Articolo metodologico

Interrogazione accoppiata cellula-specifica dell'epigenoma ovarico e del trascrittoma ovarico del topo

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 febbraio 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, il metodo di purificazione dell'affinità dei ribosomi traslanti (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) sono stati ottimizzati per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma specifici della cellula utilizzando il modello murino NuTRAP incrociato su una linea murina Cyp17a1-Cre.

Abstract

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La valutazione dei cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula è fondamentale per comprendere l'invecchiamento ovarico. A tal fine, è stata eseguita l'ottimizzazione del metodo di purificazione dell'affinità ribosomiale traslante (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) per il successivo interrogatorio accoppiato del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma cellula-specifici utilizzando un nuovo modello murino NuTRAP transgenico. L'espressione dell'allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce, il sistema di espressione NuTRAP è stato mirato alle cellule stromali utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. L'induzione del costrutto NuTRAP era specifica per i fibroblasti stromali ovarici e da una singola ovaia sono stati ottenuti DNA e RNA sufficienti per studi di sequenziamento. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con una linea Cre disponibile.

Introduzione

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Le ovaie sono i principali attori nell'invecchiamento somatico1, con contributi distinti da specifiche popolazioni cellulari. L'eterogeneità cellulare dell'ovaio rende difficile interpretare i risultati molecolari da saggi di massa dell'ovaio intero. Comprendere il ruolo di specifiche popolazioni cellulari nell'invecchiamento ovarico è la chiave per identificare i driver molecolari responsabili della fertilità e del declino della salute nelle donne anziane. Tradizionalmente, la valutazione multi-omica di specifici tipi di cellule ovariche è stata ottenuta con tecniche come la microdissezione laser2, gli approcci a singola cellula3 o la selezione cellulare4. Tuttavia, la microdissezione può essere costosa e difficile da eseguire e la selezione cellulare può alterare i profili fenotipici cellulari5.

Un nuovo approccio per valutare i profili epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula ovarica utilizza il modello murino NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosoma affinity purification). Il modello NuTRAP consente l'isolamento di acidi nucleici specifici del tipo di cellula senza la necessità di selezionare le cellule utilizzando i metodi di purificazione dell'affinità: purificazione dell'affinità ribosomiale traslante (TRAP) e isolamento di nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT)6. L'espressione dell'allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Incrociando il topo NuTRAP con una linea Cre specifica del tipo di cellula, la rimozione della cassetta STOP provoca l'etichettatura eGFP del complesso ribosomiale e la marcatura biotina/mCherry del nucleo in modo Cre-dipendente6. Le tecniche TRAP e INTACT possono quindi essere utilizzate per isolare mRNA e DNA nucleare dal tipo di cellula di interesse e procedere ad analisi trascrittomiche ed epigenomiche.

Il modello NuTRAP è stato utilizzato in diversi tessuti, come il tessuto adiposo6, il tessuto cerebrale 7,8,9 e la retina10, per rivelare cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula che potrebbero non essere rilevati nell'omogenato dell'intero tessuto. I vantaggi dell'approccio NuTRAP rispetto alle tradizionali tecniche di selezione cellulare includono quanto segue: 1) la prevenzione di artefatti di attivazione ex vivo 8, 2) la necessità ridotta al minimo di attrezzature specializzate (ad esempio, selezionatori di cellule) e 3) l'aumento della produttività e la riduzione dei costi delle analisi specifiche del tipo di cellula. Inoltre, la capacità di isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula da un singolo topo consente analisi accoppiate che aumentano il potere statistico. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce 11,12,13, abbiamo mirato il sistema di espressione NuTRAP alle cellule stromali e teca utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. Qui, dimostriamo che l'induzione del costrutto NuTRAP è specifica per le cellule stromali e teche ovariche, e DNA e RNA sufficienti per gli studi di sequenziamento sono ottenuti da una singola ovaia. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con qualsiasi linea Cre disponibile.

Per la generazione di una linea murina NuTRAP ovarica specifica per tipo cellulare, l'allele NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosome affinity purification) ha un codone STOP floxed che controlla l'espressione di BirA, peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP)-taggato mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando incrociata con una linea Cre specifica per tipo cellulare, l'espressione della cassetta NuTRAP etichetta la proteina nucleare mRANGAP1 con biotina/mCherry e la proteina ribosomiale L10a con eGFP in modo Cre-dipendente. Ciò consente l'isolamento di nuclei e mRNA da specifici tipi di cellule senza la necessità di selezionare le cellule. Ilflox/flox NuTRAP può essere abbinato a un Cre specifico per il tipo di cellula rilevante per i tipi di cellule ovariche per valutare questo.

