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Articolo metodologico

Preparazione della sospensione unicellulare dall'intestino della tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula

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DOI:

10.3791/64688

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10 febbraio 2023

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1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, dimostriamo la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia per il sequenziamento unicellulare.

Abstract

La tilapia del Nilo è una delle specie di pesci d'acqua dolce più comunemente coltivate in tutto il mondo ed è un modello di ricerca ampiamente utilizzato per gli studi sui pesci di acquacoltura. La preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità è essenziale per gli studi a livello di singola cellula come l'RNA a singola cellula o il sequenziamento del genoma. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per le specie ittiche di acquacoltura, in particolare per l'intestino della tilapia. Gli enzimi di dissociazione efficaci variano a seconda del tipo di tessuto. Pertanto, è essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale selezionando l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. Questo studio illustra un protocollo ottimizzato per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino di tilapia del Nilo con una combinazione enzimatica di collagenasi/dispasi. Questa combinazione è altamente efficace per la dissociazione con l'utilizzo di albumina sierica bovina e DNasi per ridurre l'aggregazione cellulare dopo la digestione. La produzione cellulare soddisfa i requisiti per il sequenziamento di singole cellule, con una vitalità cellulare del 90% e un'alta concentrazione cellulare. Questo protocollo può anche essere modificato per preparare una sospensione unicellulare dall'intestino di altre specie di pesci. Questa ricerca fornisce un protocollo di riferimento efficiente e riduce la necessità di ulteriori prove nella preparazione di sospensioni monocellulari per specie ittiche di acquacoltura.

Introduzione

Le cellule sono le unità fondamentali degli organismi. Rispetto agli studi sui tessuti di massa, gli studi a livello di singola cellula possono riflettere l'eterogeneità cellulare e fornire informazioni a risoluzione più elevata1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno applicato tecnologie di sequenziamento a singola cellula per studi su genoma, trascrittoma, epigenoma o multi-omici a livello di singola cellula in mammiferi, zebrafish e altri organismi modello e hanno riportato grandi scoperte 2,3,4,5,6,7 . Mentre la maggior parte degli studi si è concentrata su organismi modello, ci sono pochi protocolli di riferimento o kit di dissociazione commerciale per il sequenziamento a singola cellula nelle specie ittiche economiche, il che limita l'applicazione del sequenziamento a singola cellula nella ricerca sull'acquacoltura. Pertanto, lo sviluppo di protocolli di dissociazione tissutale che producano sospensioni monocellulari di alta qualità con elevata vitalità cellulare e integrità dell'acido nucleico è fondamentale.

È essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale con l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. L'enzima più efficace per la dissociazione tissutale varia a seconda del tipo di tessuto. Nei mammiferi, diversi enzimi sono stati utilizzati per preparare sospensioni unicellulari per i tessuti solidi dei mammiferi, tra cui collagenasi, dispasi, tripsina, papaina, elastasi, ialuronidasi, liberase, accutasi e trypLE 8,9. La digestione della tripsina combinata con la rottura meccanica è stata comunemente usata per dissociare i tessuti per la coltura cellulare nei pesci 10,11,12,13,14. La tripsina è stata anche utilizzata o aggiunta nel cocktail di digestione per la dissociazione dei tessuti nell'intestino di ratto15 e nel tessuto branchiale zebrafish16. Tuttavia, per diversi motivi, la tripsina non è l'opzione migliore per il sequenziamento a singola cellula. La tripsina da sola è di solito inefficace per la dissociazione tissutale. Inoltre, la tripsina induce rotture del filamento di DNA 17,18 e degradazione dell'RNA19.

La papaina degrada le proteine che compongono le giunzioni strette tra le cellule. Nelle cellule nervose e muscolari lisce dei mammiferi, la papaina è più efficiente e meno distruttiva di altre proteasi20,21. Tuttavia, come la tripsina, la papaina provoca l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare che si verifica durante la digestione enzimatica9. L'elastasi rompe l'elastina, che si trova tipicamente nella pelle, nei polmoni, nei legamenti, nei tendini e nei tessuti vascolari22. È spesso usato in combinazione con collagenasi, dispasi o tripsina per dissociare il tessuto polmonare8. La ialuronidasi fende i legami glicosidici dello ialuronano, contribuendo alla digestione della matrice extracellulare in vari tessuti connettivi e della pelle 9,23.

