Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

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Articolo metodologico

Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

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DOI:

10.3791/64676

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23 dicembre 2022

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive i passaggi chiave per generare e caratterizzare organoidi 3D orali-esofagei murini che rappresentano lesioni da carcinoma a cellule squamose normali, preneoplastiche e squamose indotte tramite carcinogenesi chimica.

Abstract

Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è prevalente in tutto il mondo, rappresentando il 90% di tutti i casi di cancro esofageo ogni anno ed è il più mortale di tutti i carcinomi a cellule squamose umane. Nonostante i recenti progressi nella definizione dei cambiamenti molecolari che accompagnano l'inizio e lo sviluppo dell'ESCC, la prognosi del paziente rimane sfavorevole. L'annotazione funzionale di questi cambiamenti molecolari è il passo successivo necessario e richiede modelli che catturino le caratteristiche molecolari dell'ESCC e possano essere manipolati in modo semplice ed economico per l'annotazione funzionale. I topi trattati con il fumo di tabacco mimetico 4-nitrochinolina 1-ossido (4NQO) formano prevedibilmente ESCC e preneoplasia esofagea. Da notare che le lesioni 4NQO insorgono anche nella cavità orale, più comunemente nella lingua, così come nel prestomaco, che condividono tutti l'epitelio squamoso stratificato. Tuttavia, questi topi non possono essere semplicemente manipolati per il test di ipotesi funzionali, poiché la generazione di modelli murini isogeni richiede molto tempo e risorse. Qui, superiamo questa limitazione generando organoidi tridimensionali (3D) derivati da singole cellule da topi trattati con 4NQO per caratterizzare ESCC murino o cellule preneoplastiche ex vivo. Questi organoidi catturano le caratteristiche salienti dell'ESCC e della preneoplasia esofagea, possono essere sfruttati in modo economico e rapido per formare modelli isogeni e possono essere utilizzati per esperimenti di trapianto singeneico. Dimostriamo come generare organoidi 3D da tessuto esofageo murino normale, preneoplastico e SCC e mantenere e crioconservare questi organoidi. Le applicazioni di questi organoidi versatili sono ampie e includono l'utilizzo di topi geneticamente modificati e l'ulteriore caratterizzazione mediante citometria a flusso o immunoistochimica, la generazione di linee di organoidi isogeneici utilizzando le tecnologie CRISPR e lo screening farmacologico o il trapianto singeneico. Riteniamo che l'adozione diffusa delle tecniche dimostrate in questo protocollo accelererà i progressi in questo campo per combattere il grave onere dell'ESCC.

Introduzione

Il carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) è il più letale dei carcinomi a cellule squamose umane, a causa della sua diagnosi tardiva, della resistenza alla terapia e delle metastasi ^1,2. L'ESCC nasce dall'epitelio squamoso stratificato, che riveste la superficie luminale dell'esofago. L'epitelio squamoso è composto da cellule basali proliferative e cellule differenziate all'interno dello strato cellulare soprabasale. In condizioni fisiologiche, le cellule basali esprimono marcatori come p63, Sox2 e citocheratina K5 e K14, mentre le cellule differenziate esprimono K4, K13 e IVL. Le cellule basali stesse s....