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Articolo metodologico

Bypass duodeno-ileale a singola anastomosi con modello di gastrectomia a manica nei topi

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DOI:

10.3791/64610

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10 febbraio 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CHU Nantes, CNRS, INSERM, l'institut du thorax, Nantes Université, 2Chirurgie Cancérologique, Digestive et Endocrinienne, Institut des Maladies de l'Appareil Digestif, Hôtel Dieu, CHU Nantes

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il bypass duodeno-ileale a singola anastomosi (SADI-S) è una procedura bariatrica emergente con importanti effetti metabolici. In questo articolo, presentiamo un modello affidabile e riproducibile di SADI-S nei topi.

Abstract

L'obesità è un grave problema di salute in tutto il mondo. Come risposta, sono emersi interventi chirurgici bariatrici per trattare l'obesità e le sue comorbidità correlate (ad esempio, diabete mellito, dislipidemia, steatoepatite non alcolica, eventi cardiovascolari e tumori) attraverso meccanismi restrittivi e malassorbitivi. Comprendere i meccanismi con cui queste procedure consentono tali miglioramenti spesso richiede la loro trasposizione negli animali, specialmente nei topi, a causa della facilità di generare animali geneticamente modificati. Recentemente, il bypass duodeno-ileale a anastomosi singola con gastrectomia a manica (SADI-S) è emerso come una procedura che utilizza sia effetti restrittivi che malassorbitivi, che viene utilizzata come alternativa al bypass gastrico in caso di obesità maggiore. Finora, questa procedura è stata associata a forti miglioramenti metabolici, che hanno portato ad un marcato aumento del suo utilizzo nella pratica clinica quotidiana. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi effetti metabolici sono stati scarsamente studiati a causa della mancanza di modelli animali. In questo articolo, presentiamo un modello affidabile e riproducibile di SADI-S nei topi, con particolare attenzione alla gestione perioperatoria. La descrizione e l'uso di questo nuovo modello di roditori sarà utile alla comunità scientifica per comprendere meglio i cambiamenti molecolari, metabolici e strutturali indotti dal SADI-S e per definire meglio le indicazioni chirurgiche per la pratica clinica.

Introduzione

L'obesità è una situazione emergente ed endemica con prevalenza crescente, che colpisce circa 1 adulto su 20 in tutto il mondo1. La chirurgia bariatrica è diventata l'opzione di trattamento più efficace per gli adulti affetti negli ultimi anni, migliorando sia la perdita di peso che i disturbi metabolici2,3, con risultati variabili a seconda del tipo di procedura chirurgica utilizzata.

Ci sono due meccanismi principali che sono implicati negli effetti delle procedure bariatriche: restrizione che mira ad aumentare la sazietà (come nella gastrectomia della manica (SG) dove viene rimosso l'80% dello stomaco) e malassorbimento. Tra le procedure che implicano sia la restrizione che il malassorbimento, è stato proposto il bypass duodeno-ileale a anastomosi singola con gastrectomia a manica (SADI-S) come alternativa al bypass gastrico Roux-en-Y (RYGB), in cui si osserva un recupero di peso in circa il 20% dei pazienti 4,5. In questa tecnica, una gastrectomia a manica è associata a un riarrangiamento dell'intestino tenue, dividendolo in una biliare e un arto comune corto (un terzo della lunghezza totale dell'intestino tenue) (Figura 1A). Tecnicamente, il SADI-S ha il vantaggio rispetto al RYGB di richiedere una sola anastomosi, riducendo il tempo di funzionamento di circa il 30%. Inoltre, questo metodo preserva il piloro, che aiuta a ridurre il rischio di ulcera peptica e limita la perdita anastomotica. Il SADI-S è inoltre associato ad un alto tasso di miglioramento metabolico, favorendone fortemente l'utilizzo negli ultimi anni 6,7.

Poiché gli effetti metabolici sono diventati sempre più fondamentali per le procedure bariatriche, chiarire i loro meccanismi sembra cruciale. Pertanto, l'uso di modelli animali per le procedure bariatriche è della massima importanza per comprendere meglio i loro effetti metabolici e le vie cellulari e molecolari coinvolte8. Questi modelli hanno contribuito, ad esempio, a una migliore comprensione della variazione dell'assunzione di cibo dopo SG o RYGB in un ambiente controllato9 e allo studio dei flussi di glucosio o colesterolo attraverso la barriera intestinale10,11; Queste informazioni sono raramente disponibili negli studi clinici. Questa conoscenza potrebbe aiutare a definire le loro indicazioni chirurgiche ottimali. Abbiamo precedentemente descritto modelli murini di SG e RYGB12. Tuttavia, nonostante i suoi risultati promettenti nella pratica clinica, il SADI-S è stato sviluppato e descritto solo nei ratti13,14,15. Tuttavia, data la sua malleabilità genetica, il modello murino è stato utile in passato per studiare i vari effetti metabolici di tali procedure16,17,18, e un modello murino SADI-S potrebbe essere utile per valutare gli effetti di SADI-S nonostante la difficoltà tecnica.

