Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con virus dell'encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.
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Articolo metodologico
Rilevamento di cellule T polifunzionali in bambini vaccinati con vaccino contro l'encefalite giapponese tramite la tecnica della citometria a flusso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo importante nel controllo dell'infezione da flavivirus, sia dopo la vaccinazione che dopo l'infezione naturale. La "qualità" di una cellula T deve essere valutata per funzione e una funzione più elevata è associata a una protezione immunitaria più potente. Le cellule T che possono produrre simultaneamente due o più citochine o chemochine a livello di singola cellula sono chiamate cellule T polifunzionali (TPFs), che mediano le risposte immunitarie attraverso una varietà di meccanismi molecolari per esprimere marcatori di degranulazione (CD107a) e secernere interferone (IFN)-γ, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-2 o proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α. Vi è una crescente evidenza che le TPFsono strettamente correlate al mantenimento della memoria immunitaria a lungo termine e alla protezione e che la loro maggiore proporzione è un importante marker di immunità protettiva ed è importante nel controllo efficace dell'infezione virale e della riattivazione. Questa valutazione si applica non solo a specifiche risposte immunitarie, ma anche alla valutazione delle risposte immunitarie cross-reattive. Qui, prendendo come esempio il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flussodei PF Tspecifici di JEV prodotti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.
Introduzione
Il virus dell'encefalite giapponese (JEV) è un importante virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus all'interno della famiglia Flaviviridae1. Molti paesi dell'Asia-Pacifico hanno affrontato a lungo enormi sfide per la salute pubblica a causa dell'enorme carico di malattia causato dall'encefalite giapponese (JE), ma questo è migliorato notevolmente con la crescente disponibilità di vari tipi di vaccinazioni2. Le risposte immunitarie protettive adattative evocate dall'infezione naturale o dalla vaccinazione contribuiscono alla prevenzione e alla regolazione antivirale. L'immunità umorale e l'immunità cellulo-mediata sono classificate come immunità adattativa e l'induzione della prima è sempre stata considerata una strategia chiave nella progettazione di vaccini, sebbene con una comprensione relativamente limitata negli ultimi3. Tuttavia, il ruolo dell'immunità mediata dalle cellule T nel limitare la diffusione del flavivirus e la clearance del virus è stato sempre più focalizzato e ampiamente studiato4. Inoltre, l'immunità delle cellule T non è solo indispensabile nelle risposte antivirali specifiche per JEV, ma svolge anche un ruolo di primo piano nella protezione incrociata dall'infezione secondaria con flavivirus eterologhi, che è stato dimostrato in studi precedenti5. Si ipotizza che questo effetto possa bypassare potenziali effetti di potenziamento mediati da anticorpi nell'infezione5. Da notare, tale immunità delle cellule T cross-reattive è importante, specialmente in assenza di vaccini e farmaci antivirali contro i flavivirus. Sebbene siano stati condotti molti studi per determinare il contributo delle cellule T nell'infezione da JEV rispetto alle cellule T CD4+ e CD8+ 6,7, le rispettive linee che secernono citochine e la loro diversificazione funzionale rimangono indeterminate, il che significa che la delucidazione delle esatte funzioni delle cellule T helper e killer è ostacolata.