In generale, la collagenasi e la dispasi sono buone opzioni per la rottura della matrice extracellulare. Sono stati utilizzati nella dissociazione degli intestini umani, di topo e zebrafish24,25,26,27. La collagenasi distrugge il legame peptidico nel collagene, promuove la digestione della matrice extracellulare e rilascia le cellule in sospensione e, quindi, la collagenasi viene spesso utilizzata per la dissociazione dei tessuti solidi umani e di topo, incluso il fegato 28,29, la milza30, il pancreas31 e l'intestino 25. La dispasi è una proteasi che idrolizza i legami peptidici N-terminali dei residui di amminoacidi non polari ed è più mite della collagenasi. Fende i componenti della matrice extracellulare, come la fibronectina, il collagene di tipo IV e, in misura minore, il collagene di tipo I, senza influenzare le giunzioni cellula-cellula. Dispase è usato separatamente o con altri enzimi per la dissociazione dei tessuti, come per intestino25,32, cervello33, fegato34, ecc. Inoltre, i cocktail di digestione disponibili in commercio, tra cui liberase, accutase e trypLE, sono anche buone alternative per la dissociazione dei tessuti solidi, in particolare per la pelle, il fegato e i reni 8,9.

La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) appartiene alla famiglia Cichlidae dell'ordine Perciformes. È una delle specie ittiche d'acqua dolce più coltivate nelle aree tropicali e subtropicali, con una produzione annua di 4,5 milioni di tonnellate nel 202235. È una delle specie di pesci di acquacoltura meglio studiate con un genoma ben annotato. La tilapia del Nilo è un modello di ricerca ideale per le specie ittiche di acquacoltura grazie al suo breve tempo di generazione, alla facilità di allevamento e all'adattabilità a una vasta gamma di ambienti di allevamento. L'intestino è di grande interesse di ricerca in quanto è l'organo della digestione e dell'assorbimento della nutrizione, del metabolismo e dell'immunità delle mucose. L'intestino è l'habitat delle popolazioni microbiche ed è un tessuto immunitario essenziale36. È immunologicamente attivo a causa della presenza di numerosi tipi di cellule immunitarie, tra cui macrofagi, cellule B, granulociti e cellule T.

Nel presente studio, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino della tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. Secondo le caratteristiche di questi enzimi tessuto-specifici e il lavoro preliminare, la collagenasi/dispasi è appropriata per dissociare il tessuto intestinale della tilapia. L'ultimo tipo di enzima da considerare nella preparazione di sospensioni monocellulari è la DNasi-I, che impedisce l'aggregazione cellulare degradando il DNA libero rilasciato attraverso la lisi delle cellule morte durante la digestione enzimatica senza iniziare le vie apoptotiche9 e aumenta la resa delle cellule vive36. Inoltre, l'albumina sierica bovina (BSA) viene aggiunta al tampone di lavaggio per ridurre l'aggregazione cellulare e migliorare la vitalità cellulare. Diverse aziende produttrici di reagenti descrivono BSA come uno stabilizzatore enzimatico. L'aggiunta di BSA allo 0,04%-1% di BSA al PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è stata utilizzata per sviluppare una soluzione di lavaggio per la preparazione di sospensioni di sequenziamento monocellulare senza effetti avversi38. L'aggiunta di un basso rapporto di BSA potrebbe aiutare a mantenere la vitalità cellulare ed evitare l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare. Questo protocollo può anche fornire un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare dall'intestino di altre specie di pesci di acquacoltura.

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Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali durante questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Hainan (numero di protocollo: HNUAUCC-2022-00063; Data di approvazione: 2022-03-03). Un elenco delle attrezzature e delle forniture utilizzate in questo esperimento può essere trovato nella tabella dei materiali. Un riepilogo del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione del pesce

  1. Ottenere tilapia del Nilo di 6 mesi con un peso corporeo medio di 100 g da una fonte affidabile. Seleziona pesci privi di segni di malattia.
  2. Smettere di nutrire il pesce 24 ore prima di procedere al passaggio successivo.
    NOTA: Il digiuno del pesce riduce il volume del contenuto intestinale e facilita la preparazione dei segmenti intestinali.
  3. Risciacquare il pesce in acqua sterile ben aerata per 15 minuti per lavare via i batteri legati liberamente sulla superficie del corpo.
  4. Eutanasia il pesce con 300 mg / L di tricaina metansolfonato (MS-222) per circa 10 minuti fino a quando tutti i movimenti si fermano.