In questo articolo, descriviamo l'adattamento della procedura SADI-S nei topi (Figura 1B) in modo riproducibile. Particolare attenzione è data alla descrizione delle cure perioperatorie.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal locale comitato etico francese per la sperimentazione animale (Comité d'éthique en expérimentation animale; riferimento CEEA-PdL n 06).

1. Preparazione preoperatoria

  1. Aggiungere il cibo dietetico gel alla dieta normale 3 giorni prima dell'intervento. Velocizzare i topi 6 ore prima dell'intervento.
  2. Indurre l'anestesia con isoflurano al 5% (1 L/min) in una camera dedicata con ossigeno (1 L/min). Iniettare i topi per via sottocutanea con buprenorfina (0,1 mg/kg), amoxicillina (15 mg/kg), metoclopramide (1 mg/kg), meloxicam (1 mg/kg) e ferro (0,5 mg/kg).
  3. Rasare le prime 2/3 parti dell'addome del topo iniziando dal processo xifoideo utilizzando un rasoio elettrico. Disinfettare l'addome del topo in due passaggi utilizzando una soluzione di polividone di iodio.
  4. Posizionare il mouse supino su un termoforo dedicato coperto da un sottoscocca pulito. Mantenere l'anestesia utilizzando un cono nasale con isoflurano al 2% -2,5% (0,4 L / min) con ossigeno (0,4 L / min). Utilizzare un test di pizzicamento del piede per confermare la profondità dell'anestetizzazione.
  5. Coprire il mouse in un involucro di plastica sterilizzato. Per applicare l'iperestensione sull'addome del topo, fissare la zampa inferiore e utilizzare una siringa da 1 mL o equivalente posizionata dietro la schiena del mouse. Tagliare un'apertura in un impacco sterile con le dimensioni dell'incisione futura e usarlo come campo operativo per coprire il mouse. L'installazione generale è illustrata nella Figura 2A.
  6. Prima dell'intervento chirurgico, utilizzare una maschera facciale, una cuffia da scrub e guanti sterilizzati. Utilizzare strumenti sterilizzati per l'intervento chirurgico.