La scala delle loro difese antivirali determina la qualità delle risposte delle cellule T. Le cellule T CD4+ o CD8+ che possono conferire compatibilmente due o più funzioni, tra cui la secrezione e la degranulazione delle citochine, sono caratterizzate come cellule T polifunzionali (TPFs) dopo stimolazione specificaa livello 8 di singola cellula. Le cellule T CD4 + che producono citochine singole o multiple possono avere vari effetti e memorie immunitarie. Ad esempio, le cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ hanno maggiori probabilità di formare una risposta protettiva efficace a lungo termine rispetto alle cellule T IL-2+ CD4+ 9, che possono essere utilizzate come parametro importante nella valutazione dell'effetto della vaccinazione. La frequenza delle cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ è aumentata nei pazienti con non-progressione a lungo termine della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), mentre le cellule T CD4+ nei pazienti con progressione dell'AIDS sono più inclini a produrre IFN-γ da solo a causa dell'effetto promotore di IL-2 sulla proliferazione delle cellule T10. Inoltre, un sottogruppo di IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ ha dimostrato di sopravvivere a lungo termine in vivo e promuovere sinergicamente la funzione di uccisione11. Sebbene le cellule T CD8+ abbiano maggiori probabilità di mostrare attività citotossica, alcune cellule T CD4+ sono anche dotate di attività citotossica come espressione rilevata indirettamente delle molecole di superficie CD107a12. Inoltre, alcuni sottogruppi di cellule T esprimono la chemochina MIP-1α, che è spesso secreta dai monociti per partecipare al reclutamento dei neutrofili mediato dalle cellule T13. Allo stesso modo, CD8+ TPFs può anche essere utilizzato per caratterizzare la versatilità dei marcatori di cui sopra. Gli studi hanno dimostrato che la strategia prime-boost può effettivamente indurre un periodo prolungato di effetti protettivi TPF 13, che possono migliorare la protezione suscitata dalla vaccinazione. Una caratteristica centrale nell'esame del sistema immunitario è la capacità delle cellule T di memoria di facilitare risposte più forti, più veloci e più efficaci alle sfide virali secondarie rispetto alle cellule T naïve. Le cellule T della memoria effettrice (TEM) e le cellule T della memoria centrale (TCM) sono importanti sottoinsiemi di cellule T che sono spesso differenziate dall'espressione composita di CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. La TCM (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tende a localizzarsi nei tessuti linfoidi secondari, mentre la TEM (CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA-) si localizza nei tessuti linfoidi e periferici15,16. TEM fornisce una difesa immediata ma non sostenuta, mentre TCM sostiene la risposta proliferando negli organi linfoidi secondari e generando nuovi effettori17. Pertanto, dato che le cellule di memoria possono mediare risposte di richiamo specifiche ed efficienti ai virus, sorgono domande sul contributo di questo sottoinsieme di polifunzioni.
Con lo sviluppo della tecnologia di citometria a flusso, è diventato comune rilevare simultaneamente marcatori di oltre 10 cluster, fenotipi e antigeni di differenziazione, il che è utile per annotare più abbondantemente le caratteristiche immunologiche funzionali sulle singole cellule T per ridurre l'interpretazione errata e le difficoltà nella comprensione dei fenotipi delle cellule T. Questo studio ha utilizzato la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili TPF nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con JEV. Applicando questo approccio, verrà ampliata la comprensione dell'immunità delle cellule T JEV-specifica e persino cross-reattiva a breve e lungo termine indotta dalla vaccinazione.
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Protocollo
L'approvazione etica per il presente studio è stata ottenuta dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). I volontari sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. I campioni di sangue venoso periferico sono stati ottenuti da bambini apparentemente sani (2 anni) che avevano precedentemente ricevuto una vaccinazione primaria e potenziata con vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato per meno di sei mesi (bambini vaccinati con JE, n = 5) e bambini non vaccinati (6 mesi, n = 5). Il consenso informato dei soggetti umani è stato revocato in quanto solo i campioni residui, dopo essere stati testati clinicamente, sono stati utilizzati in questo studio. Per proteggere la privacy dei volontari, tutti i dati sono stati completamente anonimizzati e resi anonimi.
1. Isolamento delle PBMC dal sangue venoso periferico
- Raccogliere campioni di sangue venoso periferico (2 ml) da bambini vaccinati con JE e non vaccinati in provette EDTA-K 2-anticoagulate (vedere Tabella dei materiali) con la tecnica di venipuntura standard18.
- Aggiungere 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) per diluire il sangue periferico.