2. Preparazione del reagente

  1. Preparare la soluzione salina tamponata fosfato di BSA-Dulbecco allo 0,08% (BSA-DPBS, per il risciacquo e la sospensione cellulare). Sciogliere 0,08 g di BSA (0,8% p/v) in 100 mL di 1x DPBS. Conservare a 4 °C e pre-raffreddare su ghiaccio quando utilizzato.
    NOTA: L'aggiunta di BSA è utile per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare. Il rapporto BSA può essere aumentato dallo 0,04% all'1% in base alle condizioni di aggregazione cellulare.
  2. Preparare il reagente di dissociazione cellulare enzimatica.
    1. Diluire la collagenasi/dispasi con 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg/mL (0,1 U/mL collagenasi e 0,8 U/mL dispasi). Assicurarsi che venga utilizzato PBS e non DPBS.
      NOTA: PBS fornisce gli ioni calcio necessari per il corretto funzionamento dell'enzima. DPBS non deve essere utilizzato in questo passaggio perché è privo di Ca 2+/Mg2+. Inoltre, la collagenasi di tipo I viene utilizzata nel protocollo corrente.
    2. Filtrare la diluizione attraverso un filtro sterile a membrana da 0,22 μm.
    3. Preparare un reagente di dissociazione cellulare composto da un volume del 95% di soluzione di collagenasi/dispasi e un volume del 5% di siero bovino fetale (FBS).
      NOTA: Il reagente di dissociazione deve essere reso fresco ogni volta che viene utilizzato. L'uso di FBS al 5% aiuta a mantenere la vitalità cellulare durante la digestione.
  3. Preparare la soluzione di tripano blu.
    1. Prelevare la soluzione di tripano blu dal frigorifero a 4 °C e tenerla a 15-20 °C per alcuni minuti prima dell'uso per evitare precipitazioni.
    2. Filtrare la soluzione attraverso una membrana sterile da 0,22 μm.

3. Preparazione dell'attrezzatura

  1. Preraffreddare la centrifuga refrigerata a 4 °C prima dell'uso.
  2. Ottenere provette da centrifuga sterili da 1,5 mL prive di RNasi, tubi conici da 50 ml, pipette e punte in vetro ad ampio alesaggio, filtri a membrana, filtri cellulari e tutti i tubi e le punte a bassa ritenzione.
  3. Pipette in vetro per autoclave e strumenti di dissezione, tra cui pinze, forbici e bisturi, e pretrattarli con la soluzione di rimozione della RNasi per prevenire gli effetti avversi della RNasi per l'RNA-seq unicellulare.

4. Dissezione tissutale e dissociazione cellulare

  1. Metti il pesce eutanasia sul ghiaccio per la dissezione. Asetticamente, raccogliere 3-4 cm della sezione centrale dell'intestino e asportare quanto più grasso e mesentere possibile. Rimuovere con attenzione il grasso attaccato alla superficie intestinale e lo strato di mucosa chiara elastica e malleabile con una pinza.
    NOTA: Il grasso e il mesentere sono attaccati alla superficie esterna dell'intestino.
  2. Rimuovere quanto più grasso possibile per prevenire i suoi effetti negativi sul protocollo di dissociazione. Utilizzando una siringa, sciacquare delicatamente i frammenti con PBS ghiacciato sterile più volte per lavare via il contenuto intestinale e il muco. Evitare la manipolazione ruvida.
  3. Sezionare il segmento di intestino in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 1,5 ml riempito con 1 ml di PBS ghiacciato.
  4. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere delicatamente il surnatante e sostituirlo con 1 mL di BSA-DPBS ghiacciato allo 0,08%. Risospendere i frammenti di tessuto mediante delicata aspirazione utilizzando una pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio due volte.
  5. Rimuovere il surnatante e digerire i frammenti di tessuto utilizzando 1 mL del reagente di dissociazione enzimatica (950 μL di soluzione di collagenasi/dispasi e 50 μL di FBS) a bagnomaria a 37 °C per 30-60 minuti.
    1. Inoltre, aggiungere 5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL nella soluzione madre) al reagente di dissociazione se i campioni sono preparati per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
      NOTA: La concentrazione finale della miscela collagenasi/dispasi è di 1 mg/ml, compresa la collagenasi a 0,1 U/mL e la dispasi a 0,8 U/mL.
  6. Capovolgere manualmente il tubo a intervalli di 5 minuti durante il bagno d'acqua di 30-60 minuti.
    NOTA: Il tempo esatto di incubazione varia a seconda dei tessuti utilizzati. Controllare l'andamento della dissociazione al microscopio fino a quando non si vede alcun tessuto bulk. Posizionare 10 μL della sospensione cellulare su un vetrino con una pipetta ed esaminarla al microscopio. Aumentare il tempo di digestione se le cellule non sono completamente dissociate.
  7. Ruotare i tubi a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere delicatamente il reagente di dissociazione cellulare enzimatica utilizzando punte larghe. Aggiungere 1 mL di BSA-DPBS ghiacciato allo 0,08% e pipettare delicatamente le celle su e giù usando una pipetta di vetro ad ampio foro per 1 minuto.
    1. Ripetere questo passaggio due volte.
      NOTA: il pipettaggio su e giù deve essere eseguito con cura utilizzando punte a foro largo e bassa ritenzione per prevenire la rottura delle cellule.
  8. Pre-bagnare un filtro cellulare da 40 μm con BSA-DPBS allo 0,08% e posizionarlo in un tubo conico da 50 ml. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro. Picchiettare e risciacquare con un ulteriore DPBS da 200 μL e raccogliere la sospensione sul fondo del tubo.
  9. Trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 ml. Aggiungere 5 μL di DNasi I (1 U/μL) e incubare per 15 minuti a 15-20 °C. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C.
  10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di DPBS ghiacciato (Ca 2+/Mg2+ libero). Pipettare delicatamente su e giù con punte larghe per mescolare le cellule. Ripetere questo passaggio due volte.