2. Il protocollo SADI-S

  1. Laparotomia mediana
    1. Sotto un microscopio binoculare (ingrandimento 8x), eseguire una laparotomia mediana con forbici o bisturi aprendo la pelle addominale dal processo xifoideo al centro dell'addome. Assicurarsi che il processo xifoideo e lo strato muscoloaponeurotico siano visibili (Figura 2B).
      NOTA: Somministrare bupivacaina (3 mg/kg) per via sottocutanea nel sito chirurgico 5 minuti prima di effettuare l'incisione cutanea.
    2. Aprire la parete addominale lungo la linea alba con le forbici tra i muscoli addominali. Fare attenzione a non entrare nella cavità toracica (Figura 2C).
  2. Esclusione duodenale
    1. Mobilitare delicatamente il duodeno dalla cavità addominale usando un batuffolo di cotone inumidito per vedere i suoi lati anteriore e posteriore. Localizzare il dotto biliare principale, che è immediatamente visibile al microscopio binoculare sul lato posteriore dell'omento minore e del duodeno (Figura 3A, frecce nere).
    2. Prossimalmente dal dotto biliare principale, visualizzare un'area tra le arterie duodenali al microscopio binoculare (Figura 3A, B, cerchi tratteggiati blu). Penetrare in quest'area usando una pinza micro curva da un lato all'altro del duodeno ed eseguire una legatura duodenale tra le arterie usando una sutura 6-0 non assorbibile (Figura 3C-E). Fare attenzione a non ligare i rami delle arterie duodenali.
  3. Gastrectomia a manica
    1. Mobilitare lo stomaco dalla cavità addominale usando un batuffolo di cotone inumidito e un morsetto non traumatico. Separare lo stomaco dagli organi circostanti usando micro forbici: separare l'omento maggiore, tagliare le arterie gastriche corte (ramo dell'arteria splenica) tra lo stomaco e la milza e il lipoma che collega lo stomaco alla parte inferiore dell'esofago (Figura 4A,B).
    2. Utilizzando micro forbici, eseguire una gastrotomia di 5 mm aprendo il fondo e rimuovere il cibo residuo utilizzando un batuffolo di cotone (Figura 4C, freccia). Risciacquare il sito di gastrotomia con soluzione salina sterile (37 °C) per evitare la contaminazione dal contenuto gastrico rimosso.
    3. Applicare clip chirurgiche (dimensioni medie, 5,6 mm) lungo la maggiore curvatura dello stomaco per escludere circa l'80% dello stomaco. Due clip sono sufficienti. Rimuovere lo stomaco escluso tagliandolo con micro forbici (Figura 4D-G).
    4. Ancorare le clip chirurgiche per accertare l'impermeabilità eseguendo una sutura corrente (8-0) dall'inizio alla fine della resezione dello stomaco (Figura 4H).
  4. Anastomosi duodeno-ileale
    1. Sotto il microscopio binoculare, visualizzare l'ultimo anello ileale, che si trova appena prima del cieco (Figura 5A). Mobilitare delicatamente l'intestino tenue all'esterno della cavità addominale dall'ultima ansa ileale. Disporre l'intestino tenue, come mostrato nella Figura 5B, in modo che l'ultimo anello ileale si trovi sul lato sinistro. Utilizzando un cordone di sutura di dimensioni precedenti, misurare 10 cm (circa 1/3 della lunghezza totale dell'intestino tenue) dall'ultima ansa ileale; Questo sarà il sito della futura anastomosi.
    2. Al fine di garantire che il futuro arto biliare arrivi al sito di anastomosi dal suo lato sinistro, fare un grande anello dell'intestino tenue attorno al sito della futura anastomosi. Utilizzando micro forbici, eseguire un'enterotomia di 4 mm aprendo l'intestino tenue a questo punto (Figura 5C-E). Risciacquare il sito di enterotomia con soluzione salina sterile (37 °C) per evitare contaminazioni.
    3. Eseguire un'enterotomia di 4 mm sulla parte esclusa del duodeno, immediatamente dopo il piloro, tra lo stomaco e la legatura eseguita al punto 2.2.2 (Figura 5F). Posizionare un impacco di collagene emostatico assorbibile da 5 mm x 5 mm per favorire l'omeostasi.
    4. Utilizzando un 8-0 non assorbibile sutura, eseguire un'anastomosi duodeno-ileale side-to-side-atale. Inizia con l'anastomosi laterale posteriore, seguita dall'anastomosi laterale anteriore (Figura 5G-I).
  5. Chiusura addominale
    1. Mostra l'intestino tenue nella cavità addominale in modo che l'arto biliare arrivi all'anastomosi dal lato superiore sinistro dell'addome e l'arto comune cada nella parte inferiore dell'addome.
      NOTA: Lavare l'addome tre volte con circa 5 ml di soluzione salina sterile allo 0,9% (37 °C). Quindi, aspirare il fluido dall'addome per rimuovere il liquido gastrointestinale residuo e il cibo digerito per evitare infezioni batteriche e successive infiammazioni addominali.
    2. Reidratare il topo con 500 μL di soluzione salina a 37 °C applicandolo direttamente nella cavità addominale utilizzando una siringa da 1 ml.
    3. Chiudere lo strato muscoloaponeurotico utilizzando una singola sutura da corsa 6-0 non assorbibile. Chiudere la pelle addominale usando 6-0 punti di sutura separati non assorbibili (Figura 5J,K).

3. Assistenza postoperatoria generale

  1. Dopo aver fermato l'isoflurano, lasciare che il topo si svegli sul termoforo sotto 0,4 L/min O2 insufflato con la maschera nasale. Quando è completamente risvegliato, che può essere garantito dal completo recupero motorio, mettere il topo da solo in una gabbia in un'incubatrice a 30 °C. Lasciare il mouse nell'incubatore a 30 °C per 5 giorni (nessuna condizione specifica per gas o umidità).
    NOTA: La gabbia deve essere riscaldata in anticipo.
  2. Consentire il libero accesso all'acqua immediatamente dopo l'intervento chirurgico. Aggiungere integratori vitaminici, tra cui vitamine B1, B9, B12 e vitamine liposolubili (A, D, E, K), all'acqua (800 mg / 180 ml di acqua) fino alla fine del protocollo.
  3. Mantenere l'analgesia mediante iniezioni sottocutanee di buprenorfina (0,1 mg/kg) due volte al giorno dal giorno 1 al giorno 3, una volta al giorno dopo fino al giorno 5. Continuare le iniezioni sottocutanee di amoxicillina (15 mg/kg), meloxicam (1 mg/kg) e metoclopramide (1 mg/kg) una volta al giorno fino al giorno 3. Fornire iniezioni sottocutanee di ferro (0,5 mg / kg) una volta al giorno fino alla fine del protocollo.

