Il plesso coroideo (CP), un tessuto poco studiato nelle neuroscienze, svolge un ruolo chiave nella salute e nella malattia del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive una tecnica di microdissezione per isolare il CP e l'uso della microscopia elettronica a scansione per ottenere una visione d'insieme della sua struttura cellulare.
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Articolo metodologico
Visualizzazione della microscopia elettronica a scansione di microdissezione e montaggio intero del plesso coroideo del topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il plesso coroideo (CP), una struttura altamente vascolarizzata che sporge nei ventricoli del cervello, è uno dei tessuti più poco studiati nelle neuroscienze. Poiché sta diventando sempre più chiaro che questa piccola struttura svolge un ruolo cruciale nella salute e nella malattia del sistema nervoso centrale (SNC), è della massima importanza sezionare correttamente il CP dai ventricoli cerebrali in modo da consentire l'elaborazione a valle, che va dall'analisi funzionale a quella strutturale. Qui viene descritto l'isolamento del CP del topo del ventricolo cerebrale laterale e del quarto senza la necessità di strumenti o attrezzature specializzate. Questa tecnica di isolamento preserva la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all'interno del CP. A causa della sua elevata vascolarizzazione, la CP può essere visualizzata fluttuante all'interno delle cavità ventricolari del cervello utilizzando un microscopio binoculare. Tuttavia, la perfusione transcardica necessaria per l'analisi a valle può complicare l'identificazione del tessuto CP. A seconda delle ulteriori fasi di elaborazione (ad esempio, analisi dell'RNA e delle proteine), questo può essere risolto visualizzando la CP tramite perfusione transcardica con blu di bromofenolo. Dopo l'isolamento, la CP può essere elaborata utilizzando diverse tecniche, tra cui RNA, proteine o analisi di singole cellule, per ottenere ulteriori informazioni sulla funzione di questa speciale struttura cerebrale. Qui, la microscopia elettronica a scansione (SEM) su CP a montaggio intero viene utilizzata per ottenere una visione d'insieme della struttura.
Introduzione
Barriere strette separano il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia, compresa la barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera sangue-liquido cerebrospinale (CSF). Queste barriere proteggono il SNC dagli insulti esterni e garantiscono un microambiente equilibrato e controllato 1,2,3. Mentre la BBB è stata ampiamente studiata nel tempo, la barriera emato-liquorale situata nel plesso coroideo (CP) ha guadagnato solo un crescente interesse di ricerca nell'ultimo decennio. Quest'ultima barriera può essere trovata nei quattro ventricoli del cervello (Figura
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati condotti secondo la legislazione nazionale (legge belga 14/08/1986 e 22/12/2003, regio decreto belga 06/04/2010) ed europea (direttive UE 2010/63/UE, 86/609/CEE). Tutti gli esperimenti su topi e protocolli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Gand (numero di permesso LA1400091 e CE 2017-026).
1. Preparazione
- Anestetici: preparare un anestetico terminale. Ad esempio, può essere preparata una soluzione di pentobarbital di sodio (≥100 mg/kg) in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
- Soluzione di perfus....
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Risultati
Il protocollo descritto facilita l'isolamento efficiente del CP dal cervello del topo nei ventricoli laterali (Figura 2A-C) e quarti (Figura 2D-F). Dopo aver isolato l'intero cervello, le pinze vengono utilizzate per emisecare sagittalmente il cervello e identificare i CP che galleggiano nei ventricoli laterali. Il CP dal quarto ventricolo può essere isolato dal lato cerebellare del cervello. La.......
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Discussione
Qui viene descritto un metodo per isolare il plesso coroideo (CP) dal ventricolo laterale e dal quarto ventricolo di un cervello di topo. L'intero metodo di montaggio del CP facilita ulteriori analisi utilizzando un repertorio di tecniche per ottenere una visione completa della morfologia CP, della composizione cellulare, del trascrittoma, del proteoma e del secretoma. Tali analisi sono cruciali per ottenere una migliore comprensione di questa straordinaria struttura che sporge dai ventricoli del cervello. Questa conosce.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione belga per la ricerca sull'Alzheimer (SAO; numero di progetto: 20200032), dalla Fondazione di ricerca Fiandre (FWO Vlaanderen; numeri di progetto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) e dal Fondo Baillet Latour. Ringraziamo il VIB BioImaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 26G x 1/2 ago | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Supporti per campioni in alluminio | EM Sciences | 75220 | |
| Tampone in cacodilato | EM Sciences | 11652 | |
| Lame chirurgiche in acciaio al carbonio | Swann-Morton | 0210 | dimensioni: 0,45 mm x 12 mm |
| Linguette adesive in carbonio -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Essiccatore a punto critico | Bal-Tec | CPD030 | |
| Traversa 540 | Zeiss | SEM sistema | |
| Pinze | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldeide | EM Sciences | 16220 | |
| Eparina | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Pompa peristaltica digitale a 2 canali | Metrohm Belgio NV | CPA-7800160 | |
| Tetrossido di osmio | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platino | Quorum | Q150T ES | PBS senza Ca++ Mg++ o rosso fenolo; filtrato sterile |
| Pentobarbital di sodio | Kela NV | 514 | |
| Cestello per campioni Acciaio inossidabile | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stereomicroscopio Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools GmbH | Codice: 91460-11 |
Riferimenti
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.
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Ristampe e permessi
