolo al 70% e utilizzare materiale chirurgico sterile.
  2. Eutanasia dei cuccioli appena nati P0.5 mediante decapitazione con forbici chirurgiche seguendo il protocollo approvato istituzionalmente.
  3. Posiziona il mouse in posizione prona (rivolto verso il basso) e pratica un'incisione lunga 1 cm nella pelle a metà della schiena dell'animale usando forbici affilate. Rimuovere la pelle con cura.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale perché se la pelle non viene rimossa correttamente, potrebbe strappare e danneggiare l'iBAT e precludere la preparazione ottimale della SVF.
  4. Staccare chirurgicamente l'iBAT dalla carcassa utilizzando piccole forbici.
    NOTA: L'iBAT è visualizzato come due lobuli grassi che possono essere rimossi in modo indipendente.
  5. Raccogli entrambi i lobi iBAT utilizzando una pinza a punta curva per rimuovere i lobi in modo indipendente.
  6. Mettere i due lobi in una provetta di plastica con 1,5 mL di PBS sterile a temperatura ambiente. Mantenere i tessuti nelle loro singole provette fino al completamento dell'estrazione dei tessuti per tutti i cuccioli necessari.

2. Digestione dei tessuti

  1. Aliquotare 300 μL di tampone per la digestione della collagenasi di tipo II (0,2% di collagenasi di tipo II in tampone [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM di glucosio, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA e 1% di penicillina/streptomicina, a pH 7,4]) (Tabella 1) in provette da 1,5 mL in una cabina di biosicurezza.
    NOTA: Preparare un numero sufficiente di provette per il numero di singoli tessuti da estrarre. Nel presente studio sono state utilizzate sette protuberanze, corrispondenti a una cucciolata di sette cuccioli.
  2. Spostarsi sul banco e posizionare i lobi iBAT nel tampone di digestione della collagenasi di tipo II per degradare la matrice extracellulare.
  3. Incubare i tessuti iBAT per 45 minuti a 37 °C con agitazione delicata continua a 800 giri/min (Figura 1).

3. Lavorazione dei tessuti

NOTA: Dopo la digestione, eseguire tutti i seguenti passaggi in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare di classe II.

  1. Preparare ed etichettare due set di provette di plastica da 1,5 mL per ogni singolo campione.
  2. Interrompere meccanicamente la sospensione tissutale nel tampone di digestione collagenasi di tipo II pipettando su e giù utilizzando una micropipetta P1.000 e puntali filtrati. Utilizzare una nuova punta per ogni campione.
    NOTA: Questo è un passaggio critico. Assicurarsi di disaggregare meccanicamente il tessuto con la punta e la pipetta verso l'alto e verso il basso fino al completamento dell'omogeneizzazione macroscopica.
  3. Far passare i tessuti disaggregati attraverso singoli filtri cellulari da 100 μm (vedere la Tabella dei materiali) in nuove provette da 1,5 mL.
  4. Aggiungere 500 μl di tampone ACK (vedere la Tabella dei materiali) ai campioni di tessuto filtrato, capovolgere le provette 4-5 volte e incubare a temperatura ambiente per 4 minuti.
    NOTA: Non superare il tempo di incubazione, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule di interesse.
  5. Centrifugare i campioni di tessuto a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura (DMEM-F12 con 10% FBS, 1% di antibiotico antimicotico, pH 7,2) (vedere la Tabella dei materiali).
  7. Passare le sospensioni attraverso un filtro cellulare da 40 μm in nuove provette da 1,5 mL utilizzando una micropipetta P1.000 e puntali filtrati.
  8. Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Il pellet corrisponde alla SVF contenente preadipociti.
  9. Eliminare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura mediante pipettaggio.
  10. Preparare una provetta da 15 mL per ogni campione aggiungendo 5 mL di terreno di coltura.
  11. Aggiungere ogni pellet risospeso alla provetta da 15 mL corrispondente contenente 5 mL di terreno di coltura. Capovolgere la provetta 4-5 volte per mescolare il contenuto della cellula.
  12. Seminare ogni campione in sei pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di sospensione a ciascun pozzetto (Figura 1).