4. Misure generali ed eutanasia

  1. Pesare i topi ogni giorno fino al giorno 5 postoperatorio. Quindi pesare il giorno 7 e poi settimanalmente.
  2. Per misurare l'assunzione giornaliera di cibo, posizionare un topo per gabbia. Posizionare un peso noto di una dieta solida e misurare il peso della dieta solida rimanente dopo 24 ore. Misurare l'assunzione di cibo il giorno 3, 4, 5, 7 e poi settimanalmente.
  3. Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale in anestesia generale (isoflurano al 5% (1 L/min) con ossigeno (1 L/min)) con iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg/kg) dopo incisione cardiaca dell'atrio sinistro per prelievo di sangue (da 500 a 600 μL di sangue).
  4. Misurare la concentrazione di emoglobina nel sangue utilizzando un analizzatore ematologico automatico che richiede 20 μL di sangue.

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Risultati

Curva di apprendimento
La curva di apprendimento per questo modello è illustrata nella Figura 6. Si osserva una progressiva diminuzione del tempo operatorio, raggiungendo circa 60 minuti di intervento chirurgico dopo 4 settimane di allenamento intensivo (Figura 6A). Anche la sopravvivenza postoperatoria a 5 giorni è migliorata con il tempo, raggiungendo il 77% durante la pratica regolare (Figura 6B). Le cause più...

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Discussione

Gli interventi bariatrici, le cui tecniche sono in continua evoluzione, sembrano essere attualmente il trattamento più efficace per l'obesità e le comorbidità metaboliche associate 3,19,20. La procedura SADI-S, descritta per la prima volta nel 20074, è una procedura promettente associata a maggiori effetti metabolici rispetto ad altri interventi chirurgici di malassorbimento. I modelli animali, in partico...

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Dichiarazioni

Claire Blanchard è stata pagata da Medtronic per fornire corsi di immersione clinica.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ethicon (Johnson and Johnson surgical technologies) per aver gentilmente fornito il cordone di sutura e le clip chirurgiche. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NExT Talent Project, Université de Nantes, CHU de Nantes.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago Agagani 26 GTerumo050101BAgo 26 G
Betadine dermique Pharma-gdd3300931499787Soluzione povidone
Betadine scrubPharma-gdd  3400931499787Soluzione Povidone
Microscopio binoculareOptika Microscopes ItalySZN-9Stereomicroscopio binoculare
BuprecareAnimalcare3760087151244Buprenorphin
Castroviejo, dritto 9 cmF.S.T12060-02Micro forbici
Castroviejo, dritto 9 cmF.S.T12060-02Porta aghi
Cloruro di sodio Fresenius 0,9%Fresenius Kabi BE182743NaCl 0,9%
ClamoxylMed'vet5414736007496Amoxicillina
Cotton fiocComed2510805Cotton fioc
Element HT5ScilvetElement HT5Analizzatore ematologico automatizzato
EmepridCEVA3411111914365Metoclopramid
Extra Fine Graefe Pincipe, curvo (larghezza punta: 0,5 mm)F.S.T11152-10Pinza chirurgica
Pinza Graefe extra fine, diritta (larghezza punta: 0,5 mm)F.S.T11150-10Pinza chirurgica
FercobsangVetopriceQB03AE04Ferro, multivitaminici e minerali 
ForaneBaxter1001936060isoflurano
, diritta (larghezza della punta: 0,8 mm)F.S.T11050-10Pinze
Graphpad Prism versione 8.0GraphPad Software, Inc.Versione 8.0Software per l'analisi statistica
TermoforoIntellibio innovationA-2101-00300Termoforo
IncubatoreBioconcept TecnologieProdotto su richiestaIncubatore 
IlluminazioneMicroscopi Optika ItaliaCL-30Illuminazione per microscopia
OcrygelMed'vet3700454505621Carboptol 980 NF
Pangen 2,5 cm x 3,5 cmUrgovetA02978Impacco emostatico di collagene
Prolene 6/0B.Braun3097915Optilene 6/0 (0,7 metrico) 75 cm 2XDR13 CV2 RCP, cordone di sutura
Prolene 8/0Ethicon87322 x BV175-6 MP, 3/8 Cerchio, 8 mm,  corda di sutura
ForbiciF.S.T146168-09Forbici chirurgiche
Compresse sterili Laboartoire Sylamed211S05-50compressa sterile in tessuto non tessuto
Terumo50828Siringa da 1 ml
Clip emostatica in titanioPé ters SurgicalB2180-1Clip chirurgica
Vannas WolffF.S.T15009-08Micro forbici
Vita RongeurVirbac3597133087611Integrazione vitaminica
Vitaltec inoxPé ters SurgicalPB 220-EB Applicatore diclip chirurgiche
Pinza Graefe Siringa Terumo medie

Riferimenti

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