NOTA: Il processo viene gestito il prima possibile per mantenere la massima sopravvivenza. - Aggiungere 4 mL del mezzo con gradiente di densità (vedere Tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 15 mL e trasferire lentamente il sangue diluito allo strato superiore del mezzo di separazione.
NOTA: Non mescolare il sangue con il mezzo di separazione o distruggere la superficie di contatto formata dai due liquidi; In caso contrario, l'effetto di separazione non sarà raggiunto. - Centrifugare a 800 × g per 20 minuti a temperatura ambiente. Osservare gli strati significativi dopo la centrifugazione.
- Trasferire le PBMC (lo strato intermedio) in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml e lavare le PBMC con 10 ml di terreno RPMI-1640 contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS, vedere Tabella dei materiali).
- Centrifugare a 800 × g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare accuratamente il surnatante con una pipetta.
- Risospendere le PBMC con 1 mL di terreno RPMI-1640 contenente il 10% di FBS e contare le celle con un contatore automatico basato su trypan blue (vedere Tabella dei materiali).
2. Stimolazione delle PBMC da parte di particelle JEV inattivate per indurre l'espressione di citochine
- Impostare due sottogruppi dei gruppi di stimolazione e controllo JEV rispettivamente nei campioni vaccinati con JE e non vaccinati.
- Regolare il numero di PBMC a 2 × 10 6 celle/ml con mezzo RPMI-1640 contenente il 10% di FBS e seminare le PBMC in piastre da 24 pozzetti (2 × 106 celle/1 mL di terreno per pozzetto); inoculare tre pozzi per ogni gruppo.
- Stimolare le PBMC del gruppo di stimolazione JEV con particelle JEV inattivate concentrate 5 (2 × 105 PFU) per 16 ore a 37 °C in presenza di anticorpi monoclonali CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensin (1 μg/mL, 1:1.000). Per la colorazione superficiale, utilizzare BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Il JEV è stato inattivato mediante irradiazione UV come descritto in precedenza19. - Stimolare le PBMC del gruppo di controllo senza particelle virali concentrate per 16 ore a 37 °C in presenza di anticorpi monoclonali CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensin (1 μg/mL, 1:1.000). Colorare la superficie con BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000).
3. Colorazione intracellulare ex vivo
- Raccogliere la sospensione cellulare da ciascun gruppo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS, aggiungere colorante di vitalità fissabile (1 μL/mL, 1:1.000, vedi Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare a 500 × g (a temperatura ambiente) per 5 minuti e rimuovere il surnatante
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS. Centrifugare a 500 × g (a temperatura ambiente) per 5 min. Scartare il surnatante con attenzione.
- Eseguire la colorazione dei marcatori della superficie cellulare.
- Risospendere le cellule in 100 μL di 1x PBS e aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo marcatori di superficie (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO, fattore di diluizione: 1:50, vedere Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare in ciascuna provetta.
NOTA: Il protocollo di colorazione degli anticorpi fluorescenti a colori è mostrato nella Tabella 1. - Incubare i tubi (punto 3.4.1) per 30 minuti a temperatura ambiente e proteggerli dalla luce. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
NOTA: L'anticorpo di BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO può essere sostituito con BUV737-anti-CCR7 e BV480-anti-CD45RA come annotazione delle cellule T di memoria.
- Risospendere le cellule in 100 μL di 1x PBS e aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo marcatori di superficie (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO, fattore di diluizione: 1:50, vedere Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare in ciascuna provetta.
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante con attenzione.
- Eseguire la fissazione e la rottura della membrana.
- Risospendere le cellule con 500 μL di soluzione fissativa che rompe la membrana (vedi Tabella dei materiali) e fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS. Centrifugare per 5 min a 500 × g a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante .
- Eseguire la colorazione intracellulare delle citochine.
- Risospendere le cellule in 100 μL di 1x PBS e aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo citochina (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 e APC-anti-MIP-1α, fattore di diluizione: 1:50, vedere Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare in ciascun tubo.