4. Coltura della frazione vascolare stromale (SVF)

  1. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%.
    NOTA: Durante questo periodo, le cellule aderenti non plastiche vengono rimosse, ottenendo una coltura primaria arricchita con una SVF contenente preadipociti.
  2. Quando le cellule diventano confluenti al 100%, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con 800 μl di PBS sterile.
  3. Aggiungere 150 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% (vedere la Tabella dei materiali) a ogni pozzetto e posizionare la piastra di coltura per 3 minuti nell'incubatore per il distacco delle cellule.
    NOTA: Verificare che le cellule siano staccate utilizzando un microscopio ottico a contrasto di fase.
  4. Inattivare la tripsina aggiungendo 850 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto.
  5. Raccogliere le cellule dai sei pozzetti seminati al punto 3.12 e trasferirle in una provetta da 15 mL.
  6. Portare il volume totale a 12 mL aggiungendo 6 mL di terreno di coltura. Capovolgere il tubo 4-5 volte per mescolare il contenuto.
  7. Seminare 1 mL del campione in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza.
  8. Quando le cellule diventano confluenti al 100%, staccarle con 150 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% seguendo le stesse condizioni di incubazione del passaggio 4.3 e seminarle in base alla superficie del pozzetto richiesta per l'esperimento.
  9. Eseguire l'imaging ad alta risoluzione dopo aver fissato le cellule seguendo il passaggio 8.
    NOTA: Si raccomanda una densità di 35.000 cellule/cm² per ulteriori esperimenti (estrazione di proteine e RNA totale, 330.000 cellule [un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti]; immunofluorescenza [IF], 10.500 cellule [un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti]).

5. Differenziazione adipogenica

  1. Incubare le cellule con terreno di induzione (DMEM-F12 con FBS al 10%, antimicotico antibiotico all'1%, pH 7,2, integrato con 500 nM di desametasone, 125 nM di indometacina, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 5 μM di rosiglitazone, 1 nM T3 e 20 nM di insulina) (Tabella 1) per 72 ore (dal giorno 0 al giorno 2) (Figura 2).
    NOTA: Il terreno di coltura deve essere cambiato a giorni alterni; Pertanto, il primo cambiamento del mezzo deve avvenire il giorno 2 dopo l'induzione iniziale.
  2. Passare al terreno di mantenimento (DMEM-F12 con FBS al 10%, antimicotico antibiotico all'1%, pH 7,2, integrato con rosiglitazone 5 μM, T3 1 nM e insulina 20 nM) (Tabella 1) al giorno 3 e mantenere questo terreno di mantenimento fino al giorno 7 (Figura 2).
    NOTA: Il mezzo di manutenzione deve essere sostituito il giorno 5 e il giorno 7. Piccole goccioline lipidiche possono essere visualizzate mediante microscopia a contrasto di fase dal 3° giorno di differenziazione. Grandi goccioline lipidiche sono evidenti al 7° giorno di differenziazione. Le procedure di differenziazione più lunghe di 7 giorni provocano la perdita di cellule per distacco, probabilmente a causa dell'elevata galleggiabilità delle cellule cariche di lipidi.

6. Preparazione dell'omogeneizzato cellulare

  1. Rimuovere il terreno di coltura al giorno 0 e al giorno 7 di differenziazione e lavare le cellule 3 volte con PBS sterile.
  2. Dopo l'ultima pulizia, aggiungere 1,3 ml di PBS sterile a ciascun pozzetto.
    NOTA: Mantenere le celle nel ghiaccio fino alla pulizia dell'ultima piastra.
  3. Raccogliere meccanicamente le cellule da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (~330.000 cellule) con un raschietto cellulare e mettere la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL.
  4. Centrifugare i campioni a 2.800 x g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere il PBS con una micropipetta e mantenere le provette sul ghiaccio.
  6. Risospendere il pellet cellulare nel tampone RIPA con inibitori della proteasi e della fosfatasi (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 30 minuti su ghiaccio.
    NOTA: Per lisare il pellet cellulare sono sufficienti 70-80 μL.
  7. Centrifugare i campioni a 21.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  8. Rimuovere con cautela il surnatante in una provetta da 1,5 ml ed eliminare il pellet.
    NOTA: Il surnatante rappresenta l'omogeneizzato cellulare.
  9. Determinare la concentrazione proteica dell'omogenato cellulare utilizzando l'acido bicinconninico (BCA) per la rilevazione colorimetrica e la quantificazione della proteinatotale 18,19.

