Articolo metodologico

Esplorazione delle aberrazioni cromosomiche X nelle cellule ovariche utilizzando l'ibridazione fluorescenza in situ

DOI:

10.3791/64734

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7 aprile 2023

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1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo presenta due metodi basati sull'ibridazione fluorescenza in situ per determinare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche nel tessuto della corteccia ovarica non innestato e innestato da femmine con aberrazioni cromosomiche X.

Abstract

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Milioni di persone in tutto il mondo si occupano di questioni riguardanti la fertilità. La riduzione della fertilità, o addirittura l'infertilità, può essere dovuta a molte cause diverse, tra cui disturbi genetici, di cui le anomalie cromosomiche sono le più comuni. L'ibridazione fluorescenza in situ (FISH) è un metodo ben noto e frequentemente utilizzato per rilevare aberrazioni cromosomiche negli esseri umani. La FISH viene utilizzata principalmente per l'analisi di anomalie cromosomiche negli spermatozoi di maschi con aberrazioni cromosomiche numeriche o strutturali. Inoltre, questa tecnica viene spesso applicata anche nelle femmine per rilevare aberrazioni cromosomiche X che sono note per causare disgenesia ovarica. Tuttavia, mancano ancora informazioni sul contenuto cromosomico X delle cellule ovariche di femmine con aberrazioni cromosomiche X nei linfociti e/o nelle cellule buccali.

Lo scopo di questo studio è quello di far progredire la ricerca di base sulle aberrazioni cromosomiche X nelle femmine, presentando due metodi basati sulla FISH per identificare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche. In primo luogo, viene descritto un metodo per determinare il contenuto cromosomico X di cellule ovariche isolate (ovociti, cellule granulosa e cellule stromali) nel tessuto della corteccia ovarica non innestato da femmine con aberrazioni cromosomiche X. Il secondo metodo è diretto a valutare l'effetto delle aberrazioni cromosomiche sulla follicologenesi determinando il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche di follicoli secondari e antrali di nuova formazione nel tessuto ovarico, da femmine con aberrazioni cromosomiche X dopo innesto a lungo termine in topi immunocompromessi. Entrambi i metodi potrebbero essere utili nella ricerca futura per ottenere informazioni sul potenziale riproduttivo delle femmine con aberrazioni cromosomiche X.

Introduzione

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L'infertilità è un problema di salute del sistema riproduttivo maschile o femminile, che colpisce circa 186 milioni di individui in età riproduttiva in tutto il mondo1. In almeno il 35% delle coppie infertili, l'infertilità è causata da un disturbo del sistema riproduttivo femminile2. Ci sono molti fattori che possono causare infertilità femminile, come fattori genetici, anomalie del tratto genitale, disfunzione endocrina, malattie infiammatorie e trattamento iatrogeno3.

Le anomalie genetiche sono presenti in circa il 10% delle femmine infertili ....

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Protocollo

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Il protocollo di studio TurnerFertility è stato approvato dal Comitato centrale per la ricerca che coinvolge soggetti umani (NL57738.000.16). In questo studio, è stato ottenuto il tessuto della corteccia ovarica di 93 femmine con TS. I materiali che richiedono precauzioni di sicurezza sono elencati nella Tabella 1.

Tabella 1: Precauzioni di sicurezza.

MaterialeAzzardo
Acido aceticoGravi ustioni cut....

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Risultati

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FISH su cellule ovariche isolate prima dell'innesto
Il tessuto crioconservato della corteccia ovarica di femmine con 45,X/46,XX (paziente A) o 45,X/46,XX/47,XXX (paziente B) TS è stato utilizzato per illustrare i risultati utilizzando questo protocollo. Nel paziente A, il 50% dei linfociti aveva un cariotipo 45,X e il 50% aveva 46,XX. Nel paziente B, il 38% dei linfociti era 45,X, il 28% era 46,XX e il 34% era 47,XXX. Le sonde centromeri-specifiche per il cromosoma X (verde) e il cromosoma 18 come con.......

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Discussione

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L'analisi FISH è una tecnica ben nota per rilevare aberrazioni cromosomiche X nei linfociti o nelle cellule buccali di maschi e femmine10. Diversi studi hanno descritto la FISH su gameti di maschi con aberrazioni cromosomiche X, ma mancano ancora informazioni dettagliate ottenute dalla FISH su cellule ovariche di femmine con aberrazioni cromosomiche X14. Questo articolo presenta nuovi metodi basati sulla FISH per determinare se l'aneuploidia è presente nelle cellule ovarich.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef e Milan Intezar per la loro competenza e assistenza tecnica. Fonti di finanziamento: Merck Serono (A16-1395), Goodlife e Ferring.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoBiosolve BV0001070602BS
Centrifuga 1200Hettich Universal4140
Collagenasi ISigma131470
Vetrino coprioggettiVWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase IRoche10104159001
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
EtanoloEMSURE1009832500
Siero Fetale Bovino (FBS)Life technology10100147
Microscopio a fluorescenza per sezioni DM4 BLeica Microsystems 
Microscopio a fluorescenza A1Zeiss AXIO
Sonde marcate con fluorescenza per cellule dissociateAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Sonde marcate con fluorescenza per sezioni di tessutoAbbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
FormaldeideSigma252549
GlucosioMerck108337
Colla (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
HematoxylinSigma1159380025
Tampone di ibridazioneAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Stazione di ibridazione DakoS2451
Acido cloridricoMerck1003171000
Software di elaborazione delle immagini singole cellule della corteccia ovarica (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Software di elaborazione delle immagini su sezioni di paraffine Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Vetrini per microscopio immunoitochimicoDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
Microscopio otticoZeiss Germania
Ovest Solfato di magnesioMerckA335586
MetanoloHoneywell14262-1L
Mezzo di montaggioVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ParaffinaPoth Hile2712.20.10
PepsinaSigmaP7000-25G
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco11530546
Plastica pipettaCooperSurgical7-72-4075/1
Cloruro di potassio Merck1049361000
Proteinasi KQiagen19131
Microtomo a rotazione HM 355SBisturi termo sceintifico
Dahlhausen11.000.00.515
Vetrino per FISH su cellule dissociateThermo scientificJ1810AM1JZ
Bicarbonato di sodioSigma55761-500G
Citrato di sodio standard (SSC)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomicroscope IX 70Olympus
Target Retrieval Solution    DakoGV80511-2
TripsinaSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XileneBOOM 760518191000

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al....

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Tag

FISH AnalysisOvarian Cortex TissueChromosomal AbnormalitiesFolliculogenesisGranulosa CellsEnzymatic DigestionFluorescence Microscopy

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