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Protocollo

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Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). I topi genitori sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e allevati e alloggiati in condizioni SPF in un ambiente barriera HEPA su un ciclo luce/buio di 14 ore / 10 ore (luci accese alle 6:00) presso l'OMRF.

NOTA: In questa dimostrazione, usiamo un maschio Cyp17iCre+/−(Ceppo # 028547, The Jackson Laboratory) abbinato a una femmina NuTRAP (Ceppo # 029899, The Jackson Laboratory). La progenie desiderata di Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) esprimerà l'allele NuTRAP sotto il controllo del promotore Cyp17a1 nelle cellule stromali ovariche. Per questa preparazione del manoscritto, abbiamo usato topi Cyp17-NuTRAP femmina di 4 mesi (n = 4). Il DNA è stato estratto da campioni di pugni auricolari di topo per la genotipizzazione per confermare l'ereditarietà dei transgeni Cyp17iCre e NuTRAP e per il rilevamento PCR di 1) Cre generico, 2) Cyp17iCre, e 3) NuTRAP floxed utilizzando i primer elencati nella Tabella dei Materiali, come precedentemente descritto 7,8.

1. Dissezione ovarica del topo

  1. Eseguire l'eutanasia del topo secondo le linee guida sulla cura degli animali e l'approvazione dell'istituzione, seguita dalla raccolta delle ovaie.
  2. Sezionare le ovaie per rimuovere qualsiasi tessuto adiposo o parti degli ovidotti che potrebbero essere attaccati al tessuto ovarico prima di posizionare le ovaie in tubi con tampone. Procedere immediatamente alle tecniche TRAP o INTACT.
    NOTA: questo protocollo non è stato ottimizzato per l'uso con tessuto congelato. L'uso di un'ovaia dello stesso mouse per ciascuna tecnica è raccomandato per future analisi statistiche.

