Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Luis Espejo; Bradford Hull; Leah M. Chang; Destiny DeNicola; Samuel Freitas; Vanessa Silbar; Anne Haskins; Emily A. Turner; George  L. Sutphin

doi:10.3791/64682

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Articolo metodologico

Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

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DOI:

10.3791/64682

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2 dicembre 2022

Luis Espejo^*¹ , Bradford Hull^*¹ , Leah M. Chang¹ , Destiny DeNicola¹ , Samuel Freitas¹ , Vanessa Silbar¹ , Anne Haskins¹ , Emily A. Turner¹ , George L. Sutphin¹

¹Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di singoli nematodi isolati su terreni solidi per il monitoraggio dei parametri fisiologici permanenti e la quantificazione della fluorescenza. Questo sistema di coltura include una barriera di acido palmitico attorno ai pozzi a singolo verme per impedire agli animali di fuggire, consentendo l'uso di interventi avversivi, inclusi batteri patogeni e fattori di stress chimici.

Abstract

Caenorhabditis elegans sono ampiamente utilizzati per studiare la biologia dell'invecchiamento. La pratica standard negli studi sull'invecchiamento di C. elegans è quella di coltivare gruppi di vermi su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM), consentendo la raccolta efficiente di dati a livello di popolazione per la sopravvivenza e altri fenotipi fisiologici e il campionamento periodico delle sottopopolazioni per la quantificazione dei biomarcatori fluorescenti. I limiti di questo approccio sono l'incapacità di (1) seguire i singoli vermi nel tempo per sviluppare traiettorie di età per fenotipi di interesse e (2) monitorare biomarcatori fluorescenti direttamente nel contesto dell'ambiente di coltura. Gli approcci di coltura alternativi utilizzano la coltura liquida o la microfluidica per monitorare i singoli animali nel tempo, in alcuni casi inclusa la quantificazione della fluorescenza, con il compromesso che l'ambiente di coltura è contestualmente distinto dal NGM solido. Il WorMotel è un dispositivo multi-pozzo microfabbricato precedentemente descritto per la coltura di vermi isolati su NGM solido. Ogni verme è mantenuto in un pozzo contenente NGM solido circondato da un fossato riempito di solfato di rame, un repellente da contatto per C. elegans, che consente il monitoraggio longitudinale dei singoli animali. Troviamo che il solfato di rame non è sufficiente per impedire ai vermi di fuggire quando sottoposti a interventi avversivi comuni nella ricerca sull'invecchiamento, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni e agenti chimici che inducono stress cellulare. I dispositivi multi-pozzetto sono anche stampati da polidimetilsilossano, che produce artefatti di fondo elevati nell'imaging a fluorescenza. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per la coltura di nematodi isolati su NGM solido utilizzando microvassoi di polistirene disponibili in commercio, originariamente progettati per la tipizzazione dell'antigene leucocitario umano (HLA), consentendo la misurazione della sopravvivenza, dei fenotipi fisiologici e della fluorescenza per tutta la durata della vita. Una barriera di acido palmitico impedisce ai vermi di fuggire, anche in presenza di condizioni avverse. Ogni piastra può coltivare fino a 96 animali e si adatta facilmente a una varietà di condizioni, tra cui restrizioni dietetiche, RNAi e additivi chimici, ed è compatibile con i sistemi automatizzati per la raccolta di dati sulla durata della vita e sull'attività.

Introduzione

C. elegans è un potente organismo modello per la ricerca in genetica, biologia cellulare e biologia molecolare, perché sono facilmente coltivabili in laboratorio, hanno un breve tempo di generazione e durata della vita, condividono un alto grado di omologia proteica con i mammiferi e hanno una struttura corporea trasparente che consente la visualizzazione in vivo di proteine fluorescenti e coloranti¹. Come risultato dell'uso di lunga data di C. elegans come importante sistema modello in una serie di campi, tra cui la biologia dello sviluppo e l'invecchiamento, la loro crescita e sviluppo sono ben compresi, il loro gen....