Articolo metodologico

Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi

DOI:

10.3791/64647

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30 novembre 2022

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1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

In questo articolo

Sommario

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La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.

Abstract

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I mitocondri, essendo le centrali elettriche della cellula, svolgono ruoli importanti nella bioenergetica, nella generazione di radicali liberi, nell'omeostasi del calcio e nell'apoptosi. La mitofagia è il meccanismo primario del controllo della qualità mitocondriale ed è generalmente studiata utilizzando l'osservazione microscopica, tuttavia i saggi di mitofagia in vivo sono difficili da eseguire. La valutazione della mitofagia mediante imaging di organelli vivi è un metodo alternativo e necessario per la ricerca mitocondriale. Questo protocollo descrive le procedure per l'utilizzo del colorante mitocondriale fluorescente verde MitoTracker Green e del colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red nelle cellule vive, compreso il caricamento dei coloranti, la visualizzazione dei mitocondri e del lisosoma e i risultati attesi. Vengono inoltre forniti passaggi dettagliati per la valutazione della mitofagia in cellule vive, nonché note tecniche sulle impostazioni del software del microscopio. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.

Introduzione

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I mitocondri sono le centrali elettriche di quasi tutte le cellule eucariotiche 1,2. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri svolgono un ruolo vitale in altri processi come la bioenergetica, l'omeostasi del calcio, la generazione di radicali liberi, l'apoptosi e l'omeostasi cellulare 3,4,5. Poiché i mitocondri generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) da più complessi nella catena di trasporto degli elettroni, sono costantemente stimolati da potenziale stress ossidativo, c....

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Protocollo

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1. Coltura cellulare e passaggio

NOTA: Il protocollo è descritto utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) coltivati di routine come esempio.

  1. Colture di cellule MEF in piastre di coltura cellulare da 10 cm con 10 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 100x.
  2. Eseguire il passaggio cellulare di routine.
    1. Quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza (ogni 3 giorni), lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS). Quindi aggiungere 2 ml di t....

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Risultati

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MitoTracker Green è una colorazione mitocondriale verde-fluorescente che è in grado di localizzarsi con precisione nei mitocondri. Il colorante può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule fissate o morte con aldeide (Figura 2). Il colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red è in grado di marcare e tracciare organelli lisosomiali acidi e può solo macchiare cellule vive (Figura 2). L'imaging al microscopio .......

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Discussione

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Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per valutare e monitorare il processo dinamico della mitofagia nelle cellule viventi, che coinvolge autofagosomi, lisosomi e fissione mitocondriale, attraverso la co-colorazione con mitocondri e coloranti lisosomi. Il metodo può anche essere utilizzato per identificare i mitocondri e valutare la morfologia mitocondriale. Entrambi i coloranti utilizzati in questo studio dovrebbero essere protetti dalla luce, dovrebbero essere evitati cicli multipli di gelo-scongelamento e i c.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), dalla National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) e dal Program for Professor of Special Appointment presso le Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Contatore di cellule automatizzatoCountstarIC1000
Vetrini per camera di conteggio cellulareCountstar12-0005-50
Terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CV
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVC
Piastra per coltura cellulare con fondo in vetro (piastra confocale)NEST801002
Immagine J (Rasband, NIH)NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs– tampone Henseleit(KHB)Auto-preparato
mol/L, colorante lisosomiale rosso-fluorescente
MitoTracker GreenInvitrogen1842298200 µ mol/L stock, colorante per mitocondri fluorescenti verdi
Fibroblasti embrionali di topoauto-preparato
(lente ad olio 63x)ZEISSZEISS LSM 880
Tripsina-EDTA 0,25%GibicoCat# 25200056
Microscopio a scansione laser confocale ZEISS LSM 880ZEISSZEISS LSM 880
ZEN 2.1 (confocale software di imaging per microscopio)ZEISSZEN 2.1
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µ Obiettivo Software per microscopia

Riferimenti

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  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H.

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Mitophagy AssayMitochondria VisualizationLysosome StainingFluorescent DyesConfocal MicroscopyLive Cell ImagingMitoTracker GreenLysoTracker RedMitochondrial MorphologyMitochondrial Dynamics

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