2. Isolamento di nuclei da specifici tipi di cellule ovariche

  1. Preparazione del buffer
    1. Tampone di purificazione nucleare (NPB): per preparare 100 mL di NPB, combinare 2 mL di 1 M HEPES (concentrazione finale: 20 mM HEPES), 0,8 mL di 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL di 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL di 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL di 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 ml di acqua priva di nucleasi. Supplemento con 1x inibitore della proteasi il giorno dell'isolamento dei nuclei.
      NOTA: NPB può essere preparato senza l'inibitore della proteasi in anticipo e dura fino a 3 settimane a 4 °C.
    2. Tampone di lisi dei nuclei (completo): Tampone di lisi dei nuclei con 1x inibitore della proteasi il giorno dell'isolamento dei nuclei.
  2. Creazione della sospensione dei nuclei
    NOTA: I campioni devono essere conservati sempre sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.
    1. Raccogliere un'ovaia da un topo Cyp17-NuTRAP (o altro Cre-NuTRAP pertinente) in 500 μL di tampone di lisi nucleica (completo). Tritare l'ovaia in otto parti all'interno del tampone usando micro forbici autoapribili.
    2. Utilizzare punte di pipette ad ampio foro per trasferire l'ovaio tritato e 500 μL di tampone di lisi in un omogeneizzatore Dounce di vetro su ghiaccio. Omogeneizzare l'ovaio 10x-20x con il pestello sciolto A. Aggiungere 400 μL di tampone di lisi all'omogeneizzatore Dounce, lavare il pestello A.
    3. Omogeneizzare l'ovaia con il pestello stretto B 10x-20x. Aggiungere 1.000 μL di tampone di lisi, lavare il pestello B. Trasferire l'omogenato (1,9 ml) in un tubo a fondo tondo da 2 ml.
    4. Centrifugare a 200 x g per 1,5 minuti a 4 °C per rimuovere il tessuto e i vasi sanguigni non dissociati14. Il surnatante contiene i nuclei; Scartare il pellet di tessuto non dissociato.
    5. Dopo aver pre-bagnato un filtro cellulare da 30 μm con 100 μL di tampone di lisi, filtrare il surnatante attraverso il filtro cellulare in un tubo conico da 15 ml. Quindi, trasferire la miscela contenente nuclei in un tubo a fondo tondo da 2 ml.
    6. Centrifugare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Il pellet contiene nuclei.
    7. Risospendere il pellet nucleare in 250 μL di tampone di lisi ghiacciato mediante vortice brevemente a velocità da moderata ad alta. Portare il volume a 1,75 ml aggiungendo 1,5 ml di tampone di lisi. Mescolare delicatamente e riposare la sospensione nucleare sul ghiaccio per 5 minuti.
    8. Pellettare i nuclei mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet nucleare. Risospendere il pellet in 200 μL di tampone ghiacciato e vortice brevemente per risospendere completamente il pellet nucleare.
    9. Riservare il 10% del pellet risospeso (20 μL) come campione di nuclei in ingresso per le analisi a valle.
    10. Prendi il pellet di nuclei risospeso e porta il volume a 2,0 ml con NPB ghiacciato. Procedere all'isolamento dei nuclei marcati utilizzando il metodo di purificazione basato sull'affinità INTACT.
  3. Isolamento di nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTATTI)
    1. Vortice le perle di streptavidina nel flaconcino per 30 s a velocità media per assicurarsi che siano completamente risospese. Aggiungere 30 μL di perline risospese per ciascun campione in una provetta a fondo tondo da 2 ml (le perle per un massimo di 10 campioni possono essere lavate in una singola provetta), aggiungere 1 mL di NPB e risospendere bene mediante pipettaggio.
    2. Posizionare il tubo sul rack magnetico per 1 minuto per separare le perline. Scartare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete. Risospendere le sfere magnetiche lavate in 1 mL di NPB.
    3. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, risospendere le sfere nel volume iniziale di NPB (30 μL per campione).
    4. Aggiungere 30 μL delle sfere lavate alla sospensione nucleare da 2 mL del punto 2.2.10. Risospendere bene la miscela di nuclei di perline pipettando e invertendo delicatamente il tubo.
    5. Posizionare i tubi su un miscelatore rotante in una cella frigorifera o in frigorifero per 30 minuti a bassa velocità. Incubare i campioni di input senza perline nelle stesse condizioni.
    6. Posizionare i tubi con la sospensione nucleare e le perle sul magnete e separare i nuclei biotinilati legati alle perle di streptavidina (frazione positiva) dalla frazione negativa dei nuclei. Lasciare che le perline si separino sul magnete per 3 minuti.
    7. Rimuovere il surnatante, passare la frazione negativa in un tubo fresco da 2,0 mL e conservare sul ghiaccio. Per ogni tubo di frazione positiva, rimuovere il tubo dal magnete e risospendere il contenuto in 1 mL di NPB.
    8. Posizionare il tubo sul magnete per 1 minuto e scartare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere la miscela di nuclei di perline lavata in 1 mL di NPB.
    9. Ripetere il punto 2.3.8 per un totale di tre lavaggi. Dopo il completamento di tre lavaggi, risospendere la miscela di nuclei di perline di frazione positiva in 30 μL di NPB.
    10. Per ogni tubo di frazione negativa, centrifugare la sospensione nucleare dal punto 2.3.7 a 500 x g per 7 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di nuclei di frazione negativa in 30 μL di NPB.
    11. Conservare i nuclei dell'ingresso (fase 2.2.9), della frazione negativa (fase 2.3.10) e della frazione positiva (fase 2.3.9) in un congelatore a -80 °C fino al momento dell'isolamento del DNA nucleare o dell'RNA.
      NOTA: I nuclei non devono essere congelati per protocolli che richiedono nuclei intatti come input (ad esempio, test per cromatina accessibile alla trasposasi, immunoprecipitazione della cromatina).

