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Articolo metodologico

Rilevamento di cellule T polifunzionali in bambini vaccinati con vaccino contro l'encefalite giapponese tramite la tecnica della citometria a flusso

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DOI:

10.3791/64671

23 settembre 2022

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con virus dell'encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

Abstract

L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo importante nel controllo dell'infezione da flavivirus, sia dopo la vaccinazione che dopo l'infezione naturale. La "qualità" di una cellula T deve essere valutata per funzione e una funzione più elevata è associata a una protezione immunitaria più potente. Le cellule T che possono produrre simultaneamente due o più citochine o chemochine a livello di singola cellula sono chiamate cellule T polifunzionali (TPFs), che mediano le risposte immunitarie attraverso una varietà di meccanismi molecolari per esprimere marcatori di degranulazione (CD107a) e secernere interferone (IFN)-γ, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-2 o proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α. Vi è una crescente evidenza che le TPFsono strettamente correlate al mantenimento della memoria immunitaria a lungo termine e alla protezione e che la loro maggiore proporzione è un importante marker di immunità protettiva ed è importante nel controllo efficace dell'infezione virale e della riattivazione. Questa valutazione si applica non solo a specifiche risposte immunitarie, ma anche alla valutazione delle risposte immunitarie cross-reattive. Qui, prendendo come esempio il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flussodei PF Tspecifici di JEV prodotti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

Introduzione

Il virus dell'encefalite giapponese (JEV) è un importante virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus all'interno della famiglia Flaviviridae1. Molti paesi dell'Asia-Pacifico hanno affrontato a lungo enormi sfide per la salute pubblica a causa dell'enorme carico di malattia causato dall'encefalite giapponese (JE), ma questo è migliorato notevolmente con la crescente disponibilità di vari tipi di vaccinazioni2. Le risposte immunitarie protettive adattative evocate dall'infezione naturale o dalla vaccinazione contribuiscono alla prevenzione e alla regolazione antivirale. L'immunità umorale e l'....

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Protocollo

L'approvazione etica per il presente studio è stata ottenuta dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). I volontari sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. I campioni di sangue venoso periferico sono stati ottenuti da bambini apparentemente sani (2 anni) che avevano precedentemente ricevuto una vaccinazione primaria e potenziata con vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato per meno di sei mesi (bambini vaccinati con JE, n = 5) e bambini non vaccinati (6 mesi, n = 5). Il consenso informato dei soggetti umani è stato revocato in quanto solo i campioni re....

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Risultati

La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzata per dividere la TCM o TEM delle cellule T CD8+ o CD4+ da un gruppo rappresentativo di stimolazione JEV di bambini vaccinati con JE. Il dot plot FSC-A/SSC-A viene utilizzato per identificare i linfociti e il dot plot FSC-A/FSC-W viene utilizzato per identificare singole cellule. Le celle vitali vengono selezionate sul dot plot vivo/morto/SSC-A. Il dot plot CD3/SSC-A viene utilizzato per identifica.......

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Discussione

Questo protocollo rappresenta un metodo di rilevazione fattibile basato sulla citometria a flusso per i profili TPF nelle PBMC di bambini vaccinati con il vaccino JEV SA14-14-2. Questo studio ha utilizzato le PBMC del sangue venoso di bambini vaccinati e non vaccinati come materiali di ricerca. Con la stimolazione delle PBMC con l'antigene JEV, quellePF Tamplificate antigene-specifiche possono essere caratterizzate dalla colorazione anticorpale con citometria a flusso multicolore. Rispetto al metodo.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

R.W. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82002130), dalla Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. è stato supportato dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anti-umano CD28Biolegend302934Anticorpo
anti-umano CD49dBiolegend304339Anticorpo
APC anti-umano MIP-1&alfa;BD551533Anticorpo fluorescente 
Contatore di cellule automatizzatoBIO RADTC20Conta cellulare
BD FACSiponia A5BDA5citometria a flusso
BUV395 anti-umano CD4BD563550anticorpo fluorescente 
BUV737 anti-umano CCR7BD741786Anticorpo fluorescente 
BUV737 anti-umano CD27BD612829Anticorpo fluorescente 
BV421 anti-umano CD8Biolegend344748Anticorpo fluorescente 
BV480 anti-umano CD45RABD566114Anticorpo fluorescente 
BV480 anti-umano CD45ROBD566143Anticorpo fluorescente 
BV605 anti-umano CD107aBiolegend328634Anticorpo fluorescente 
BV650 anti-umano CD3BD563999Anticorpo fluorescente 
BV785 anti-umano IL-2Biolegend500348Anticorpo fluorescente 
Provetta da centrifugaBD FalconBD-35209715Provetta da centrifuga da 15 mL
Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm BD554714Fissazione e permeabilizzazione cellulare
Mezzo di gradiente di densitàDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, mezzo di separazione dei linfociti umani
FITC anti-IFN-γBiolegend502506Anticorpo fluorescente 
Gibco Siero Fetale BovinoThermo Fisher Scientific16000-044Siero Fetale Bovino
Gibco RPMI-1640 medioThermo Fisher Scientific22400089terreno per colture cellulari
ad alta velocità  centrifugaSigma 3K15Centrifugazione cellulare per provette da centrifuga da 15 mL
ad alta velocità  centrifugaEppendorf5424RCentrifugazione cellulare per provetta da 1,5 mL Eppendorf (EP)
Provette per microcentrifugaAxygenMCT-150-CProvetta per microcentrifuga da 1,5 mL
PE anti-umano TNF-αBiolegend502909Anticorpo fluorescente 
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Inibitore del trasporto delle proteine (contenente Brefeldina A, GolgiPlug)BD555029blocca i processi di trasporto intracellulare delle proteine
Inibitore del trasporto delle proteine (contenente monensina)BD554724blocca i processi di trasporto intracellulare delle proteine
Provetta a fondo tondoBD Falcon352235Provetta da 5 mL
Kit di analisi della vitalità delle cellule di colorazione blu TrypanBeyotimeC0011Colorazione blu Trypan Zombie
NIR Colorante di vitalità fissabileBiolegend423106Colorazione delle cellule morte

Riferimenti

  1. Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317(2022).
  2. Wang, R., et al.

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Ristampe e permessi

Tag

Immunit delle cellule TColorazione intracellulare delle citochineCellule mononucleate del sangue perifericoCellule T CD4 positiveCellule T CD8 positiveMarcatori di degranulazioneMemoria immunitaria