Coltura tridimensionale di tessuto adiposo termogenico vascolarizzato da frammenti microvascolari

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che delinea l'uso di frammenti microvascolari isolati da roditori o tessuto adiposo umano come approccio diretto per progettare tessuto adiposo beige funzionale e vascolarizzato.

Abstract

L'ingegneria del tessuto adiposo termogenico (ad esempio, tessuti adiposi beige o bruni) è stata studiata come potenziale terapia per le malattie metaboliche o per la progettazione di microtessuti personalizzati per lo screening sanitario e i test farmacologici. Le strategie attuali sono spesso piuttosto complesse e non riescono a rappresentare accuratamente le proprietà multicellulari e funzionali del tessuto adiposo termogenico. I frammenti microvascolari, piccoli microvasi intatti composti da arteriole, venule e capillari isolati dal tessuto adiposo, fungono da singola fonte autologa di cellule che consentono la vascolarizzazione e la formazione del tessuto adiposo. Questo articolo descrive i metodi per ottimizzare le condizioni di coltura per consentire la generazione di tessuti adiposi termogenici tridimensionali, vascolarizzati e funzionali da frammenti microvascolari, compresi i protocolli per l'isolamento di frammenti microvascolari da tessuto adiposo e condizioni di coltura. Inoltre, vengono discusse le migliori pratiche, così come le tecniche per caratterizzare i tessuti ingegnerizzati e vengono forniti i risultati dei campioni da frammenti microvascolari sia di roditori che umani. Questo approccio ha il potenziale per essere utilizzato per la comprensione e lo sviluppo di trattamenti per l'obesità e le malattie metaboliche.

Introduzione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un approccio per lo sviluppo di tessuto adiposo beige vascolarizzato da una singola fonte potenzialmente autologa, il frammento microvascolare (MVF). I tessuti adiposi marroni e beige hanno dimostrato di mostrare proprietà benefiche legate alla regolazione metabolica; Tuttavia, il piccolo volume di questi depositi di tessuto adiposo negli adulti limita il potenziale impatto sul metabolismo sistemico, in particolare in condizioni malate come l'obesità o il diabete di tipo 2 1,2,3,4,5,6,7.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas a San Antonio.

NOTA: Per i passaggi descritti di seguito, vengono utilizzati ratti Lewis maschi. Lievi aggiustamenti del protocollo devono essere effettuati per una femmina, così come la raccolta di frammenti microvascolari di topo (MVF)²⁹. Per i protocolli ch....

Risultati

Ci sono alcune caratteristiche morfologiche fenotipiche chiave del tessuto adiposo beige / marrone: è multiloculare / contiene piccole goccioline lipidiche, possiede un gran numero di mitocondri (la ragione del suo aspetto tipicamente "brunastro" in vivo), ha corrispondentemente un alto tasso di consumo di ossigeno / bioenergetica mitocondriale, è altamente vascolarizzato, ha aumentato la lipolisi / assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e, più notoriamente, esprime alti livelli di proteina disaccoppi.......

Discussione

Il campo dell'ingegneria del tessuto adiposo marrone / beige è in gran parte immaturo 22,23,24,25,26,27,28, con la maggior parte dei modelli adiposi sviluppati per il tessuto adiposo bianco ^8,22,31........

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido aminocaproico	Sigma Aldrich	A2504-100G	Aggiunto in DMEM alla concentrazione di 1 mg/mL
Forbici a punta smussata	Fisher scientific	12-000-172	Sterilizzare in autoclave
Bovin Siero Albumina (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluito in PBS a 4 mg/mL e 1 mg/mL
Collagenasi Tipo 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluito a 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestione del grasso macinato
Desametasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluito in etanolo a una concentrazione madre di 2 mg/ml
Sottocuscinetti monouso	Fisher scientific	23-666-062	Per l'assorbimento di liquidi durante
l'intervento chirurgico Forbici da dissezione	Fisher scientific	08-951-5	Sterilizzare in autoclave
Dulbecco′ s Aquila modificata′ s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′ s Aquila modificata′ s Miscela Medium/Nutriente F-12 Prosciutto (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Siero fetale bovino	Fisher scientific	16140089	Aggiunto in DMEM al 20% v/v.
Fibrinogeno	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilizzato in DMEM alla concentrazione di 20 mg/mL, Proteina presente nel plasma sanguigno e componente principale dell'idrogel
Pallone, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Consente la digestione del grasso utilizzando un'ampia superficie
Pinze	Fisher scientific	50-264-21	Sterilizzare in autoclave, Per la manipolazione di tessuti e filtri
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	diluito in etanolo a una concentrazione di 10 mM
MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolati da tre diversi pazienti (donne di 52, 54 e 56 anni) sono stati utilizzati in questo studio.
Indometacina	Sigma Aldrich	I7378	Diluito in etanolo a una concentrazione di 12,5 mM
Insulina da pancreas suino	Sigma Aldrich	I5523	Diluito in 0,01 N HCl a una concentrazione di 5 mg/ml
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Aggiunto in DMEM allo 0,2% p/v, Mycoplasma Prophyttic
Pennicilina/Streptomicina (10.000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Aggiunto in DMEM all'1% v/v.
Piastre di Petri, polistirolo (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 per la rimozione dei vasi sanguigni e la macinazione, 8 (coperchio) per il pre-ammollo degli schermi e 8 (piatto) per l'uso durante il filtraggio con 500 o 37 &; M vaglia
piastre di Petri, polistirolo (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	Per il conteggio dei frammenti
Fosfato Tampone Soluzione salina (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluito a 1x con acqua deionizzata sterile.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	diluito in DMSO a una concentrazione di 10 mM
Forbici	Fine Science Tools	14059-11	1 per l'incisione iniziale, 1 per l'incisione dell'epididimo, 1 per il taglio della punta
Schermo  37 &; M	Carolina Biological Supply Company	652222R	Tagliato in quadrati arrotondati da 3" e sterilizzato in ossido di etilene, intrappolamento di frammenti e rimozione di frammenti molto piccoli/singole cellule e detriti
Schermo 500 &; M	Carolina Biological Supply Company	652222F	Tagliato in quadrati arrotondati da 3" e sterilizzato in ossido di etilene, rimuove frammenti/detriti più grandi
Emostatico seghettato	Fisher scientific	12-000-171	Sterilizzare in autoclave, per il bloccaggio della pelle prima dell'incisione
Filtro Steriflip 0,22 μ m	Millipore	SE1M179M6
Trombina	Fisher scientific	6051601KU	Diluito in acqua deionizzata a 10 U/mL, Usato come agente coagulante trasformando il fibrinogeno in fibrina
Ormone tiroideo (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluito in 1N NaOH a una concentrazione stock di 0,02 mM
Ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) - obesi (FA/FA) o magri (FA/+) maschi...	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Ottenuto da Charles River (Wilmington, MA). I ratti sono stati acquisiti a 4 settimane di età e alimentati con Purina 5008 fino all'eutanasia (15-19 settimane di età). I livelli di glucosio (sangue dalla vena safena laterale) erano superiori a 300 mg/dL in tutti i ratti FA/FA utilizzati nello studio. Tutti gli animali sono stati alloggiati in un ambiente a temperatura controllata con un ciclo luce-buio di 12 ore e alimentati ad libitum.

Human