3. Isolamento di mRNA da specifici tipi di cellule ovariche

  1. Preparazione dei buffer
    1. Base tampone TRAP: preparare 100 mL di base tampone TRAP combinando 78,8 mL di acqua priva di RNasi, 5 mL di 1 M Tris-HCl (concentrazione finale: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL di 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL di 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL di NP-40 al 10% (1% NP-40). Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
    2. Base tampone salina alta: preparare 100 ml di base tampone salina alta combinando 68,8 ml di acqua priva di RNasi, 5 ml di 1 M Tris-HCl (concentrazione finale: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL di 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL di 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL di NP-40 al 10% (1% NP-40). Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
    3. Tampone di omogeneizzazione TRAP (completo): preparare 1,5 ml per campione il giorno della raccolta del tessuto. Preparare 10 mL di tampone di omogeneizzazione TRAP combinando 10 mL di base tampone TRAP (dal punto 3.1.1) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/mL cicloeximide), 10 mg di eparina sodica (1 mg/mL di eparina di sodio), 20 μL di 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL di 40 U/μL RNasi inibitore (200 U/mL RNasi inibitore), 200 μL di 0,1 M di spermidina (2 mM di spermidina) e una compressa di inibitori della proteasi privi di EDTA (1x).
    4. Tampone di lavaggio a basso contenuto di sale (completo): produrre 1,5 ml per campione il giorno della raccolta dei tessuti. Per ottenere 10 ml di tampone a basso lavaggio salino, combinare 10 mL di base tampone TRAP (dal punto 3.1.1) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide (100 μg/mL di cicloeximide) e 20 μL di 0,5 M DTT (1 mM DTT).
    5. Tampone ad alto lavaggio salino (completo): produrre 1,5 ml per campione il secondo giorno di isolamento TRAP. Per ottenere 10 mL di tampone ad alto lavaggio salino, combinare 10 mL di base tampone salino alto (dal punto 3.1.2) con 10 μL di 100 mg/mL di cicloeximide e 20 μL di 0,5 M DTT.
  2. Esecuzione della purificazione dell'affinità ribosomiale traslatoria (TRAP)
    1. Raccogliere l'altra ovaia da un topo Cyp17-NuTRAP (o altro Cre-NuTRAP pertinente) e metterlo in una provetta priva di RNasi da 1,5 mL contenente 100 μL di tampone di omogeneizzazione TRAP ghiacciato (dal punto 3.1.3). Tritare l'ovaia in otto parti all'interno del tampone usando micro forbici autoapribili.
    2. Utilizzare punte larghe per trasferire l'ovaio e 100 μL di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore Dounce di vetro. Omogeneizzare 10x-20x con il pestello sciolto A. Aggiungere 400 μL di tampone di omogeneizzazione TRAP, lavare il pestello A.
    3. Trasferire l'omogenato in un tubo a fondo tondo da 2 ml. Lavare l'omogeneizzatore Dounce con un ulteriore tampone di omogeneizzazione TRAP da 1 mL e trasferire il volume lavato nel tubo a fondo tondo da 2 ml.
    4. Centrifugare l'omogenato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante eliminato in un tubo a fondo tondo fresco da 2 ml. Scartare il pellet.
    5. Trasferire 100 μL dell'omogenato eliminato in un tubo a fondo tondo fresco da 2 mL e riservare come input su ghiaccio.
    6. Incubare il resto dell'omogenato eliminato (dal punto 3.2.4) con un anticorpo anti-GFP (5 μg/ml) per 1 ora a 4 °C mentre ruota l'estremità finale. Incubare il campione di input nelle stesse condizioni.
    7. Negli ultimi 15 minuti dell'incubazione, lavare le sfere magnetiche della proteina G nel tampone a basso contenuto di sale seguendo le seguenti fasi (3.2.8-3.2.11).
    8. Vortice la fiala di proteine G sfere magnetiche per 30 s per risospendere completamente. Trasferire 50 μL delle sfere magnetiche della proteina G per ciascun campione (fino a 10 campioni possono essere lavati in una provetta) in una provetta a fondo tondo da 2 ml.
    9. Aggiungere 500 μL di tampone a basso contenuto di sale alle perle e pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo in un supporto magnetico per 1 minuto per raccogliere le perline contro il lato del tubo. Rimuovere e scartare il surnatante.
    10. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di tampone a basso contenuto di sale al tubo. Pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo in un supporto magnetico per 1 minuto per raccogliere le perline contro il lato del tubo. Rimuovere e scartare il surnatante.
    11. Ripetere il punto 3.2.10 per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospendere le sfere nel volume iniziale di tampone a basso lavaggio salino (50 μL per campione).
    12. Trasferire le sfere lavate risospese (50 μL) nella miscela di antigene/anticorpo e incubare a 4 °C durante la notte ruotando in un miscelatore end-over-end. Incubare i campioni in ingresso ruotando end-over-end a 4 °C durante la notte per mantenere condizioni equivalenti.
    13. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere i tubi dal rotatore e separare le sfere magnetiche con i ribosomi / RNA bersaglio (frazione positiva) dal surnatante (frazione negativa) utilizzando il supporto magnetico per 2,5-3 minuti. Aspirare la frazione negativa, metterla in un tubo fresco a fondo tondo da 2 ml e metterla da parte sul ghiaccio mentre si elabora la frazione positiva.
    14. Aggiungere 500 μL di tampone ad alto lavaggio salino (dal punto 3.1.5) al tubo con la frazione positiva e pipettare delicatamente per miscelare. Posizionare il tubo su un supporto magnetico mantenuto sul ghiaccio per 1 minuto per separare le perline. Scartare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete.
    15. Ripetere il punto 3.2.14 per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, risospendere le perle in 350 μL di tampone di lisi RNA integrato con 3,5 μL di 2-mercaptoetanolo (BME). Incubare i tubi a temperatura ambiente mescolando per 10 minuti a 900 giri / min in uno shaker digitale.
    16. Separare le perle dalla soluzione che ora contiene i ribosomi/RNA bersaglio con un supporto magnetico per 1 minuto a temperatura ambiente. Raccogliere la frazione positiva eluita (supernatante) in un tubo fresco da 1,5 ml e aggiungere 350 μL di etanolo al 100%. Inverti per mescolare. Procedere all'isolamento dell'RNA.
    17. Facoltativo: per isolare l'RNA dal campione di ingresso (fase 3.2.5) e dalla frazione negativa (fase 3.2.13), trasferire 100 μL delle frazioni in ingresso e negative in provette fresche da 1,5 ml. Aggiungere 350 μL di tampone di lisi dell'RNA integrato con 3,5 μL di BME a ciascun campione. Inverti per mescolare. Aggiungere 250 μL di etanolo al 100% a ciascun tubo e capovolgere per miscelare. Procedere all'isolamento dell'RNA.
  3. Isolamento dell'RNA
    1. Trasferire 700 μL della frazione positiva e, facoltativamente, della frazione di ingresso e/o negativa su una colonna di spin di RNA. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l'RNA dalla colonna di spin.