NOTA: I volumi e le informazioni sugli anticorpi coniugati con fluorofori sono riportati nella Tabella 1. - Incubare i tubi (punto 3.8.1) per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 μL di 1x PBS e aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo citochina (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 e APC-anti-MIP-1α, fattore di diluizione: 1:50, vedere Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare in ciascun tubo.
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante . Aggiungere 500 μL di 1x PBS per risospendere le celle.
4. Impostazione della citometria a flusso
- Isolare il campione PBMC da solo seguendo le procedure descritte nel passaggio 1 come campione di controllo. Dividere la sospensione cellulare in 12 parti uguali in provette da microcentrifuga da 1,5 mL (100 μL/tubo) come indicato di seguito.
- Impostare campioni non colorati, APC-Cy7-vivo/morto fissabile colorato, BV650-anti-CD3 mono-macchiato, BUV395-anti-CD4 mono-macchiato, BV421-anti-CD8 mono-macchiato, BUV737-anti-CD27 mono-macchiato, BV480-anti-CD45RO colorato, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ colorato, PE-anti-TNF-α monocolore, BV785-anti-IL-2 mono-colorato e APC-anti-MIP-1α monocolore.
- Aggiungere i marcatori della superficie cellulare e la colorazione intracellulare delle citochine come descritto al punto 3. Per ogni campione di colorazione singola, aggiungere solo uno dei fluorofori dalla fase di colorazione. Aggiungere 500 μL di 1x PBS per risospendere le celle e il vortice a bassa velocità.
- Utilizzando un campione non colorato, regolare la dispersione diretta (FSC), la dispersione laterale (SSC) e diverse tensioni del colorante fluorescente.
NOTA: Per il presente studio, sono state impostate le seguenti tensioni. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V e BV785: 725 V. - Utilizzando i campioni monocolore, regolare la compensazione della citometria a flusso per eliminare i segnali di contaminazione tra i diversi fluorofori.
NOTA: i parametri di compensazione sono riportati nella tabella 2.
5. Strategia di gating e analisi dei dati
NOTA: Nel presente studio, per questa analisi, le cellule T della memoria centrale (TCM delle cellule T CD8+ o CD4+ come CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA- e le cellule T effettrici di memoria (TEM) delle cellule T CD8+ o CD4+ come CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA- sono state definite rispettivamente16.
- Disegnare un cancello poligonale attraverso il dot plot dell'area FSC-A) / SSC (SSC-A) per selezionare la popolazione di linfociti intatta escludendo i detriti (Figura 1A).
- Disegnare un cancello rettangolare attraverso il dot plot FSC-A/FSC-width (FSC-W) per selezionare le singole celle (Figura 1B).
- Disegnare un cancello rettangolare attraverso il dot plot live/dead/SSC-A per selezionare le celle attive (Figura 1C).
- Disegnare un gate rettangolare attraverso il dot plot CD3/SSC-A per identificare le cellule T CD3+ (Figura 1D).
- Disegnare un quad gate attraverso il dot plot CD4/CD8 per identificare le cellule T CD4+ o CD8+ (Figura 1E).
- Disegnare un quad gate attraverso il dot plot CD45RO/CD27 per suddividere le cellule T CD4+ o CD8+ in TCM (CD27+ CD45RO+) e TEM (CD27- CD45RO+) (Figura 1F-I).
- Disegnare le porte di CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 e MIP-1α dalla TCM o TEM delle cellule T CD8 + o CD4 + per determinare la frequenza di diversi modelli di risposta, rispettivamente.
- Caricare i campioni sulla citometria in sequenza. Utilizzare un cancello di arresto 20 per acquisire 1 ×10 6 linfociti.
NOTA: il singolo utente può raccogliere più di 1 × 106 celle. Questo numero era un compromesso tra il tempo impiegato e la raccolta di un numero sufficiente di celle per fornire risultati significativi.
