Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae

Sommario

Nell'infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L'ELISA interno per la cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, garantisce un'elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.

Abstract

Il Mycoplasma pneumoniae è un procariota carente della parete cellulare, noto principalmente per colonizzare il tratto respiratorio umano e per essere endemico, con picchi epidemici ogni 6 anni, nei bambini più grandi e nei giovani adulti. La diagnosi di M. pneumoniae è difficile a causa della natura meticolosa dell'agente patogeno e della possibilità di trasporto asintomatico. La diagnosi di laboratorio dell'infezione da M. pneumoniae basata sulla titolazione degli anticorpi nei campioni di siero dei pazienti rimane il metodo più praticato. A causa del potenziale problema della cross-reattività immunologica con l'uso di siero policlonale per M. pneumoniae, è stato sviluppato un saggio di immunoassorbimento enzimatico legato all'antigene (ELISA) per migliorare la specificità della diagnosi sierologica. Le piastre ELISA sono rivestite con anticorpi policlonali M. pneumoniae, allevati nei conigli e resi specifici dopo l'adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi che condividono antigeni con le specie di M. pneumoniae e/o sono noti per colonizzare le vie respiratorie . Gli antigeni omologhi di M. pneumoniae reagiti vengono quindi specificamente riconosciuti dai loro anticorpi corrispondenti nei campioni di siero. Un'ulteriore ottimizzazione dei parametri fisico-chimici a cui è sottoposto l'ELISA di cattura dell'antigene ha portato a un ELISA altamente specifico, sensibile e riproducibile.

Introduzione

I micoplasmi sono tra i procarioti più piccoli e semplici conosciuti. Si distinguono principalmente dagli altri batteri per la mancanza di una struttura della parete cellulare. Pertanto, i micoplasmi sono stati classificati in una classe separata denominata Mollicutes¹. Il deficit della parete cellulare conferisce resistenza intrinseca a questi microrganismi contro alcuni agenti antimicrobici ed è in gran parte responsabile del loro polimorfismo. I micoplasmi hanno un genoma piccolo e dimensioni ridotte, il che limita le loro capacità metaboliche e biosintetiche e spiega la loro natura parassitaria e saprofita

Protocollo

Il presente studio è stato condotto in conformità con gli aspetti etici stabiliti dal comitato etico dell'Istituto Pasteur di Tunisi.

1. Fasi pre-ELISA: prerequisiti e pre-elaborazione

1. Ceppi batterici e terreni di crescita
   NOTA: Le specie di Mollicutes e i batteri murati utilizzati nel presente studio e i loro substrati di crescita sono elencati nella Tabella 1.
   1. Crescita delle specie di Mollicutes
      1. Inoculare 200 μL dallo stock di glicerolo di ciascuna specie in 1.800 μL di terreno.
      2. Coltivare le specie Mollicutes staticamente a 37 °C con il 5% di CO 2 per_2-4 g....

Risultati

L'attività immunoblotting dell'antisiero policlonale Mycoplasma pneumoniae non adsorbito a batteri eterologhi
La cross-reattività esiste effettivamente come mostrato nei risultati dell'immunoblotting (Figura 2) e rispetto al controllo positivo (Lane 1), alcuni degli antigeni di M. pneumoniae sono condivisi con i batteri schermati. L'intensità di queste reazioni crociate era variabile. Ad esempio, gli antigeni di M. .......

Discussione

Questo documento presenta una descrizione generale di un ELISA interno sviluppato principalmente per garantire uno screening specifico di M. pneumoniae Infezione. Vengono forniti i dettagli sul protocollo del test ELISA stesso e alcune fasi di pre e post-elaborazione. La specificità di questo test è assicurata dalla tecnica di adsorbimento. Questa procedura è stata precedentemente descritta nei test ELISA sviluppati per la diagnosi di esseri umani e aviari Mycoplasmas^17,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-cloro-1-naftolo	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
Bacto peptone	BD	211677
Bacto triptone	BD	211705
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
Tampone bicarbonato	Sigma-Aldrich	C3041-50 Cap
Casein	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066	VWR	P0058-N1L
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO Brodo	BD	255420	Frey media
ELISA plate-Reader	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Rif: 51119200
Siero fetale bovino	Capricorn Scientific	FBS-12A
IgG anti-umano coniugato con perossidasi di capra	Abcam	ab6759
IgG Life Technologies anti-coniglio coniugato con perossidasi di capra		656120
Acido cloridrico 37%	Prolab	2025.290
Perossido di idrogeno (H2O2), soluzione 30%	Scharlau	HI01361000
L-arginina	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB brodo	Preparato nell'Istituto Pasteur di Tunisi		Fornito dal laboratorio di batteriologia dell'Istituto Pasteur di Tunisi
Mycoplasma pneumoniae antisiero policlonale prodotto nel coniglio	Prodotto nell'Istituto Pasteur di Tunisi		Il siero è stato prodotto mediante immunizzazione del coniglio presso l'Istituto Pasteur di Tunisi
Nicotinamide adenina dinucleotide	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Nunc Maxisorp piastra per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti	Invitrogen	44-2404-21
Penicillina G sodica (1 MIU)	PANPHARMA
Fenolo rosso	fluka chemika	77660
Latte scremato	MP Biomedicals	902887
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
Carbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
Cloruro di sodio (NaCl)	Novachim	PS02805
Acido solforico (H2SO4) 95-97%	Merck	1007311011
Thimerosal	USB	22215
Substrato TMB (3,3', 5,5' Tetrametil-Benzidina soluzione)	Abcam	ab142042
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
Tween 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
Estratto di lievito, polvere, Ultrapure	Thermo Scientific	J23547