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Risultati

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Uno schema dei protocolli TRAP e INTACT è mostrato nella Figura 1. Qui la specificità del modello murino Cyp17-NuTRAP per le cellule stromali/teca ovariche è dimostrata dall'imaging immunofluorescente e dall'RNA-Seq dall'RNA isolato con TRAP. In primo luogo, sono state eseguite l'imaging immunofluorescenza del segnale eGFP nell'ovaio e la localizzazione del segnale eGFP alle cellule tecache e stromali. In breve, sezioni di 5 μm sono state deparaffinizzate con un gradiente di xilene ed etanol...

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Discussione

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Il modello murino NuTRAP6 è un potente approccio di marcatura transgenica per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma e dell'epigenoma da specifici tipi di cellule che possono essere adattati a qualsiasi tipo di cellula con un driver Cre disponibile. Qui, dimostriamo la specificità del modello murino Cyp17-NuTRAP nel colpire la teca ovarica e le cellule stromali. Il modello Cyp17-NuTRAP può essere utilizzato per chiarire ulteriormente i meccanismi epigenetici specifici della teca e delle cell...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Questo lavoro è stato anche supportato in parte dal premio MERIT I01BX003906 e da un premio Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 dagli Stati Uniti (USA). Dipartimento degli affari dei veterani, servizio di ricerca e sviluppo del laboratorio biomedico. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Clinical Genomics Center (OMRF) e l'Imaging Core Facility (OMRF) per l'assistenza e l'utilizzo degli strumenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1 M SpermidinaSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CicloesimideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148
30 µ filtro cellulare m Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anticorpo anti-GFPAbcamAb290Per TRAP e IHC (Coniglio policlonale a GFP)
Tampone RLTQiagen79216RNA Lisi Tampone nel protocollo
cOmplete, mini, compressa di inibitore della proteasi senza EDTARoche11836170001per l'omogeneizzazione TRAP
Modello murino Buffer Cyp17iCreThe Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magneteInvitrogen12321D
Genotipizzazione PrimerIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Protocollo del laboratorio Jackson 30847, Primer: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Protocollo del laboratorio Jackson 21509, Primer: 21306, 24493, 32625, 32626
Cocktail di inibitori della proteasi Halt (100X)Thermo Scientific1861278per tampone NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 µ m diametro del perlina
MixMateEppendorf5353000529
Kit di isolamento dei nuclei: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contiene tampone di lisi dei nuclei e tampone di conservazione dei nuclei
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP modello di topoThe Jackson Laboratory29899B6; 129S6-GT(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT Formato No-Weigh ThermoScientificA39255
Proteina G DynabeadsThermoFisher10004DPer TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Eparina di sodioFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
Rotatore per tubi VWRFisher ScientificNC9854190

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
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