5. Colorazione ed esame microscopico

  1. Per la colorazione, mescolare la sospensione cellulare con una soluzione di tripano blu allo 0,4% in rapporto 1: 1. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere 5-10 μL della miscela su un emocitometro ed esaminare al microscopio.
    NOTA: Le cellule vitali avranno un citoplasma non colorato, mentre le cellule morte avranno un citoplasma blu (Figura 2).
  3. Conta le cellule vitali e morte in tre diversi campi al microscopio. Calcola la percentuale di vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale di cellule in un campo.
    NOTA: La vitalità cellulare deve essere superiore all'85% e la concentrazione cellulare non deve essere inferiore a 1 x 105-1 x 107/ml. Lo sfondo della sospensione cellulare deve essere pulito, senza grumi, frammenti o impurità.

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Risultati

Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula (Figura 1). Questa ricerca mostra che il mix collagenasi/dispasi ha un buon effetto di dissociazione ed è delicato per il tessuto intestinale. La selezione dell'enzima di digestione ottimale è essenziale per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità. Nel lavoro preliminare, sono state confrontate le efficienze di di...

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Discussione

Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo. Prima della dissociazione, è necessaria la rimozione del grasso e del mesentere dall'intestino, in particolare per gli intestini di pesci carnivori con molto grasso. L'uso di una siringa invece di raschiare duramente per lavare via il contenuto intestinale riduce il danno meccanico alle cellule. Per garantire la vitalità cellulare, è anche essenziale mantenere la temperatura a 20 °C o inferiore p...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) e del Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.22-μ m Filtro SterileSolarbio Life SciencesSLGV033RBViene utilizzato per filtrare e sterilizzare la soluzione enzimatica.
40-μ Il filtroSolarbio Life SciencesF8200viene applicato per eliminare i pezzi di tessuto non digeriti.
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichSRE0098Polvere; diluire 0,04 g BSA con 100 mL 1&volte; DPBS per preparare il bffer di lavaggio BSA-DPBS allo 0,04%. Conservare a 2 - 8 °C.
Collagenase IISangon BiotechA004202Diluire con PBS a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
Collagenasi/dispasiRoche10269638-001Diluire con PBS ad una concentrazione finale di 1 mg/mL.
DispaseSigma-AldrichD4818Diluire con PBS ad una concentrazione finale di 1 mg/mL.
DNasi ISigma-AldrichAMPD1La DNasi I aiuta a ridurre l'aggregazione cellulare.
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), Ca2+/Mg2+ SolarbioLife SciencesE607009-0500Conservare a temperatura ambiente.
ElastaseSangon BiotechA600438Diluire con PBS a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL.
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000-044Serum, utilizzato al volume del 5% in soluzione di dizione.
Invertito  MicroscopioLeicaqTOWER3GViene utilizzato per esaminare la vitalità cellulare.
LiberaseRoche5401119001Diluire con PBS a una concentrazione finale di 0,25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)ProGiftAquaculture Technology Co., Ltd.NAPesce sano senza segni di malattia (peso corporeo medio: 100 g). 
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Solarbio Life SciencesP1020Conservare a temperatura ambiente.
Centrifuga refrigerataEppendorf5424Viene utilizzata per centrifugare il tessuto e le cellule.
Inibitore della RNasiNEBM0314LInibire l'attività della RNasi
Reagente RNasi in fase solidaSangon BiotechB644201-0050Viene utilizzato per rimuovere la RNasi da strumenti come forbici da dissezione e pipette di vetro. Conservare a temperatura ambiente.
Tricaina metanosolfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521Per l'eutanasia dei pesci.
Trypan BlueInvitrogenC0040Viene utilizzato per colorare le cellule morte.
TripsinaSangon BiotechE607001Diluire con PBS fino a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
cellulare

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