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Risultati
La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzata per dividere la TCM o TEM delle cellule T CD8+ o CD4+ da un gruppo rappresentativo di stimolazione JEV di bambini vaccinati con JE. Il dot plot FSC-A/SSC-A viene utilizzato per identificare i linfociti e il dot plot FSC-A/FSC-W viene utilizzato per identificare singole cellule. Le celle vitali vengono selezionate sul dot plot vivo/morto/SSC-A. Il dot plot CD3/SSC-A viene utilizzato per identifica...
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Discussione
Questo protocollo rappresenta un metodo di rilevazione fattibile basato sulla citometria a flusso per i profili TPF nelle PBMC di bambini vaccinati con il vaccino JEV SA14-14-2. Questo studio ha utilizzato le PBMC del sangue venoso di bambini vaccinati e non vaccinati come materiali di ricerca. Con la stimolazione delle PBMC con l'antigene JEV, quellePF Tamplificate antigene-specifiche possono essere caratterizzate dalla colorazione anticorpale con citometria a flusso multicolore. Rispetto al metodo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
R.W. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82002130), dalla Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. è stato supportato dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anti-umano CD28 | Biolegend | 302934 | Anticorpo |
| anti-umano CD49d | Biolegend | 304339 | Anticorpo |
| APC anti-umano MIP-1&alfa; | BD | 551533 | Anticorpo fluorescente |
| Contatore di cellule automatizzato | BIO RAD | TC20 | Conta cellulare |
| BD FACSiponia A5 | BD | A5 | citometria a flusso |
| BUV395 anti-umano CD4 | BD | 563550 | anticorpo fluorescente |
| BUV737 anti-umano CCR7 | BD | 741786 | Anticorpo fluorescente |
| BUV737 anti-umano CD27 | BD | 612829 | Anticorpo fluorescente |
| BV421 anti-umano CD8 | Biolegend | 344748 | Anticorpo fluorescente |
| BV480 anti-umano CD45RA | BD | 566114 | Anticorpo fluorescente |
| BV480 anti-umano CD45RO | BD | 566143 | Anticorpo fluorescente |
| BV605 anti-umano CD107a | Biolegend | 328634 | Anticorpo fluorescente |
| BV650 anti-umano CD3 | BD | 563999 | Anticorpo fluorescente |
| BV785 anti-umano IL-2 | Biolegend | 500348 | Anticorpo fluorescente |
| Provetta da centrifuga | BD Falcon | BD-35209715 | Provetta da centrifuga da 15 mL |
| Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm BD | 554714 | Fissazione e permeabilizzazione cellulare | |
| Mezzo di gradiente di densità | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, mezzo di separazione dei linfociti umani |
| FITC anti-IFN-γ | Biolegend | 502506 | Anticorpo fluorescente |
| Gibco Siero Fetale Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Siero Fetale Bovino |
| Gibco RPMI-1640 medio | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | terreno per colture cellulari |
| ad alta velocità centrifuga | Sigma | 3K15 | Centrifugazione cellulare per provette da centrifuga da 15 mL |
| ad alta velocità centrifuga | Eppendorf | 5424R | Centrifugazione cellulare per provetta da 1,5 mL Eppendorf (EP) |
| Provette per microcentrifuga | Axygen | MCT-150-C | Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL |
| PE anti-umano TNF-α | Biolegend | 502909 | Anticorpo fluorescente |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Inibitore del trasporto delle proteine (contenente Brefeldina A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocca i processi di trasporto intracellulare delle proteine |
| Inibitore del trasporto delle proteine (contenente monensina) | BD | 554724 | blocca i processi di trasporto intracellulare delle proteine |
| Provetta a fondo tondo | BD Falcon | 352235 | Provetta da 5 mL |
| Kit di analisi della vitalità delle cellule di colorazione blu Trypan | Beyotime | C0011 | Colorazione blu Trypan Zombie |
| NIR Colorante di vitalità fissabile | Biolegend | 423106 | Colorazione delle cellule morte |
Riferimenti
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