7. Western blotting

  1. Preparare 30 μg di omogeneizzato cellulare (dal passaggio 6.8) e aggiungere il tampone di caricamento del campione SDS-PAGE disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Risolvere in gel di poliacrilammide elettroforesi-SDS20 (PAGE-SDS) in base al peso molecolare di ogni proteina.
    NOTA: Utilizzare il 10% di PAGE-SDS per PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 e UCP1, il 12% di PAGE-SDS per OXPHOS e il 15% di PAGE-SDS per TOM20 (vedere la Tabella dei materiali).
  3. Elettrotrasferire le proteine sulla membrana in PVDF (vedi Tabella dei Materiali) a 350 mA per 2 h.
    NOTA: Il contenitore del ghiaccio deve essere sostituito dopo 1 ora. Durante l'intero processo, mantenere la camera sul ghiaccio.
  4. Bloccare le membrane con BSA al 5% o latte scremato in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) per 2 ore seguendo le raccomandazioni delle schede tecniche degli anticorpi.
  5. Incubare con gli anticorpi primari (gli anticorpi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
    NOTA: Tutti gli anticorpi utilizzati in questo studio sono stati diluiti a 1:1.000 in soluzione bloccante.
  6. Lavare le membrane 3 volte con TBS-T allo 0,1% e incubarle con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (vedere la Tabella dei materiali) per 2 ore a temperatura ambiente.
  7. Lavare le membrane 3 volte con lo 0,1%. TBS-T. Eseguire un ultimo lavaggio con 1x TBS. Conservare le membrane in 1x TBS fino alla visualizzazione. Si consiglia di conservare per un massimo di 1 ora.
  8. Visualizzare le membrane mediante chemiluminescenza20 o qualsiasi altro metodo preferito.

8. Imaging ad alta risoluzione

  1. Eseguire il test di immunofluorescenza seguendo i passaggi seguenti.
    1. Seminare e differenziare le colture primarie di preadipociti bruni da topi neonati P0.5 (seguendo il passaggio 4.8) in piastre a 96 pozzetti con fondo ottico (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Fissare le cellule al giorno 0 e al giorno 7 di differenziazione con PFA al 4% per 20 minuti e lavare 3 volte con PBS sterile.
    3. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti e bloccarle con gelatina di pesce al 3% (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Lavare 3 volte con PBS sterile e incubare con anticorpo PLIN1 (1:400, vedere la Tabella dei materiali) in BSA/PBS all'1% per una notte a 4 °C in una camera umida.
    5. Lavare 3 volte con PBS sterile e incubare con anticorpo secondario coniugato con fluorofori a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente.
    6. Colorare i nuclei con 1 μg/mL di Hoechst 33342 e le goccioline lipidiche con 1 μg/mL di BODIPY per 30 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Le immagini a fluorescenza sono state acquisite utilizzando un sistema di imaging cellulare (vedere la Tabella dei Materiali). Complessivamente, sono state acquisite 9 o 16 foto per pozzetto con due o tre canali con un ingrandimento di 20x.
  2. Eseguire la microscopia elettronica a trasmissione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Coltiva e differenzia i preadipociti marroni in piastre di coltura cellulare da 35 mm x 10 mm.
    2. Il giorno 0 e il giorno 7 di differenziazione, rimuovere il terreno e fissare le cellule per 1 ora con glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M, pH 7,0 (vedere la Tabella dei materiali).
    3. Lavare le cellule 3 volte con tampone di cacodilato di sodio 0,05 M per 10 minuti e trattarle con tetrossido di osmio acquoso all'1% (vedere la Tabella dei materiali) per 15 minuti.
    4. Lavare le cellule 3 volte con acqua bidistillata per 5 minuti e trattarle con acetato acquoso di uranile all'1% (vedere la Tabella dei materiali) per 15 minuti.
    5. Disidratare le cellule con un gradiente di etanolo del 30%, 50%, 70%, 95% e 100% per 5 minuti ogni volta.
    6. Pre-incorporare le celle in epon/etanolo 1:1 per 30 minuti e poi in epon per 1 ora (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: L'inclusione delle cellule viene eseguita direttamente nel piatto aggiungendo epon fresco per coprire l'intero monostrato di coltura cellulare. Lasciare polimerizzare l'epon in forno a 60 °C per 24 h.
    7. Immergere la piastra di coltura cellulare in azoto liquido per 2 minuti, quindi fratturarla usando una pinza per allentare l'inclusione plastica.
    8. Incollare i segmenti di inclusione con le celle a un blocco di resina per ottenere tagli fini (80 nm) paralleli alla superficie in un ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali).
    9. Colorare i tagli con acetato acquoso di uranile all'1% per 4 minuti e citrato di piombo per 5 minuti, secondo Reynolds et al.21.
    10. Visualizzare le griglie in un microscopio elettronico (vedere la Tabella dei materiali).

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Risultati

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L'adipogenesi è regolata da una rete di fattori di trascrizione che sono responsabili sia dell'espressione di proteine chiave che inducono la formazione e il funzionamento degli adipociti bruni22, inclusi i regolatori adipogenici classici come PPARγ e C/EBPα 23,24,25, sia i marcatori degli adipociti maturi 26,27. Attraverso l'analisi delle diverse...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo è una procedura di differenziamento a due fasi semplice e replicabile (Figura 2) per generare cellule con le caratteristiche molecolari e morfologiche degli adipociti bruni maturi. Il prelievo chirurgico dell'iBAT è il primo passo critico perché la lacerazione dei tessuti limita fortemente la vitalità del materiale di partenza. Anche il processamento dei tessuti è fondamentale perché una sospensione cellulare omogenea e priva di detriti aumenta notevolmente la quantità...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I finanziamenti sono stati forniti da FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) a VC e borse di dottorato ANID 21171743 ad AMF e ANID 21150665 a FS. Ringraziamo Alejandro Munizaga per l'aiuto nell'elaborazione dei campioni e per la consulenza tecnica per la microscopia elettronica a trasmissione. Le illustrazioni sono state prodotte utilizzando BioRender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x tampone Tris/glicinaBioRad1610734
soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%Scienze di microscopia elettronica15710
colture cellulari stile Easy-Grip trattato TC da 35 mm Falcon353001
3-isobutile-1-metilxantina (IBMX)Calbiochem410957
soluzione di acrilammide/bis al 40%, 37,5:1Piastra a6
SPL Scienze della vita -
96 pozzetti ottici neri con coperchio coltura cellulare sterileThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Scala proteica pre-colorata Maestrogeno02102-250
ACK tampone di lisi GibcoA10492-01
Persolfato di ammonio BioRad1610700
Gibco antibiotico-antimicotico 
IgG anti-topo, segnalazione cellulare anticorpale legata a HRP7076
IgG anti-coniglio, anticorpo legato a HRP   Cell Signaling7074
Bloccante di grado blotting BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBP&alfa; anticorpoSegnalazione cellulare2295
CaCl2Calbiochem 
CD36 anticorpoInvitrogenPA1-16813
Filtro cellulare 100 &; m, nylonFalcon352360
Filtro cellulare 40 µ m, nylonFalcon352340
Collagenasi tipo IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodaleBiotek
Desametasone SigmaD4902
DMEM/F-12, polvereGibco12500062
EMBed-812 EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Microscopia elettronica Scienze14120
Etanolo assolutoMerck 100983 
Siero fetale bovino Gibco16000-044
Gelatina da pelle di pesce d'acqua freddaSigmaG7041
GlucosioGibco 15023-021
Glucotaraldeide 25% Soluzione acquosaMicroscopia elettronica Scienze16210
Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Cocktail di inibitori della fosfatasi Halt 100X Thermo Scientific78427
Cocktail di inibitori della proteasi Halt 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258MembranaH1398
BioRad1620177
indometacina Sigma I7378 
Insulina SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Tampone di riduzione del campione per marcatore di corsia Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ acqua sterile --
Mitoprofile Total OXPHOS Roditore WB anticorpo CocktailAbcamMS604
NaClMerck
OmniPur  10x PBS Concentrato LiquidoCalbiochem6505-OP
Tetrossido di Osmio Scienze della microscopia elettronica19100
Perilipina 1 anticorpoSegnalazione cellulare9349
PPARγ (81B8) anticorpoSegnalazione cellulare2443
lisi tampone RIPA Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Bicarbonato di sodio SigmaS5761
Scienze di microscopia elettronicacon cacpdilato di sodio12300
Dodecil solfato di sodio BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 anticorpoSegnalazione cellulare42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Segnalazione cellulare12498
Triton X-100 Sigma93443
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Grado di Biologia Molecolare Promega H5152
UCP1 anticorpoSegnalazione cellulare14670
Ultracut RLeica 
Scienze della microscopia elettronicadell'acetato di uranile22400
Westar SunCyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3
piatto per pozzetti BioRad 1610148 15240062208291 PVDF Immun-Blot 5295521064041000

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
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